Législation communautaire en vigueur Document 390R2676 390R2676 Règlement (CEE) n° 2676/90 de la Commission, du 17 septembre 1990, déterminant les méthodes d'analyse communautaires applicables dans le secteur du vin Journal officiel n° L 272 du 03/10/1990 p. 0001 - 0192 Edition spéciale finnoise ...: Chapitre 3 Tome 34 p. 5 Edition spéciale suédoise ...: Chapitre 3 Tome 34 p. 5 Modifications: Repris par 294A0103(48) (JO L 001 03.01.1994 p.210) Modifié par 396R0069 (JO L 014 19.01.1996 p.13) Modifié par 397R0822 (JO L 117 07.05.1997 p.10) Modifié par 399R0761 (JO L 099 14.04.1999 p.4) Texte: RÈGLEMENT (CEE) N° 2676/90 DE LA COMMISSION du 17 septembre 1990 déterminant des méthodes d'analyse communautaires applicables dans le secteur du vin LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu le règlement (CEE) no 822/87 du Conseil, du 16 mars 1987, portant organisation commune du marché viti-vinicole (1), modifié par le règlement (CEE) n°1325/90 (2), et notamment son article 74, considérant que l'article 74 paragraphe 1 du règlement (CEE) no 822/87 prescrit l'adoption des méthodes d'analyse permettant d'établir la composition des produits visés à l'article 1er de ce règlement et les règles permettant d'établir si ces produits ont fait l'objet des traitements en violation des pratiques oenologiques autorisées; considérant que, pour autant que la Communauté n'a pas encore établi les limites chiffrées des éléments présents caractérisant l'utilisation de certaines pratiques oenologiques et des tableaux permettant la comparaison des données analytiques, il y a lieu d'autoriser les États membres à déterminer les limites; considérant que l'article 13 paragraphe 1 du règlement (CEE) no 822/87 prévoit un examen analytique portant au minimum sur les valeurs des éléments caractéristiques du v.q.p.r.d. en cause, qui figurent parmi ceux énumérés à l'annexe dudit règlement; considérant que la surveillance des indications figurant sur les documents relatifs aux produits en cause rend nécessaire l'instauration de méthodes d'analyse uniformes assurant l'obtention de données précises et comparables; que, en conséquence, ces méthodes doivent être obligatoires pour toute transaction commerciale et toute opération de contrôle et aux possibilités limitées du commerce, il convient d'admettre un nombre limité de procédés usuels permettant une détermination rapide et suffisamment sûre des éléments recherchés; considérant qu'il est utile de retenir comme méthodes, dans la mesure du possible, celles bénéficiant d'une reconnaissance générale telles que les méthodes développées dans le cadre de la Convention internationale pour l'unification des méthodes d'analyse et l'appréciation des vins de 1954 publiées par l'Office international de la vigne et du vin dans le Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins; considérant que des méthodes d'analyse communautaires applicables dans le secteur du vin ont été établies par le règlement (CEE) no 1108/82 de la Commission (3); que, compte tenu du progrès scientifique, il s'est avéré nécessaire de remplacer certaines méthodes par des méthodes plus appropriées, de modifier des méthodes et d'en introduire d'autres notamment celles qui ont été depuis lors approuvées par l'Office international de la vigne et du vin; que, en raison du grand nombre et de la complexité de ces adaptations, il convient de regrouper toutes les méthodes d'analyses dans un nouveau règlement et d'abroger le règlement (CEE) no 1108/82; considérant que, pour assurer la comparabilité des résultats obtenus en application des méthodes d'analyse visées à l'article 74 du règlement (CEE) no 822/87, il convient de se référer, en ce qui concerne la répétabilité et la reproductibilité de ces résultats, aux définitions établies par l'Office international de la vigne et du vin; considérant que, afin de tenir compte du progrès scientifique d'une part et de l'équipement technique des laboratoires officiels d'autre part et dans le but de rendre le travail de ces laboratoires plus efficace et plus rentable, il y a lieu de permettre l'application des méthodes d'analyse automatisées sous certaines conditions; qu'il importe de préciser qu'en cas de litige les méthodes automatisées ne peuvent remplacer les méthodes de référence et les méthodes usuelles; considérant que les résultats d'un mesurage de la densité par la méthode automatisée basée sur le principe d'un résonateur de flexion sont, quant à leur exactitude, leur répétabilité et leur reproductibilité, au moins égaux aux résultats obtenus par les méthodes figurant au point 1 de l'annexe du présent règlement pour mesurer la masse volumique ou la densité relative; qu'il est donc indiqué, en vertu de l'article 74 paragraphe 3 du règlement (CEE) no 822/87, de considérer cette méthode automatisée comme équivalente auxdites méthodes figurant dans l'annexe du présent règlement; considérant que le mode opératoire décrit au chapitre 25 point 2.2.3.3.2 dans l'annexe du présent règlement pour analyser la teneur en dioxyde de soufre total des vins et des moûts à une teneur présumée de moins que 50 mg/l conduit à une meilleure extraction de cette substance par rapport au mode opératoire décrit au chapitre 13 point 13.4 dans l'annexe du règlement (CEE) no 1108/82; qu'il en résulte des teneurs plus élevées en dioxyde de soufre total des produits analysés qui peuvent dépasser, notamment dans le cas de certains jus de raisins, la limite maximale prescrite; que, afin d'éviter des difficultés pour l'écoulement des jus de raisins déjà élaborés au moment de l'entrée en vigueur du présent règlement et en attendant que les procédés d'élaboration soient adaptés pour conduire à une désulfitation plus complète des moûts de raisins mutés, il y a lieu de permettre pendant une période transitoire que le mode opératoire décrit dans le règlement précité soit encore utilisé; considérant que les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité de gestion des vins, A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT: Article premier 1. Les méthodes d'analyse communautaires applicables dans le secteur du vin permettant, à l'occasion des transactions commerciales et toute opération de contrôle: - d'établir la composition des produits visés à l'article 1er du règlement (CEE) no 822/87, - d'établir si ces produits ont fait l'objet de traitements en violation des pratiques oenologiques autorisées, sont celles figurant à l'annexe du présent règlement. 2. Pour les matières pour lesquelles des méthodes de référence et des méthodes usuelles sont fixées, les résultats obtenus par l'application des méthodes de référence prévalent. Article 2 Pour l'application du présent règlement: a) la répétabilité représente la valeur au-dessous de laquelle est située, avec une probabilité spécifiée, la valeur absolue de la différence de deux résultats individuels obtenus à partir de mesures effectuées dans les mêmes conditions (même opérateur, même appareil, même laboratoire, et un court intervalle de temps); b) la reproductibilité représente la valeur au-dessous de laquelle est située, avec une probabilité spécifiée, la valeur absolue de la différence de deux résultats individuels obtenus dans des conditions différentes (opérateurs différents, appareillages différents, et/ou laboratoires différents, et/ou époques différentes). Le terme «résultat individuel» est la valeur obtenue lorsqu'on applique, une fois et complètement, la méthode d'essai normalisée sur un seul échantillon. En l'absence d'indication, la probabilité est de 95 %. Article 3 1. Des méthodes d'analyses automatisées sont admises, sous la responsabilité du directeur de laboratoire à la condition que l'exactitude, la répétabilité et la reproductibilité des résultats soient au moins équivalentes à celles des résultats obtenus par les méthodes d'analyses figurant à l'annexe. En cas de litige, les méthodes figurant à l'annexe ne peuvent pas être remplacées par les méthodes automatisées. 2. La méthode automatisée pour mesurer la densité basée sur le principe d'un résonateur de flexion est considérée comme équivalente aux méthodes figurant au point 1 de l'annexe du présent règlement. Article 4 Lorsqu'il est fait mention d'eau pour les solutions, les dilutions ou les lavages, il s'agit d'eau distillée ou d'eau déminéralisée de pureté au moins équivalente. Tous les produits chimiques doivent être de qualité analytique sauf spécifications contraires. Article 5 Le règlement (CEE) no 1108/82 est abrogé. Toutefois l'article 1er paragraphe 4 du règlement précité reste applicable jusqu'au 31 décembre 1990. Article 6 Le présent règlement entre en vigueur le jour de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes. Il est applicable à partir du 1er octobre 1990. Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre. Fait à Bruxelles, le 17 septembre 1990. Par la CommissionRay MAC SHARRYMembre de la Commission (1)JO no L 84 du 27. 3. 1987,p. 1. (2)JO no L 132 du 23. 5. 1990,p. 19. (3)JO no L 133 du 14. 5. 1982,p. 1. ANNEXE 1. MASSE VOLUMIQUE À 20 °C ET DENSITÉ RELATIVE À 20 °C 1. DÉFINITIONS La masse volumique est le quotient de la masse d'un certain volume de vin ou de moût à 20 °C par ce volume. Elle s'exprime en grammes par millilitre et son symbole est r20 °C. La densité relative à 20 °C ou densité 20 °C/20 °C est le rapport exprimé en nombre décimal, de la masse d'un certain volume de vin ou de moût à 20 °C à la masse du même volume d'eau à la même température. Son symbole est d20 °C20 °C.2. PRINCIPE DES MÉTHODES La masse volumique et la densité relative à 20 °C sont déterminées sur l'échantillon pour essai: soit par pycnométrie: méthode de référence, soit par aréométrie ou densimétrie par la balance hydrostatique: méthodes usuelles. RemarquePour les déterminations très précises, la masse volumique doit être corrigée de l'action du dioxyde de soufre. r20 °C = r220 °C 0,0006 · Sr20 °C = masse volumique corrigéer220 °C = masse volumique observéeS = dioxyde de soufre total en g/l3. TRAITEMENT PRÉALABLE DE L'ÉCHANTILLON Si le vin ou le moût contient des quantités notables de dioxyde de carbone, en chasser la plus grande quantité par agitation de 250 ml de vin dans un flacon de 1 000 ml, ou par filtration sous pression réduite sur 2 g de coton placé dans une allonge.4. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 4.1. AppareillageMatériel courant de laboratoire, et notamment: 4.1.1. Pycnomètre (1), en verre pyrex de 100 ml de capacité environ avec un thermomètre mobile à rodage émeri gradué par dixième de degré de 10 à 30 °C. Ce thermomètre doit être contrôlé (figure 1). Figure 1 Pycnomètre et son flacon tare Ce pycnomètre comporte un tube latéral de 25 mm de longueur, de 1 mm au plus de diamètre intérieur, terminé par une partie conique rodée. Ce tube latéral peut être coiffé par un «bouchon récepteur» constitué par un tube conique rodé, terminé par une partie effilée. Ce bouchon sert de chambre de dilatation. Les deux rodages de l'appareil doivent être faits avec un très grand soin. 4.1.2. Flacon tare de même volume extérieur (à moins de 1 ml près) que le pycnomètre et de masse égale à la masse du pycnomètre plein d'un liquide de densité 1,01 [solution à 2 pour 100 (m/v) de chlorure de sodium]. Enceinte calorifugée s'adaptant exactement au corps du pycnomètre. 4.1.3. Balance à deux plateaux de portée 300 g au moins, sensible au dixième de milligrammeoubalance monoplateau de portée 200 g au moins, sensible au dixième de milligramme.4.2. Étalonnage du pycnomètre L'étalonnage du pycnomètre comporte la détermination des caractéristiques suivantes:- tare à vide,- volume à 20 °C,- masse en eau à 20 °C.4.2.1. Utilisation d'une balance à deux plateaux Le flacon tare étant placé sur le plateau de gauche de la balance et le pycnomètre propre et sec muni de son «bouchon récepteur» sur le plateau droit, réaliser l'équilibre en plaçant à côté du pycnomètre des masses marquées: soit p grammes. Remplir avec soin le pycnomètre avec de l'eau distillée à la température ambiante, mettre en place le thermomètre; essuyer soigneusement le pycnomètre et le placer dans l'enceinte calorifugée; agiter par retournement jusqu'à ce que la température lue sur le thermomètre soit constante. Affleurer exactement au bord supérieur du tube latéral. Essuyer ce tube latéral, placer le bouchon récepteur; lire la température t °C avec soin et la corriger éventuellement de l'inexactitude de l'échelle du thermomètre. Peser le pycnomètre plein d'eau, soit p2 la masse en grammes qui réalise l'équilibre. Calculs (2) Tare du pycnomètre vide:Tare à vide = p + mm = masse d'air contenue dans le pycnomètrem = 0,0012 (p p2). Volume à 20 °C:V20 °C = (p + m p2) · FtFt = facteur relevé dans la table I pour la température t °CV20 °C doit être connu à ± 0,001 ml près. Masse en eau à 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = masse volumique de l'eau à 20 °C.4.2.2. Utilisation d'une balance monoplateau Déterminer:- la masse du pycnomètre propre et sec : P- la masse du pycnomètre plein d'eau à t °C : P1 en suivant les indications décrites en 4.2.1- la masse du flacon tare T0 Calculs (3) Tare du pycnomètre vide:Tare à vide : P mm = masse d'air contenue dans le pycnomètrem = 0,0012 (P1 P) Volume à 20 °C:V20 °C = [P1 (P m)] · FtFt = facteur relevé dans la table I pour la température t °C.Le volume à 20 °C doit être connu à ± 0,001 ml près. Masse en eau à 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = masse volumique de l'eau à 20 °C4.3. Technique d'une mesure (3) 4.3.1. Utilisation d'une balance à deux plateaux Peser le pycnomètre plein de l'échantillon préparé pour essais (3) en suivant les indications décrites en 4.2.1.Soit p" la masse en grammes qui réalise l'équilibre à t °C. Masse du liquide contenu dans le pycnomètre = p + m p" Masse volumique apparente à t °C: Calculer la masse volumique à 20 °C à l'aide d'une des tables de correction ci-après, suivant la nature du liquide étudié: vin sec (table II), moût naturel ou concentré (table III), vin doux (table IV). On exprime la densité 20 °C/20 °C du vin en divisant la masse volumique à 20 °C par 0,998203.4.3.2. Utilisation d'une balance monoplateau (3) Peser le flacon tare, soit T1 sa masseCalculer dT = T1 ToMasse du pycnomètre vide au moment de la mesure = P m + dT Peser le pycnomètre plein de l'échantillon préparé pour essais (3) en suivant les indications décrites en 4.2.1. Soit P2 sa masse à t °C. Masse du liquide contenu dans le pycnomètre à t °C = P2 (P m + dT) Masse volumique apparente à t °C: Calculer la masse volumique à 20 °C du liquide étudié: vin sec, moût naturel et concentré, vin doux, comme il est indiqué en 4.3.1. La densité 20 °C/20 °C est obtenue en divisant la masse volumique à 20 °C par 0,998203. 4.3.3. Répétabilité sur la masse volumique:pour les vins secs et moelleux : r = 0,00010 pour les vins doux: r = 0,00018 4.3.4. Reproductibilité sur la masse volumique:pour les vins secs et moelleux: R = 0,00037pour les vins doux: R = 0,000455. MÉTHODES USUELLES 5.1. Aréométrie 5.1.1. Appareillage 5.1.1.1. Aréomètre Les aréomètres doivent répondre aux prescriptions de l'ISO en ce qui concerne leurs dimensions et leurs graduations. Ils doivent avoir une carène cylindrique, une tige de section circulaire de 3 mm de diamètre au moins. Pour les vins secs, ils doivent être gradués de 0,983 à 1,003 par millième et cinquième de millième. Chaque millième doit être séparé par 5 mm au moins du millième suivant. Pour la mesure de la densité des vins désalcoolisés, des vins doux et des moûts, il sera fait usage d'un jeu de cinq aréomètres gradués de 1,000 1,030; 1,030 1,060; 1,060 1,090; 1,090 1,120; 1,120 1,150. Ces appareils seront gradués en masses volumiques à 20 °C par millième et demi-millième au moins, chaque millième étant séparé par 3 mm au moins du millième suivant. Ces aréomètres doivent être gradués de manière à être lus au «sommet du ménisque». L'indication de la graduation en masse volumique à 20 °C ou en densité relative à 20 °C et de la lecture au niveau du sommet du ménisque sera portée soit sur l'échelle graduée, soit sur une bande de papier incluse dans la carène. Ces appareils doivent être contrôlés par un service officiel. 5.1.1.2. Thermomètre contrôlé gradué par demi degré Celsius au moins. 5.1.1.3. Éprouvette cylindrique de 36 mm de diamètre intérieur et de 320 mm de hauteur, tenue verticalement grâce à un support à vis calantes.5.1.2. Mode opératoire Technique d'une mesure Dans l'éprouvette 5.1.1.3, placer 250 ml d'échantillon préparé pour essais (3), introduire l'aréomètre et le thermomètre. Lire le thermomètre une minute après avoir agité pour réaliser l'équilibre de température. Retirer le thermomètre et lire la masse volumique apparente à t °C sur la tige de l'aréomètre après une minute de repos. Corriger la masse volumique apparente lue à t °C de l'action de la température à l'aide de tables qui s'appliquent aux cas des vins secs (table V), des moûts (table VI) et des vins contenant du sucre (table VII). La densité 20 °C/20 °C est obtenue en divisant la masse volumique à 20 °C par 0,998203.5.2. Densimétrie par la balance hydrostatique 5.2.1. Appareillage Balance hydrostatique Balance hydrostatique, de portée maximale s'élevant au moins à 100 g, sensible à 1/10e de mg. Sous chaque plateau est fixé un flotteur en verre pyrex d'un volume d'au moins 20 ml. Ces deux flotteurs identiques sont supendus par un fil de diamètre inférieur ou égal à 0,1 mm. Le flotteur suspendu sous le plateau de droite doit pouvoir être introduit dans une éprouvette cylindrique comportant un repère de niveau. Cette éprouvette doit avoir un diamètre intérieur supérieur d'au moins 6 mm à celui du flotteur. Ce dernier doit pouvoir être contenu entièrement dans le volume de l'éprouvette situé au-dessous du repère, la surface du liquide à mesurer ne devant être traversée que par le fil de suspension. La température du liquide contenu dans l'éprouvette est mesurée par un thermomètre gradué par 1/5e de degré. Une balance hydrostatique monoplateau peut également être utilisée.5.2.2. Mode opératoire 5.2.2.1. Étalonnage d'une balance hydrostatique Les deux flotteurs étant dans l'air, établir l'équilibre en plaçant sur le plateau de droite les masses marquées p. Remplir l'éprouvette d'eau pure jusqu'au repère, lire la température t °C après agitation et repos de 2 ou 3 minutes.Rétablir l'équilibre à l'aide des masses marquées placées sur le plateau de droite soit p2 ces masses. Volume du flotteur à 20 °C:V20 °C = (p2 p) (F + 0,0012)F = facteur donné par la table I pour la température t °C. p et V20 sont les caractéristiques du flotteur.5.2.2.2. Technique d'une mesure Le flotteur de droite est plongé dans l'éprouvette remplie de vin (ou de moût) jusqu'au repère. Lire la température t °C du vin (ou du moût), soient: p" les masses marquées rétablissant l'équilibre r t °C, masse volumique apparente:Ramener cette masse volumique à 20 °C par l'emploi d'une des tables II, III ou IV.6. EXEMPLE DU CALCUL DE LA MASSE VOLUMIQUE À 20 °C ET DE LA DENSITÉ 20 °C/20 °C (MÉTHODE DE RÉFÉRENCE) 6.1. Pycnométrie sur balance à deux plateaux 6.1.1. Établissement des constantes du pycnomètre 1. Pesée du pycnomètre propre et sec:Tare = pycnomètre + p p = 104,9454 g 2. Pesée du pycnomètre plein d'eau à la température t °C:Tare = pycnomètre + eau + p2 p2 = 1,2396 g pour t = 20,5 °C 3. Calcul de la masse d'air contenue dans le pycnomètre:m = 0,0012 (p p2) m = 0,0012 (104,9454 1,2396) m = 0,1244 g 4. Caractéristiques à retenir:Tare du pycnomètre vide, p + m: p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 gVolume à 20 °C = (p + m p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698 1,2396) · 1,001900 V20 °C = 104,0275 mlMasse en eau à 20 °C = V20 °C· 0,998203 M20 °C = 103,8405 g6.1.2. Détermination de la masse volumique à 20 °C et de la densité 20 °C/20 °C d'un vin sec p" = 1,2622 à 17,80 °Cr 17,80 °C = 0,99788 g/ml La table II permet de calculer r 20 °C à partir de p t °C à l'aide de la relation: Pour t: 17,80 °C et pour un titre alcoométrique de 11 % vol., on trouve c = 0,546.2. Pycnomètrie sur balance monoplateau 6.2.1. Établissement des constantes du pycnomètre 1. Pesée du pycnomètre propre et sec:P = 67,7913 g 2. Pesée du pycnomètre plein d'eau à la température t °C:P1 = 169,2715 à 21,65 °C 3. Calcul de la masse d'air contenue dans le pycnomètre:m = 0,0012 (P1 P) m = 0,0012 · 101,4802 m = 0,1218 g 4. Caractéristiques à retenir:Tare du pycnomètre vide, P m: P m = 67,7913 0,1218 P m = 67,6695 g Volume à 20 °C = [P1 (P m)] Ft °C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715 67,6695) · 1,002140 V20 °C = 101,8194 ml Masse en eau à 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Masse du flacon tare: To To = 171,9160 g6.2.2. Détermination de la masse volumique à 20 °C et de la densité 20 °C/20 °C d'un vin sec T1 = 171,9178 g dT = 171,9178 171,9160 = 0,0018 g P m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 à 18 °Cr18 °C = 0,99793 g/ml La table II permet de calculer r 20 °C à partir de r t °C à l'aide de la relation: Pour t = 18 °C et un titre alcoométrique de 11 % vol., on trouve c = 0,49 TABLE I Facteurs Fpar lesquels il faut multiplier la masse de l'eau contenue dans le pycnomètre en pyrex à t °, pour calculer le volume du pycnomètre à 20 °C TABLE II Corrections c de température sur la masse volumique des vins secs et des vins secs débarrassés d'alcool, mesurée dans un pycnomètre en verre pyrex à t °, pour la ramener à 20 °C TABLE III Corrections c de température sur la masse volumique des moûts naturels et des moûts concentrés, mesurée à t ° à l'aide d'un pycnomètre en verre pyrex, pour ramener le résultat à 20 °C TABLE IV Corrections c de température sur la masse volumique des vins de 13 % vol. et plus contenant du sucre résiduel mesurée à l'aide d'un pycnomètre en verre pyrex, à t ° pour la ramener à 20 °C TABLE V Corrections c de température sur la masse volumique des vins secs et des vins secs débarrassés d'alcool, mesurée à l'aide d'un pycnomètre ou d'un aréomètre en verre ordinaire, à t ° pour la ramener à 20 °C TABLE VI Corrections c de température sur la masse volumique des moûts naturels et des moûts concentrés, mesurée à t° à l'aide d'un pycnomètre ou d'un aréomètre en verre ordinaire, à t ° pour la ramener à 20 °C TABLE VII Corrections c de température sur la masse volumique des vins de 13 % vol. et plus contenant du sucre résiduel mesurée à l'aide d'un aréomètre ou d'un pycnomètre en verre ordinaire, à t ° pour la ramener à 20 °C 2. ÉVALUATION DE LA TENEUR EN SUCRES DES MOÛTS, DES MOÛTS CONCENTRÉS ET DES MOÛTS CONCENTRÉS RECTIFIÉS PAR RÉFRACTOMÉTRIE 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'indice de réfraction à 20 °C, exprimé en indice absolu ou en pourcentage en masse de saccharose, est reporté dans la table correspondante pour obtenir la teneur en sucres en grammes par litre et en grammes par kilogramme des moûts, des moûts concentrés et du moût concentré rectifié.2. APPAREILLAGE 2.1. Réfractomètre du type Abbé Le réfractomètre utilisé doit être pourvu d'une échelle indiquant:- soit les pourcentages en masse de saccharose à 0,1 %,- soit les indices de réfraction avec quatre décimales. Le réfractomètre doit être pourvu d'un thermomètre dont l'échelle s'étendra au moins de + 15° C à + 25° C et d'un dispositif de circulation d'eau permettant de faire les mesures à une température de 20° C ± 5° C. Les instructions opératoires de cet instrument doivent être strictement suivies, notamment en ce qui concerne l'étalonnage et la source lumineuse.3. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON 3.1. Moûts et moûts concentrés Passer les moûts éventuellement à travers une gaze sèche pliée en quatre et, après avoir éliminé les premières gouttes de filtrat, faire la détermination sur le produit filtré.3.2. Moûts concentrés rectifiés Utiliser, selon sa concentration, soit le moût concentré rectifié, soit la solution obtenue en portant à 500 g, avec de l'eau, 200 g de moût concentré rectifié exactement pesés.4. MODE OPÉRATOIRE Amener l'échantillon à une température voisine de 20° C. Déposer une petite prise d'essai sur le prisme inférieur du réfractomètre en veillant à ce que, les prismes étant pressés l'un contre l'autre, la prise d'essai couvre uniformément la surface du verre, et effectuer la mesure conformément aux instructions opératoires de l'appareil utilisé. Lire le pourcentage en masse de saccharose à 0,1 % près ou relever l'indice de réfraction avec quatre décimales. Effectuer au moins deux déterminations sur le même échantillon préparé. Relever la température t° C.5. CALCULS 5.1. Correction de température 5.1.1. Appareils gradués en % en masse de saccharose: utiliser la table I pour la correction de température. 5.1.2. Appareils gradués en indices de réfraction; reporter l'indice mesuré à t° C dans la table II pour obtenir (colonne 1) la valeur correspondante du pourcentage en masse de saccharose à t° C. Cette valeur est corrigée de la température et exprimée à 20° C au moyen de la table I.5.2. Teneur en sucres des moûts et des moûts concentrés Reporter le pourcentage en masse de saccharose à 20° C dans la table II pour obtenir la teneur en sucres en grammes par litre et en grammes par kilogramme. La teneur en sucres est exprimée en sucre interverti avec une décimale.5.3. Teneur en sucres du moût concentré rectifié Reporter le pourcentage en masse de saccharose à 20° C dans la table III pour obtenir la teneur en sucres en grammes par litre et en grammes par kilogramme. La teneur en sucres est exprimée en sucre interverti avec une décimale. Si la mesure a été effectuée sur le moût concentré rectifié dilué, multiplier le résultat par le facteur de dilution.5.4. Indice de réfraction des moûts, des moûts concentrés et des moûts concentrés rectifiés Reporter le pourcentage en masse de saccharose à 20° C dans la table II pour obtenir l'indice de réfraction à 20° C. Cet indice est exprimé avec quatre décimales. TABLE I Correction à apporter dans le cas où le pourcentage en masse de saccharose a été déterminé à une température différente de 20° C Les variations de la température par rapport à 20° C ne doivent pas dépasser ± 5° C. TABLE II Table donnant la teneur en sucres (4) des moûts et des moûts concentrés en grammes par litre et en grammes par kilogramme, déterminée au moyen d'un réfractomètre gradué, soit en pourcentage en masse de saccharose à 20 °C, soit en indice de réfraction à 20 °C. La masse volumique à 20 °C est également donnée. TABLE III Table donnant la teneur en sucre (5) des moûts concentrés rectifiés en grammes par litre et en grammes par kilogramme, déterminée au moyen d'un réfractomètre gradué, soit en pourcentage en masse de saccharose à 20 °C, soit en indice de réfraction à 20 °C. La masse volumique à 20 °C est également donnée. 3. TITRE ALCOOMÉTRIQUE VOLUMIQUE 1. DÉFINITION Le titre alcoométrique volumique est égal au nombre de litres d'éthanol contenu dans 100 litres de vin, ces volumes étant tous deux mesurés à la température de 20 °C. Son symbole est «% vol». Remarque:Les homologues de l'éthanol, ainsi que l'éthanol et les homologues de l'éthanol engagés dans des esters éthyliques sont compris dans le titre alcoométrique, car ils se retrouvent dans le distillat.2. PRINCIPE DES MÉTHODES 2.1. Distillation du vin alcalinisé par une suspension d'hydroxyde de calcium. Détermination du titre alcoométrique sur le distillat. 2.2. Méthode de référence: détermination de la masse volumique du distillat par pycnométrie.2.3. Méthodes usuelles 2.3.1. Détermination du titre alcoométrique du distillat par aréométrie 2.3.2. Détermination du titre alcoométrique du distillat par densimétrie par la balance hydrostatique 2.3.3. Détermination du titre alcoométrique du distillat par réfractométrie Nota:Pour exprimer le titre alcoométrique à partir de la masse volumique du distillat, utiliser les tables pratiques I, II, III données dans l'annexe II à ce chapitre. Elles ont été calculées à partir de la table alcoométrique internationale publiée en 1972 par l'Organisation internationale de métrologie légale (OIML) dans sa recommandation no 22 et adoptée par l'OIV (assemblée générale de 1974).Dans la tableau I est donnée l'équation générale reliant le titre alcoométrique volumique et la masse volumique des mélanges hydroalcooliques en fonction de la température.3.OBTENTION DU DISTILLAT 3.1. Appareillage 3.1.1. Appareil de distillation comportant:- un ballon d'un litre de capacité, à rodage normalisé,- une colonne rectificatrice de 20 cm de hauteur environ ou tout dispositif destiné à empêcher le primage,- une source de chaleur: toute pyrogénation des matières extractives doit être évitée par un dispositif approprié,- un réfrigérant terminé par un tube effilé conduisant le distillat dans le fond de la fiole jaugée réceptrice contenant quelques millilitres d'eau. 3.1.2. Appareil à entraînement par la vapeur d'eau comportant:1) un générateur de vapeur d'eau;2) un barboteur;3) une colonne rectificatrice;4) un réfrigérant. Tout modèle d'appareil à distillation ou tout appareil à entraînement à la vapeur d'eau peut être utilisé à condition de répondre au test suivant: distiller 5 fois successives un mélange hydroalcoolique titrant 10 % vol. Le distillat doit présenter un titre alcoométrique d'au moins 9,9 % vol. après la cinquième distillation, c'est-à-dire qu'il ne doit pas se produire de perte d'alcool supérieure à 0,02 % vol. au cours d'une distillation.3.2. Réactifs 3.2.1. Suspension d'hydroxyde de calcium 2 M Obtenue en versant avec précaution 1 l d'eau chaude (60 à 70 °C) sur 120 g de chaux vive CaO.3.3. Préparation de l'échantillon Les vins jeunes ou mousseux sont préalablement débarrassés de la plus grande quantité de leur dioxyde de carbone par agitation de 250 à 300 ml de vin dans un flacon de 500 ml.3.4. Mode opératoire Prélever à l'aide d'une fiole jaugée un volume de vin de 200 ml. Noter la température du vin. Le verser dans le ballon de l'appareil à distiller ou dans le barboteur de l'appareil à entraînement à la vapeur d'eau. Rincer la fiole jaugée à quatre reprises avec 5 ml d'eau que l'on ajoute dans le ballon ou dans le barboteur. Ajouter 10 ml d'hydroxyde de calcium (3.2.1) et quelques fragments d'une matière poreuse inerte (pierre ponce) dans le cas de la distillation. Recueillir le distillat dans la fiole jaugée de 200 ml qui a servi à mesurer le vin. Recueillir un volume égal aux trois quarts environ du volume initial dans le cas de la distillation et recueillir 198-199 ml de distillat dans le cas de l'entraînement à la vapeur d'eau. Compléter à 200 ml avec de l'eau distillée, le distillat étant à une température identique à la température initiale à ± 2 °C près. Mélanger avec précaution, par un mouvement circulaire. Remarque:Dans le cas de vins particulièrement chargés en ions ammoniacaux, redistiller éventuellement le distillat dans les conditions décrites ci-dessus en remplaçant la suspension d'hydroxyde de calcium par 1 ml d'acide sulfurique à 10 pour 100 (v/v).4. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE Détermination du titre alcoométrique du distillat par pycnométrie.4.1. Appareillage 4.1.1. Utiliser le pycnomètre étalonné comme il est indiqué au chapitre «Masse volumique».4.2. Mode opératoire Procéder à la détermination de la masse volumique apparente à t °C du distillat (3.4) comme il est indiqué au chapitre 1 «Masse volumique» en 4.3.1 et 4.3.2; soit rt cette masse volumique.4.3. Expression des résultats 4.3.1. Mode de calcul Exprimer le titre alcoométrique à 20 °C au moyen de la table I. Sur la table, chercher sur la ligne horizontale correspondant à la température T (exprimée en nombre entier), immédiatement inférieure à t °C, la plus petite masse volumique supérieure à rt. Utiliser la différence tabulaire lue au-dessous de cette masse volumique pour calculer la masse volumique rà cette température T. Sur la ligne de cette température T chercher la masse volumique r' immédiatement supérieure à r et calculer la différence entre ces deux masses volumiques r et r'. Cette différence est divisée par la différence tabulaire lue à la droite de la masse volumique r2. Le quotient donne la partie décimale du titre alcoométrique, tandis que la partie entière de ce titre est indiquée au sommet de la colonne dans laquelle se trouve la masse volumique r'. Un exemple de calcul du titre alcoométrique est donné dans l'annexe l à ce chapitre. Remarque:Cette correction de température a été mise sur programme et peut être éventuellement effectuée automatiquement.4.3.2. Répétabilité (r) r = 0,10 % vol4.3.3. Reproductibilité (R) R = 0,19 % vol5. MÉTHODES USUELLES 5.1. Aréométrie 5.1.1. Appareillage 5.1.1.1. Alcoomètre L'alcoomètre doit répondre aux spécifications pour les appareils de la classe I ou de la classe II définies dans la recommandation internationale no 44 «Alcoomètres et aréomètres pour l'alcool» de l'OIML. 5.1.1.2. Thermomètre gradué en degrés et 1/10e de degré de 0 à 40 °C, vérifié au 1/20e de degré près. 5.1.1.3. Éprouvette cylindrique de 36 mm de diamètre et 320 mm de hauteur tenue verticalement grâce à un support à vis calantes.5.1.2. Mode opératoire Verser le distillat (3.4) dans l'éprouvette cylindrique. Tenir cette éprouvette bien verticalement. Introduire le thermomètre et l'alcoomètre. La lecture du thermomètre est faite 1 minute après avoir agité pour réaliser l'égalité de température de l'éprouvette, du thermomètre, de l'alcoomètre et du distillat. Retirer le thermomètre et lire le titre alcoométrique apparent après 1 minute de repos. Faire au moins trois lectures en s'aidant d'une loupe. Le titre apparent mesuré à t °C sera corrigé de l'action de la température à l'aide de la table II. Il faut que la température du liquide soit peu différente de la température ambiante (5 °C de différence au plus).5.2. Densimétrie par la balance hydrostatique 5.2.1. Appareillage Utiliser la balance hydrostatique comme il est indiqué au chapitre«Masse volumique».5.2.2 Mode opératoire Procéder à la détermination de la masse volumique apparente à t °C du distillat comme il est indiqué au chapitre 1 «Masse volumique» en 5.2.2.5.2.3. Expression des résultats Exprimer le titre alcoométrique à 20 °C en suivant les indications données en 4.3.1 au moyen de la table I, si le glotteur est en verre pyrex ou de la table III si le glotteur est en verre ordinaire.5.3. Réfractométrie 5.3.1. Appareillage 5.3.1.1. Réfractomètre permettant la mesure des indices de réfraction compris entre 1,330 et 1,346. Selon le type d'appareil, les mesures seront faites:- soit à 20 °C, grâce à un dispositif approprié,- soit à la température ambiante t ° C, mesurée au moyen d'un thermomètre permettant de la déterminer à 0,05 °C près au moins. Une table de correction de température sera fournie avec l'appareil.5.3.2. Mode opératoire La mesure de l'indice de réfraction est effectuée sur le distillat de vin (3.4) en suivant le mode opératoire prescrit pour le type d'appareil utilisé.5.3.3. Expression des résultats L'indice de réfraction à 20 °C est reporté dans la table IV pour obtenir le titre alcoométrique.Remarque: La table IV donne la correspondance entre les indices de réfraction des mélanges hydro-alcooliques purs et des distillats de vin. Dans le cas des distillats de vin, elle tient compte des impuretés du distillat (alcools supérieurs principalement). La présence de méthanol se traduit par une diminution de l'indice de réfraction et donc du titre alcoométrique. 6. EXEMPLE DE CALCUL DU TITRE ALCOOMÉTRIQUE D'UN VIN 6.1. Pycnométrie sur balance à deux plateaux 6.1.1. Les constantes du pycnomètre ont été déterminées et calculées comme il est indiqué au chapitre 1 (sous point 6.1.1) «Masse volumique et densité relative».6.1.2. Pesée du pycnomètre plein de distillatExemple numériquet °C = 18,90 °C Tare = pycnomètre + distillat à t °C + p"t °C corrigé = 18,70 °C p" = 2,8074 g p + m p" = masse du distillat à t °C 105,0698 2,8074 = 102,2624 g Masse volumique apparente à t °C6.1.3. Calcul du titre alcoométrique Se reporter à la table des masses volumiques apparentes des mélanges hydro-alcooliques à différentes températures, comme il est indiqué plus haut Sur la ligne 18 ° de la table des masses volumiques apparentes, la plus petite masse supérieure à la masse observée 0,983076 est 0,98398, dans la colonne 11 % La masse volumique à 18 ° est: (98307,6 + 0,7 × 22) 10 5 = 0,98323 0,98398 0,98323 = 0,00075 La partie décimale du degré alcoolique est 75/114 = 0,65 Le titre alcoométrique est: 11,65 % vol.6.2. Pycnométrie sur balance monoplateau 6.2.1 Les constantes du pycnomètre ont été déterminées et calculées au chapitre 1 «Masse volumique et densité relative» en 6.2.1. 6.2.2. Pesée du pycnomètre plein de distillat Poids du flacon tare au moment de la détermination (en grammes): T1 = 171,9178Pycnomètre plein de distillat à 20,50 °C (en grammes): P2 = 167,8438Variation de la poussée de l'air: dT = 171,9178 171,9160 = + 0,0018Masse du distillat à 20,50 °C: Lt = 167,8438 (67,6695 + 0,0018) = 100,1725Masse volumique apparente du distillat:6.2.3. Calcul du titre alcoométrique Se reporter à la table des masses volumiques apparentes des mélanges hydro-alcooliques à différentes températures, comme il est indiqué plus haut Sur la ligne 20 ° de la table des masses volumiques apparentes, la plus petite masse supérieure à la masse observée 0,983825 est 0,98471, dans la colonne 10 %. La masse volumique à 20 °C est: (98382,5 + 0,50 × 24) 10 5 = 0,983945 0,98471 0,983945 = 0,000765 La partie décimale du titre alcoom'trique est 76,5/119 = 0,64 Le titre alcoométrique est: 10,64 % vol. FORMULE PERMETTANT DE CALCULER LES TABLES ALCOOMÉTRIQUES DES MÉLANGES D'ALCOOL ÉTHYLIQUE ET D'EAULa masse volumique «r», exprimée en kilogrammes par mètre cube (kg/m³) d'un mélange d'alcool éthylique et d'eau à la température t, exprimée en degrés Celsius, est donnée par la formule suivante en fonction: - du titre massique p exprimé par un nombre décimal (6),- de la température t exprimée en degrés Celsius (E. I. P. T. 68),- des coefficients numériques ci-après: La formule est valable pour les températures comprises entre 20 °C et +40 °C. Coefficients numériques de la formule TABLE I TITRE ALCOOMÉTRIQUE INTERNATIONAL À 20 °CTable des masses volumiques apparentes des mélanges hydroalcooliques- Pycnomètre en pyrexMasses volumiques à t °, corrigées de la poussée de l'air TABLE II TITRE ALCOOMÉTRIQUE INTERNATIONAL À 20 °CTable de corrections à effectuer sur le titre alcoométrique apparent pour corriger l'action de la températureAjouter ou retrancher au titre alcoométrique apparent à t ° (alcoomètre en verre ordinaire) la correction indiquée ci-dessous TABLE III TITRE ALCOOMÉTRIQUE INTERNATIONAL À 20 °CTable des masses volumiques apparentes des mélanges hydro-alcooliques - Appareils en verre ordinaireMasses volumiques à t °C, corrigées de la poussée de l'air TABLE IV Table de correspondance entre les indices de réfraction à 20 °C et les titres alcoométriques à 20 °C des mélanges hydro-alcooliques purs et des distillats f'....... 4. EXTRAIT SEC TOTAL Matières sèches totales1. DÉFINITION L'extrait sec total ou matières sèches totales est l'ensemble de toutes les substances qui, dans des conditions physiques déterminées, ne se volatilisent pas. Ces conditions physiques doivent être fixées de telle manière que les substances composant cet extrait subissent le minimum d'altération. L'extrait non réducteur est l'extrait sec total diminué des sucres totaux. L'extrait réduit est l'extrait sec total diminué des sucres totaux excédant 1 g/l, du sulfate de potassium excédant 1 g/l, du mannitol s'il y en a, et de toutes les substances chimiques éventuellement ajoutées au vin. Le reste d'extrait est l'extrait non réducteur diminué de l'acidité fixe, exprimée en acide tartrique. L'extrait est exprimé en grammes par litre et il doit être déterminé à 0,5 g près.2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Méthode unique: méthode densimétrique. L'extrait sec total est calculé indirectement d'après la valeur de la densité du moût et, dans le cas du vin, d'après la densité du vin désalcoolisé. Cet extrait est exprimé par la quantité de saccharose qui, dissoute dans une quantité d'eau suffisante pour avoir un litre, donne une solution de même densité que le moût ou que le vin désalcoolisé. Cette quantité est donnée par la table I.3. MODE OPÉRATOIRE La densité relative d 2020 du «vin désalcoolisé» (dr) est calculée par la formule:dr = dv da+1,000où dv = densité relative du vin à 20 °C (corrigée de l'acidité volatile) (7);où da = densité relative à 20 °C du mélange hydro-alcoolique de même titre alcoométrique que le vin. On peut également calculer dr à partir des masses volumiques à 20 °C, r v du vin etr a du mélange hydro-alcoolique de même titre alcoométrique, par la formule:dr = 1,0018 (r v r a) + 1,000où le coefficient 1,0018 peut pratiquement être assimilé à 1 lorsque r v est inférieur à 1,05, ce qui est le cas le plus fréquent.4. EXPRESSION DES RÉSULTATS Reporter la densité dr2020 du vin désalcoolisé ou la densité d2020 du moût dans la table I pour obtenir le poids d'extrait sec total en grammes par litre. Le poids d'extrait sec total est exprimé en grammes par litre avec une décimale. TABLE I pour le calcul de la teneur en extrait sec total (grammes par litre) Table intercalaire 5. SUCRES RÉDUCTEURS 1. DÉFINITION Les sucres réducteurs sont constitués par l'ensemble des sucres à fonction cétonique ou aldéhydique dosés par leur action réductrice sur la solution cupro-alcaline.2. PRINCIPES DES MÉTHODES 2.1. Défécation 2.1.1. Méthode de référence: passage du vin neutralisé et désalcoolisé sur une colonne échangeuse d'anions sous forme acétate où ses anions sont échangés par les ions acétiques, suivi de la défécation par l'acétate neutre de plomb. 2.1.2. Méthodes usuelles: le vin est traité par l'un des réactifs suivants: 2.1.2.1. Acétate neutre de plomb 2.1.2.2. Hexacyanoferrate (II) de zinc2.2. Dosage 2.2.1. Méthode unique: après avoir fait réagir le vin ou le moût déféqué sur une quantité déterminée de solution cupro-alcaline, l'excès d'ions cuivriques est dosé par iodométrie.3. DÉFÉCATION Le liquide dans lequel les sucres seront dosés doit présenter une teneur en sucres comprise entre 0,5 et 5 g/l. Si le vin est sec, il faut éviter de le diluer pendant la défécation; s'il est doux, il faut le diluer tout en le défécant, de manière à amener la teneur en sucres entre ces limites, suivant le tableau ci-dessous. DénominationTeneur en sucres, en grammes par litre, comprise entreMasse volumique comprise entreDilution à prévoir (%)Moûts et mistelles>125>1,0381Vins doux vinés ou non25 et 1251,005 et 1,0384Vins moelleux5 et 250,997 et 1,00520Vins secs < 5 < 0,997pas de dilution3.1. Méthode de référence 3.1.1. Réactifs 3.1.1.1. Solution d'acide chlorhydrique (HCl), 1 M 3.1.1.2. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), 1 M 3.1.1.3. Solution d'acide acétique (CH3 COOH), 4 M 3.1.1.4.Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), 2 M 3.1.1.5. Résine échangeuse d'anions [type Dowex 3 (20-50 mesh) ou résine équivalente]. Préparation de la colonne de résine échangeuse d'anions. Au fond de la burette, placer un petit tampon de laine de verre et 15 ml de résine échangeuse d'anions (3.1.1.5). Lors de la mise en service de la résine, faire subir à la résine deux cycles complets de régénération avec passages alternés de solution M d'acide chlorhydrique (3.1.1.1) et d'hydroxyde de sodium (3.1.1.2). Après rinçage avec 50 ml d'eau distillée, transvaser la résine dans un vase cylindrique, ajouter 50 ml d'une solution M d'acide acétique (3.1.1.3) et agiter pendant 5 minutes. Remplir à nouveau la burette et faire passer à travers la colonne 100 ml de solution M d'acide acétique (3.1.1.3). (Il est préférable d'avoir un stock de la résine conservée dans un flacon rempli avec cette solution 4 M d'acide acétique). Laver la colonne avec de l'eau distillée jusqu'à ce que l'effluent soit neutre. Régénération de la résine. Faire passer 150 ml d'une solution 2 M d'hydroxyde de sodium pour éliminer les acides et une grande partie de la matière colorante fixée sur la résine. Rincer par 100 ml d'eau, faire passer 100 ml de solution 4 M d'acide acétique. Laver la colonne jusqu'à ce que l'effluent soit neutre. 3.1.1.6. Solution d'acétate neutre de plomb (approximativement saturée):Acétate neutre de plomb Pb (CH3 COO)2, 3 H2O 250 g Eau très chaude q.s.p. 500 mlAgiter jusqu'à dissolution. 3.1.1.7. Carbonate de calcium, Ca CO33.1.2. Mode opératoire 3.1.2.1. Vins secs 50 ml de vin placés dans un vase cylindrique de 10 à 12 cm de diamètre environ et additionné de ½ (n-0,5) ml d'une solution M d'hydroxyde de sodium (3.1.1.2) (n étant le volume d'une solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium utilisé pour le dosage de l'acidité totale sur 10 ml de vin) sont évaporés sur un bain d'eau bouillante en envoyant un jet d'air chaud jusqu'à ce que le liquide soit réduit à 20 ml environ. Faire écouler ce liquide à travers une colonne de résine échangeuse d'anions sous forme acétate (3.1.1.5) à raison de 3 ml toutes les 2 minutes. Recueillir l'effluent dans une fiole jaugée de 100 ml. Laver six fois le vase et la colonne avec 10 ml d'eau distillée, ajouter en agitant 2,5 ml de solution saturée d'acétate de plomb (3.1.1.6) et 0,5 g de carbonate de calcium (3.1.1.7), agiter à plusieurs reprises et abandonner au moins 15 minutes; porter au trait de jauge avec de l'eau. Filtrer. 1 ml de ce filtrat correspond à 0,5 ml de vin. 3.1.2.2. Moûts, mistelles, vins doux et vins moelleux Les dilutions ci-dessous sont données à titre indicatif. 1)Moûts et mistellesDiluer à 10 pour 100 le liquide à analyser, prélever 10 ml de cette dilution. 2) Vins doux, vinés ou non, dont la masse volumique est comprise entre 1,005 et 1,038. Prélever 20 ml de liquide à analyser préalablement dilué à 20 pour 100. 3) Vins moelleux, dont la masse volumique est comprise entre 0,997 et 1,005. Prélever 20 ml de vin non dilué.Faire écouler le volume de vin ou de moût indiqué ci-dessus à travers une colonne d'échangeur d'anions sous forme acétate à raison de 3 ml toutes les 2 minutes. Recueillir l'effluent dans une fiole jaugée de 100 ml, rincer la colonne avec de l'eau jusqu'à obtention de 90 ml environ d'effluent. Ajouter 0,5 g de carbonate de calcium, 1 ml d'acétate de plomb en solution saturée; agiter et laisser au repos pendant 15 minutes au moins en agitant de temps en temps; porter au trait de jauge avec de l'eau. Filtrer. En cas: 1) 1 ml de filtrat correspond à 0,01 ml de moût ou de mistelle;2) 1 ml de filtrat correspond à 0,04 ml de vin doux;3) 1 ml de filtrat correspond à 0,20 ml de vin moelleux.3.2. Méthodes usuelles 3.2.1. Défécation à l'acétate neutre de plomb 3.2.1.1. Réactifs Solution d'acétate neutre de plomb (approximativement saturée) (voir 3.1.1.6).Carbonate de calcium.3.2.1.2. Mode opératoire 3.2.1.2.1. Vins secs 50 ml de vin sont placés dans une fiole jaugée de 100 ml; ajouter ½ (n-0,5) ml de solution M d'hydroxyde de sodium (3.1.1.2), n étant le volume de solution 0,1 M utilisé pour doser l'acidité totale de 10 ml de vin. Ajouter en agitant 2,5 ml de solution saturée d'acétate de plomb (3.1.1.6) et 0,5 g de carbonate de calcium (3.1.1.7), agiter à plusieurs reprises et abandonner au moins 15 minutes; porter au trait de jauge avec de l'eau. Filtrer.1 ml de filtrat correspond à 0,5 ml de vin.3.2.1.2.2. Moûts, mistelles, vins doux et vins moelleux Dans une fiole jaugée de 100 ml, placer un volume de vin (ou de moûts ou de mistelles) ainsi défini, les dilutions ci-dessous étant données à titre indicatifs: 1) Moûts et mistellesDiluer à 10 pour 100 le liquide à analyser, prélever 10 ml de cette dilution. 2) Vins doux, vinés on non, dont la masse volumique est comprise entre 1,005 et 1,038. Prélever 20 ml de liquide à analyser préalablement dilué à 20 pour 100. 3)Vins moelleux, dont la masse volumique est comprise entre 0,997 et 1,005. Prélever 20 ml de vin non dilué.Ajouter 0,5 g de carbonate de calcium, 60 ml d'eau environ et 0,5 ou 1 ou 2 ml d'acétate de plomb en solution saturée; agiter et laisser au repos pendant 15 minutes au moins en agitant de temps en temps. Porter au trait de jauge avec de l'eau. Filtrer. En cas:1) 1 ml de filtrat correspond à 0,01 ml de moût ou de mistelle;2) 1 ml de filtrat correspond à 0,04 ml de vin doux;3) 1 ml de filtrat correspond à 0,20 ml de vin moelleux.3.2.2. Défécation par l'hexacyanoferrate (II) de zinc Ce procédé de défécation ne devra être utilisé que pour les vins blancs, les vins doux peu colorés et les moûts.3.2.2.1. Réactifs 3.2.2.1.1. Solution I d'hexacyanoferrate (II) de potassium Hexacyanoferrate (II) de potassium [K4 Fe (CN)6, 3H2O] 150 g Eau q.s.p. 1000 ml 3.2.2.1.2. Solution II de sulfate de zincSulfate de zinc (Zn SO4, 7 H2O) 300 g Eau q.s.p. 1000 ml3.2.2.2. Mode opératoire Dans une fiole jaugée de 100 ml, placer un volume de vin (ou de moût ou de mistelle) ainsi défini, les dilutions ci-dessous étant données à titre indicatif: 1) Moûts et mistellesDiluer à 10 pour 100 le liquide à analyser, prélever 10 ml de cette dilution. 2) Vins doux, vinés ou non, dont la masse volumique est comprise entre 1,005 et 1,038. Prélever 20 ml de liquide à analyser préalablement dilué à 20 pour 100. 3) Vins moelleux, dont la masse volumique est comprise entre 0,997 et 1,005. Prélever 20 ml de vin non dilué. 4) Vins secsPrélever 50 ml de vin non dilué.Ajouter 5 ml de solution I d'hexacyanoferrate (II) de potassium (3.2.2.1.1) et 5 ml de solution II de sulfate de zinc (3.2.2.1.2). Mélanger. Porter au trait de jauge avec de l'eau. Attendre 10 minutes Filtrer. En cas:1) 1 ml de filtrat correspond à 0,01 ml de moût ou de mistelle;2) 1 ml de filtrat correspond à 0,04 ml de vin doux;3) 1 ml de filtrat correspond à 0,20 ml de vin moelleux;4) 1 ml de filtrat correspond à 0,50 ml de vin sec. 4. DOSAGE 4.1. Réactifs 4.1.1. Solution cupro-alcalineSulfate de cuivre pur (CuSO4, 5 H2O) 25 g Acide citrique (C6 H8 O7, H2O) 50 g Carbonate de sodium cristallisé (Na2 CO3, 10 H2O) 388 g Eau q.s.p. 1000 mlDissoudre le sulfate de cuivre dans 100 ml d'eau, l'acide citrique dans 300 ml d'eau et le carbonate de sodium dans 300 à 400 ml d'eau chaude. Mélanger la solution d'acide citrique et la solution de carbonate de sodium. Ajouter ensuite la solution de sulfate de cuivre et porter au litre.4.1.2. Solution d'iodure de potassium à 30 pour 100Iodure de potassium (KI) 30 g Eau q.s.p. 100 mlConserver en flacon de verre teinté.4.1.3. Acide sulfurique à 25 pour 100Acide sulfurique pur (H2SO4)r20 = 1,84 g/ml 25 g Eau q.s.p. 100 mlVerser l'acide dans l'eau, laisser refroidir et porter à 100 ml.4.1.4.Empois d'amidon à 5 g/l Délayer 5 g d'amidon dans 500 ml d'eau environ. Porter à ébullition en agitant et maintenir l'ébullition pendant 10 minutes. Ajouter 200 g de chlorure de sodium (NaCl). Porter à 1 l après refroidissement.- Thiosulfate de sodium solution 0,1 M- Solution de sucre interverti à 5 g/l: solution à utiliser pour vérifier la technique du dosage. Dans une fiole jaugée de 200 ml, placerSaccharose pur (C12H22O11) 4,75 g Eau, environ 100 ml Acide chlorhydrique pur (HCl) r 20 = 1,16 1,19 g/ml) 5 mlPlonger la fiole dans un bain d'eau à 60 °C pendant un temps suffisant pour que la température de la solution atteigne 50 °C, température que l'on maintient durant 15 minutes. Abandonner ensuite la fiole au refroidissement spontané durant 30 minutes puis refroidir par immersion dans un bain d'eau froide. Transvaser dans une fiole jaugée de 1 l. Porter au litre. Cette solution se conserve bien durant un mois. Au moment de l'emploi neutraliser la prise d'essai (cette solution est approximativement 0,06 M acide), avec une solution d'hydroxyde de sodium.4.2. Mode opératoire Dans une fiole conique de 300 ml, placer 25 ml de solution cupro-alcaline, 15 ml d'eau et 10 ml de solution de défécation. Ce volume de solution sucrée ne doit pas contenir plus de 60 mg de sucre interverti. Ajouter quelques grains de pierre ponce. Adapter à la fiole un réfrigérant à reflux et porter à l'ébullition qui doit être atteinte en 2 minutes. Maintenir l'ébullition pendant 10 minutes exactement. Refroidir immédiatement sous un courant d'eau froide. Après refroidissement complet, ajouter 10 ml de solution d'iodure de potassium à 30 pour 100 (4.1.2), 25 ml d'acide sulfurique à 25 pour 100 (4.1.3) et 2 ml d'empois d'amidon (4.1.4). Titrer par la solution 0,1 M de thiosulfate de sodium (4.1.5). Soit n le nombre de millilitres utilisés. Par ailleurs, effectuer un dosage témoin dans lequel 10 ml d'eau distillée remplacent les 10 ml de solution sucrée. Soit n2 le volume de thiosulfate employé.4.3.Expression des résultats 4.3.1. Calculs La quantité de sucre, exprimée en sucre interverti, contenue dans la prise d'essai, est donnée dans le tableau ci-après en fonction du nombre n2 - n de millilitres de thiosulfate utilisés. Exprimer la teneur du vin en grammes de sucre interverti par litre avec une décimale en tenant compte des dilutions effectuées au cours de la défécation et du volume de la prise d'essai.4.3.2.Répétabilité r = 0,015 xjxi = concentration du sucre interverti en grammes par litre d'échantillon4.3.3. Reproductibilité R = 0,058 xixi = concentration du sucre interverti en grammes par litre d'échantillon 6. SACCHAROSE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES II. Méthode de recherche qualitative par chromatographie sur couche mince. Le saccharose est séparé des autres sucres par chromatographie sur couche mince de cellulose et révélé par le réactif urée-acide chlorhydrique à l'étuve à 105 °C. II. Méthode de recherche et de dosage par chromatographie liquide haute performance. Le saccharose est séparé sur colonne de silice greffée alkylamine et détecté par réfractométrie. La quantification se fait par rapport à un étalon externe analysé dans les mêmes conditions. Remarques:L'authenticité d'un moût ou d'un vin peut être contrôlée en appliquant méthode par RMN du deutérium décrite pour la détection de l'enrichissement des moûts, des moûts concentrés rectifiés et des vins.Pour la recherche et le dosage du saccharose la chromatographie en phase gazeuse décrite au chapitre 42 point f) peut également être utilisée.2. MÉTHODE DE RECHERCHE QUALITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE 2.1. Matériel 2.1.1. Plaques pour chromatographie recouvertes d'une couche mince de cellulose 2.1.2. Cuve à chromatographie 2.1.3. Seringue micrométrique ou micropipette 2.1.4. Étuve réglable à 105 °C ± 2 °C2.2. Réactifs 2.2.1. Charbon décolorant 2.2.2. Phase mobile: chlorure de méthylène- acide acétique (r 20 = 1,05 g/ml) - éthanol- méthanol-eau (50 : 25 : 9 : 6 : 10). 2.2.3. RévélateurUrée 5 g Acide chlorhydrique 2 M 20 ml Éthanol 100 ml 2.2.4.Solution de référenceGlucose 35 g Fructose 35 g Saccharose 0,5 g Eau q.s.p. 1000 ml2.3. Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon Lorsque le moût ou le vin est fortement coloré, le décolorer en le traitant par du charbon actif. Dans le cas du moût concentré rectifié, utiliser la solution dont la teneur en sucres est de 25 pour 100 (m/m) (25° Brix) préparée comme il est indiqué au chapitre «Détermination du pH», en 4.1.2 et la diluer au quart en portant 25 ml à 100 ml dans un ballon jaugé avec de l'eau.2.3.2. Obtention du chromatogramme À 2,5 cm du bord inférieur de la plaque déposer:- 10 µl de l'échantillon,- 10 µl de la solution de référence. Placer la plaque dans la cuve pour chromatographie saturée par les vapeurs de la phase mobile et laisser migrer le liquide jusqu'à 1 cm du bord supérieur. Retirer la plaque et la sécher sous un courant d'air chaud. Répéter deux fois la migration en séchant chaque fois la plaque. Pulvériser uniformément la plaque avec 15 ml de révélateur et la maintenir à l'étuve à 105 °C pendant 5 minutes.2.4. Résultats Le saccharose et le fructose apparaissent sous forme de taches de couleur bleu foncé sur un fond blanc; le glucose donne une tache verdâtre moins intense.3. MÉTHODE DE RECHERCHE ET DE DOSAGE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE Les conditions chromatographiques ne sont données qu'à titre indicatif.3.1. Appareils 3.1.1. Chromatographe en phase liquide haute performance équipé 1) d'un injecteur à boucle de 10 µl;2) d'un détecteur, réfractomètre différentiel ou réfractomètre interféromètre;3) d'une colonne de silice greffée alkylamine (25 mm de longueur et 4 mm de diamètre interne);4) d'une précolonne remplie de la même phase;5) d'un dispositif d'isolation ou de thermostatisation (30 °C) de l'ensemble précolonne-colonne;6) d'un enregistreur, éventuellement, d'un intégrateur;7) débit de la phase mobile: 1 ml/min.3.1.2. Dispositif de filtration sur membrane (0,45 µm)3.2. Réactifs 3.2.1. Eau bidistillée 3.2.2. Acétonitrile (CH3 CN) de qualité HPLC 3.2.3. Phase mobile: acétonitrile-eau, préalablement filtrés sur membrane (0,45 µm), (80 20, v/v).Cette phase mobile doit être dégazée avant utilisation. 3.2.4. Solution de référence:solution aqueuse de saccharose à 1,2 g/l. La filtrer sur membrane (0,45 µm).3.3. Mode opératoire 3.3.1. Préparation de l'échantillon - Cas des vins et des moûts. Filtrer sur membrane (0,45 µm).- Cas des moûts concentrés rectifiés. Utiliser la solution obtenue en diluant le moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v) comme il est indiqué au chapitre «Acidité totale» en 5.1.2 et la filtrer sur membrane (0,45 µm).3.3.2. Détermination chromatographique Injecter successivement dans le chromatographe 10 µl de la solution de référence et 10 µl de l'échantillon préparé comme indiqué en 3.3.1. Répéter ces injections dans le même ordre.Enregistrer le chromatogramme.Le temps de rétention du saccharose est voisin de 10 minutes.3.4. Calculs Utiliser pour le calcul la moyenne des deux réponses pour la solution de référence et pour l'échantillon.3.4.1. Cas des vins et des moûts Calculer la teneur en grammes par litre.3.4.2. Cas des moûts concentrés rectifiés Soit C g/l, la teneur en saccharose de la solution de moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v). Teneur en saccharose en grammes par kilogramme de moût concentré rectifié: 2,5 · C3.5. Expression des résultats La teneur en saccharose des vins, des moûts et des moûts concentrés rectifiés est exprimée en grammes par litre (vins et moûts) et en grammes par kilogramme (moûts concentrés rectifiés) avec une décimale. 7. GLUCOSE ET FRUCTOSE 1. DÉFINITION Le glucose et le fructose peuvent être dosés individuellement par une méthode enzymatique, en vue seulement du calcul du rapport glucose/fructose.2. PRINCIPE Le glucose et le fructose sont phosphorylés par l'adénosine-triphosphate (ATP) au cours d'une réaction enzymatique catalysée par l'hexokinase (HK) et donnent du glucose-6-phosphate (G6P) et du fructose-6-phosphate (F6P): glucose + ATP G6P + ADP fructose + ATP F6P + ADP Dans un premier temps le glucose-6-phosphate est oxydé en gluconate-6-phosphate par le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP) en présence de l'enzyme glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G6PDH). La quantité de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate réduite (NADPH) qui prend naissance correspond à la quantité de glucose-6-phosphate et donc à celle de glucose. G6P + NADP+ Gluconate-6-phosphate + NADPH + H+ C'est le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate réduit qui est dosé d'après son absorption à 340 nm. Lorsque cette réaction est terminée, le fructose-6-phosphate est transformé sous l'action de la phosphoglucose-isomérase (PGI) en glucose-6-phosphate Le glucose-6-phosphate réagit à nouveau avec le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate pour donner du gluconate-6-phosphate et du nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate réduit; celui-ci sera dosé.3. APPAREIL - Spectrophotomètre permettant d'effectuer la mesure à 340 nm, maximum d'absorption du NADPH. S'agissant de mesures absolues (pas de gamme d'étalonnage, mais référence au coefficient d'extinction du NADPH), les échelles des longueurs d'onde et des absorbances de l'appareil doivent être contrôlées.À défaut, utiliser un spectrophotomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm.- Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique.- Pipettes pour test enzymatique de 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml.4. RÉACTIFS 4.1. Solution 1: tampon (triéthanolamine 0,3 M; pH= 7,6; 4 10 3M en Mg2+): 11,2 g de chlorhydrate de triéthanolamine (C2H5)3N, HCl) et 0,2 g de Mg SO4, 7 H2O sont dissous dans 150 ml d'eau bidistillée, ajouter environ 4 ml de solution 5 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) pour obtenir un pH égal à 7,6 et porter à 200 ml. Cette solution tampon peut se conserver 4 semaines à + 4° C. 4.2. Solution 2:solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (environ 11,5 10 3M) : 50 mg de nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate disodique sont dissous dans 5 ml d'eau bidistillée. La solution se conserve à + 4° C durant 4 semaines. 4.3. Solution 3:solution d'adénosine-52-triphosphate (environ 81 10 3M): 250 mg d'adénosine-52-triphosphate disodique et 250 mg d'hydrogénocarbonate de sodium Na H CO3 sont dissous dans 5 ml d'eau bidistillée. Cette solution se conserve pendant 4 semaines à + 4° C. 4.4. Solution 4:Hexokinase/glucose-6-phosphate-déshydrogénase: mélanger 0,5 ml d'hexokinase (2 mg de protéine/ml soit 280 U/ml) et 0,5 ml de glucose-6-phosphate-déshydrogénase (1 mg de protéine par ml). La solution se conserve un an à + 4° C. 4.5. Solution 5: Phosphoglucose-isomérase (2 mg de protéine par ml soit 700 U/ml). La suspension est utilisée sans dilution. La solution se conserve un an à + 4° C. Remarque:L'ensemble des réactifs nécessaires pour ce dosage est commercialisé.5. MODE OPÉRATOIRE 5.1. Préparation de l'échantillon En fonction de la quantité estimée de glucose + fructose par litre, effectuer les dilutions suivantes: Mesure à 340 et 334 nm365 nmDilution avec l'eauFacteur F de dilutionJusqu'à 0,4 g/l 0,8 g/l--Jusqu'à 4,0 g/l 8,0 g/l1 + 9 10Jusqu'à 10,0 g/l20,0 g/l1 + 24 25Jusqu'à 20,0 g/l40,0 g/l1 + 49 50Jusqu'à 40,0 g/l80,0 g/l1 + 99 100Au-dessus de 40,0 g/l80,0 g/l1 + 9991 000 5.2. Dosage Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, effectuer les mesures par rapport à l'air (pas de cuve dans le trajet optique) ou par rapport à l'eau.Température 20 à 25° C.Dans 2 cuves de 1 cm de trajet optique, introduire: Témoin DosageSolution 1 (4.1) (ramenée à 20° C) 2,50 ml 2,50 ml Solution 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Solution 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Échantillon à doser 0,20 ml Eau bidistillée 0,20 ml Mélanger et après environ 3 minutes lire l'absorbance des solutions (A1). Déclencher la réaction en ajoutant:Solution 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml Mélanger; attendre 15 minutes; effectuer la mesure de l'absorbance et vérifier l'arrêt de la réaction après 2 minutes (A2). Ajouter immédiatement:Solution 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml Mélanger; effectuer la lecture au bout de 10 minutes; vérifier l'arrêt de la réaction après 2 minutes (A3). Déterminer les différences d'absorbance:A2 A1 correspondant au glucose.A3 A2 correspondant au fructose.Pour le témoin et le dosage. Déduire la différence d'absorbance du témoin (D AT) de celle du dosage (D AD) et établir:pour le glucose: D AG = D AD D ATpour le fructose: D AF = D AD D AT Remarque:Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot.5.3. Expression des résultats 5.3.1. Calcul La formule générale pour le calcul des concentrations est la suivante:V = volume du test (ml) v = volume de l'échantillon (ml) PM = masse moléculaire de la substance à doser d = trajet optique de la cuve (cm) S = coefficient d'absorption du NADPH à 340 nm = 6,3 (mmole. 1l · cm 1) V = 2,92 ml pour le dosage du glucose V = 2,94 ml pour le dosage du fructose v = 0,20 ml PM = 180 d = 1. On obtient:pour le glucose: Cg/l = 0,417 ·D AG pour le fructose: Cg/l = 0,420 · D AF Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur F. Remarque:Si les mesures ont été faites aux longueurs d'onde 334 ou 365 nm, on obtient:- mesure à 334 nm: S = 6,2 (mmole 1 · l · cm 1)pour le glucose: Cg/l = 0,425 · D AG pour le fructose: Cg/l = 0,428 · D AF- mesure à 365 nm: S = 3,4 (mmole 1 · l · cm 1)pour le glucose: Cg/l = 0,773 · D AG pour le fructose: Cg/l = 0,778 · D AF5.3.2. Répétabilité (r) r = 0,056 xi5.3.3. Reproductibilité (R) R = 0,12 + 0,076 xi xi = teneur en glucose ou fructose en grammes par litre. 8. DÉTECTION DE L'ENRICHISSEMENT DES MOÛTS DE RAISINS, DES MOÛTS DE RAISINS CONCENTRÉS, DES MOÛTS DE RAISINS CONCENTRÉ RECTIFIÉ ET DES VINS PAR APPLICATION DE LA RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE DU DEUTÉRIUM 1. DÉFINITION Les atomes de deutérium contenus dans les sucres et dans l'eau d'un moût de raisin vont être redistribués après fermentation dans les molécules I, II, III et IV du vin:CH2D CH2 OH [CH3 CHD OH] I IICH3 CH2 OD [HOD] III IV L'addition de sucres exogènes (chaptalisation) avant la fermentation du moût se répercutera sur la redistribution du deutérium. Par comparaison avec les valeurs des paramètres relatifs à un vin témoin naturel de la même région, l'enrichissement avec un sucre exogène se traduira par les variations suivantes: Paramètres Vin(D/H)I(D/H)II(D/H)QWR- Naturel - Enrichi - sucre de betterave - sucre de canne - sucre de maïs (D/H)I : rapport isotopique associé à la molécule I(D/H)II : rapport isotopique associé à la molécule II(D/H)QW : rapport isotopique de l'eau du vin. R = 2(D/H)II/(D/H)I, exprime la distribution relative du deutérium dans les molécules I et II; R est directement mesuré à partir des intensités h des signaux et alors R = 3hII/hI. (D/H)I caractérise principalement l'espèce végétale qui a synthétisé le sucre et dans une mesure moindre la géographie du lieu de récolte (nature de l'eau utilisée au cours de la photosynthèse). (D/H)II représente la climatologie du lieu de production des raisins (nature de l'eau de pluie et conditions météorologiques) et dans une mesure moindre, la concentration en sucre du moût initial. (D/H)QW représente la climatologie du lieu de production et la richesse en sucre du moût initial.2. PRINCIPE La détermination des paramètres définis ci-dessus [R, (D/H)I, (D/H)II], est effectuée par RMN du deutérium sur l'éthanol extrait du vin ou des produits de fermentation du moût, du moût concentré, du moût concentré rectifié obtenus dans des conditions données. Elle est éventuellement complétée par la détermination du rapport isotopique de l'eau extraite du vin, (D/H)QW et par la détermination du rapport isotopique 13C/12C de l'éthanol. Dans l'attente de la constitution d'une banque de données communautaires;- dans le cas des vins, les prélèvements de contrôle effectués dans les zones de production doivent être accompagnés de prélèvements d'échantillons témoins naturels (au moins trois) de même origine (lieu géographique et millésime); ces divers prélèvements sont effectués en trois exemplaires;- dans le cas des moûts, des moûts concentrés, des moûts concentrés rectifiés, les échantillons témoins (au moins 3) sont constitués par des moûts naturels de même origine (lieu géographique et millésime). Pour les contrôles des produits élaborés sur leur propre territoire et dans l'attente de la constitution d'une banque de données communautaires, les États membres peuvent, transitoirement, utiliser une banque de données nationale.3. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON POUR L'ANALYSE 3.1. Extraction de l'éthanol et de l'eau du vin Remarque:Tout dispositif d'extraction de l'éthanol peut être utilisé à la condition qu'il permette de récupérer entre 98 et 98,5 % de l'alcool du vin en un distillat qui titre entre 92 et 93 % mas. (95 % vol.)3.1.1. Matériel et réactifs - Dispositif pour extraction de l'éthanol (figure 1) comportant:- chauffe-ballon électrique avec régulateur de tension,- ballon à rodage de 1 litre,- colonne Cadiot à bande tournante (mobile en téflon),- fioles coniques à rodage de 125 ml,- flacons à bouchon plastique de 125 et 60 ml.- Réactifs pour le dosage de l'eau selon la technique de Karl Fischer (par exemple Merck 9241 et 9243).3.1.2. Mode opératoire 3.1.2.1. Déterminer le titre alcoométrique du vin à mieux que 0,05 % vol. près. Soit tv.3.1.2.2. Extraction de l'éthanol Introduire une prise d'essai homogène de 500 ml de vin de titre alcoométrique tv dans le ballon de l'appareil à distiller avec un taux de reflux constant voisin de 0,9. Mettre en place une fiole conique rodée de 125 ml préablement tarée, pour recevoir le distillat. Recueillir le liquide bouillant entre 78,0 et 78,2° C, soit environ 40 à 60 ml. Quand la température dépasse 78,5° C, arrêter le prélèvement pendant 5 minutes. Quand la température est revenue à 78° C, prélever à nouveau le distillat jusqu'à 78,5° C et répéter cette opération jusqu'à ce que la température après arrêt du prélèvement et fonctionnement en circuit fermé ne redescende plus. La distillation complète dure environ 5 heures. Cette façon de procéder permet de récupérer entre 98 et 98,5 % de l'alcool total du vin en un distillat qui titre entre 92 et 93 % mas. (95 % vol.), titre pour lequel les conditions RMN décrites au paragraphe 4 ont été établies. L'éthanol récupéré est pesé. Une prise d'essai homogène de 60 ml des queues de distillation est conservée dans un flacon de 60 ml et représente l'eau du vin. Son rapport isotopique sera éventuellement déterminé. Remarque:Si on dispose d'un spectromètre équipé d'une sonde de 10 mm (voir paragraphe 4), une prise d'essai homogène de 300 ml de vin est suffisante.3.1.2.3. Détermination du titre alcoométrique de l'alcool extrait Sur une prise d'essai voisine de 0,5 ml d'alcool, de masse p exactement connue, la teneur en eau est déterminée par la méthode de Karl Fischer, soit p2g. Figure 1 - Dispositif pour extraction de l'éthanol Le titre massique de l'éthanol est donné par3.2. Fermentation des moûts, des moûts concentrés et des moûts concentrés rectifiés 3.2.1. Matériel et réactifs - Acide tartrique.- Bacto Yeast Nitrogen, (Base without amino acids) DIFCO.- Levures sèches actives (Saccharomyces cerevisiae). Si l'on connaît le rapport isotopique de l'eau du moût, on peut réactiver les levures préalablement à l'ensemencement pendant 15 minutes, dans le minimum d'eau tiède (1 g dans 50 ml) non distillée, de rapport isotopique voisin de celui de l'eau du moût. Lorsqu'on ne connaît pas le rapport isotopique de l'eau du moût, il est préférable de l'ensemencer directement. La quantité de levures sèches à mettre en oeuvre est de l'ordre de 1 g soit environ 1010 cellules pour 1 l de moût. Récipient pour la fermentation d'une capacité de 1,5 l muni d'un dispositif permettant d'opérer à l'abri de l'air et de condenser les vapeurs d'alcool car aucune perte d'éthanol pendant la fermentation ne doit être tolérée. Le taux de conversion des sucres fermentescibles en éthanol doit être supérieur à 98 %.3.2.2. Mode opératoire 3.2.2.1. Cas des moûts - Moûts fraisPlacer 1 l de moût, dont la concentration en sucres fermentescibles a été déterminée préalablement, dans le récipient prévu pour la fermentation. Ajouter 1 g de levures sèches préalablement réactivées. Mettre en place le dispositif permettant d'opérer à l'abri de l'air. Conduire la fermentation à une température voisine de 20 °C jusqu'à épuisement des sucres. Après détermination du titre alcoométrique du produit de la fermentation et calcul du taux de conversion des sucres en alcool, le liquide fermenté est centrifugé et soumis à la distillation pour extraire l'éthanol. - Moûts mutés au dioxyde de soufreDésulfiter un volume de moût un peu supérieur à 1 l (1,2 l) par barbotage d'un courant d'azote dans le moût porté au bain-marie à 70-80 °C sous reflux jusqu'à ce que la teneur en dioxyde de soufre total soit inférieure à 200 mg/l. Veiller à ne provoquer aucune concentration du moût par évaporation de l'eau en utilisant un réfrigérant efficace.Placer 1 l de moût désulfité dans le récipient pour fermentation et continuer comme il est indiqué pour les moûts frais.Remarque:Si l'on a utilisé du métabisulfite de potassium pour sulfiter le moût, il est nécessaire d'additioner ce dernier d'acide sulfurique préalablement au désulfitage à raison de 0,25 ml d'acide sulfurique concentré (r20 = 1,84 g/ml) par gramme de métabisulfite utilisé par litre de moût.3.2.2.2. Cas des moûts concentrés Dans le récipient pour fermentation, placer un volume V ml de moût concentré contenant une quantité connue de sucres, voisine de 170 g. Compléter le volume à 1 l avec (1 000 V) ml d'eau de même rapport isotopique que l'eau du moût naturel témoin. Ensemencer ainsi qu'il est indiqué en 3.2.1. Ajouter 3 g de Bacto Yeast Nitrogen Base without amino acids DIFCO. Homogénéiser et poursuivre comme précédemment.3.2.2.3. Cas du moût de raisins concentré rectifié Procéder comme il est décrit en 3.2.2.2 en complétant au volume de 1 l avec (1 000 V) ml d'eau de même rapport isotopique que l'eau du moût naturel témoin dans lequel 3 g d'acide tartrique auront été dissous. Remarque:Réserver un volume de 50 ml d'échantillon de moût ou de moût désulfité ou de moût concentré ou de moût concentré rectifié en vue de l'extraction éventuelle de l'eau et de la détermination de son rapport isotopique (D/H)QW.L'extraction de l'eau des moûts pourra se faire très simplement par distillation azéotropique au toluène.3.3. Préparation de l'échantillon d'alcool pour la mesure RMN 3.3.1. Réactifs N,N-tétraméthylurée (TMU); utiliser un échantillon de TMU de référence de rapport isotopique D/H donné et contrôlé. Cet échantillon peut être fourni par:Direction générale «Science, recherche et développement» Bureau communautaire de référence Rue de la Loi 200 B-1049 Bruxelles3.3.2. Mode opératoire - Sonde RMN de 15 mm de diamètre:Dans un flacon préalablement taré, prélever 7 ml d'alcool obtenu en 3.1.2 et le peser à 0,1 mg près, soit mA; introduire ensuite 3 ml du standard interne (TMU) et peser à 0,1 mg près, soit mst. Homogénéiser le mélange par agitation. - Sonde RMN de 10 mm de diamètre:3,2 ml d'alcool et 1,3 ml de TMU suffisent. Selon les types de spectromètre et de sonde utilisés (voir paragraphe 4), ajouter une quantité suffisante d'hexafluorobenzène comme substance de stabilisation champ-fréquence (lock). SpectromètreSonde10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T 35 µl 50 µl 3.4. Préparation de l'échantillon d'eau pour la mesure RMN, en vue de la détermination éventuelle de son rapport isotopique3.4.1. Réactifs N,N-tétraméthylurée (TMU): voir 3.3.1. 3.4.2. Mode opératoire Dans un flacon taré, introduire 3 ml d'eau obtenue en 3.1.2 ou en 3.2 (remarque); les peser à 0,1 mg près, soit m2E; ajouter ensuite 4 ml du standard interne (TMU) et les peser à 0,1 mg près, soit m2st. Homogénéiser par agitation. Remarque:Si le laboratoire dispose d'un spectromètre de masse de rapports isotopiques cette mesure pourra être effectuée sur cet instrument pour alléger la charge du spectromètre RMN. Il est en effet nécessaire d'étalonner le rapport TIV (5.2) pour chaque série de vins étudiée.4. ENREGISTREMENT DES SPECTRES RMN ²H DE L'ALCOOL ET DE L'EAU Détermination des paramètres isotopiques.4.1. Matériel - Spectromètre RMN muni d'une sonde spécifique «deutérium» accordée à la fréquence o caractéristique, du champ Bo (par exemple, pour Bo = 7,05 T, o = 46,05 MHz et pour Bo = 9,4 T, o = 61,4 MHz), possédant un canal de découplage du proton B2 et un canal de stabilisation champ-fréquence (lock) à la fréquence du fluor. La résolution, mesurée sur le spectre, transformé sans multiplication exponentielle (c'est-à-dire LB = 0) (figure 2b) et exprimée par la largeur à mi-hauteur des signaux méthyle et méthylène de l'éthanol et du signal méthyle du TMU, doit être inférieure à 0,5 Hz.La sensibilité mesurée avec un facteur de multiplication exponentielle LB égal à 2 (figure 2a) doit être supérieure ou égale à 150 pour le signal méthyle de l'éthanol titrant 95 % vol. (93,5 % mas.) Dans ces conditions, l'intervalle de confiance sur la mesure de la hauteur du signal, calculé pour une probabilité de 97,5 % (test à 1 aile) et 10 répétitions du spectre, est de 0,35 %.- Changeur automatique d'échantillons (éventuellement).- Logiciel de traitement des données.- Tubes échantillons de 15 mm ou de 10 mm selon les performances du spectromètre.4.2. Réglages du spectromètre et vérifications 4.2.1. Réglages Procéder aux réglages habituels d'homogénéité et de sensibilité selon les indications du constructeur.4.2.2. Vérification de la validité des réglages Utiliser des éthanols de référence, désignés par les lettres C (éthanol de canne à sucre), V (éthanol de vin) et B (éthanol de betterave), présentant une teneur isotopique différente mais précisément étalonnés. Ils signifient C: alcool de canne à sucre ou de maïs; V: alcool de vin et B: alcool de betterave. Ces échantillons sont fournis par le Bureau communautaire de référence. En suivant le mode opératoire décrit en 4.3, déterminer les valeurs isotopiques de ces alcools en notant Cmes, Vmes, Bmes (voir 5.3). Les comparer aux valeurs de référence correspondantes, désignées en notant en indice supérieur Cst, Bst, Vst (voir 5.3). Figure 2aSpectre RMN²H d'un éthanol de vin avec une référence interne (TMU: N,N-tétraméthylurée) Figure 2bSpectre²H de l'éthanol réalisé dans les mêmes conditions que celles de la figure 2a, mais sans multiplication exponentielle (LB = 0) L'écart-type de répétabilité obtenu sur la moyenne de 10 répétitions de chaque spectre doit être inférieur à 0,01 sur le rapport R et inférieur à 0,3 ppm sur (D/H)I et sur (D/H)II. Les valeurs moyennes obtenues pour les différents paramètres isotopiques [R, (D/H)I, (D/H)II] doivent se situer dans l'écart-type de répétabilité correspondant, donné, pour ces paramètres pour les trois alcools de référence, par le Bureau communautaire de référence. Sinon reprendre les réglages.4.3. Conditions d'acquisition des spectres RMN Placer l'échantillon d'alcool préparé en 3.3 (ou l'échantillon d'eau, préparé en 3.4) dans un tube de 15 ou de 10 mm et l'introduire dans la sonde. Les conditions d'acquisition des spectres RMN sont les suivantes:- La température de la sonde (par exemple 302 K) doit être constante.- Temps d'acquisition de 6,8 s au moins pour 1200 Hz de largeur spectrale (Mémoire 16 K), c'est-à-dire environ 20 ppm à 61.4 MHz ou 27 ppm à 46.1 MHz.- Impulsion: 90 °.- Régler le délai à l'acquisition; sa valeur doit être du même ordre de grandeur que le temps d'échantillonage (dwell time).- Détection en quadrature: fixer l'«offset» 01 entre les signaux - OD et - CHD pour l'éthanol et entre les signaux HOD et TMU pour l'eau.- Déterminer la valeur de l'offset de découplage 02 à partir du spectre protonique mesuré par la bobine de découplage sur le même tube. Un bon découplage est obtenu quand 02 est situé au milieu de l'intervalle de fréquence existant entre les groupes CH3 et -CH2 . Utiliser le mode de découplage par large bande. Effectuer pour chaque spectre un nombre NS d'accumulations suffisant pour obtenir le rapport signal-sur-bruit donné en paragraphe 4-1 et répéter NE = 10 fois cette série de NS accumulations. Les valeurs de NS dépendent des types de spectromètre et de sonde utilisés (voir paragraphe 4) et on choisira par exemple: SpectromètreSonde10 mm15 mm7,05 TNS = 304NS = 2009,04 TNS = 200NS = 128 5.EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Cas de l'éthanol Pour chacun des 10 spectres (voir spectre RMN de l'éthanol, figure 2a), déterminer:- CH3CHDOH mst et mA voir 3.3.2.- tDm voir 3.1.2.3.- (D/H)st = rapport isotopique du standard interne (TMU) indiqué sur le flacon fourni par le Bureau communautaire de référence. L'utilisation des hauteurs de signaux au lieu des surfaces mesurables avec moins de précision suppose des largeurs de raies à mi-hauteurs égales ce qui est une approximation raisonnable (figure 2b).5.2. Cas de l'eau Quand le rapport isotopique de l'eau est déterminé par RMN, à partir du mélange eau-TMU, on utilise la relation suivante:avec- m2st et m2E voir 3.4.2.- (D/H)st = rapport isotopique du standard interne (TMU) indiqué sur le flacon fourni par le Bureau communautaire de référence (BCR). 5.3. Pour chacun des paramètres isotopiques, calculer la moyenne des 10 déterminations et l'intervalle de confiance. Un logiciel optionnel (par exemple RMN-FINS) adaptable sur le calculateur du spectromètre permet d'effectuer ces calculs en ligne. Remarque:Si, après le réglage du spectromètre, il y a un écart systématique entre les valeurs moyennes obtenues pour les caractéristiques isotopiques des alcools de référence (4.2.2) et les valeurs indiquées par le Bureau communautaire de référence, à l'écart-type près, on pourra appliquer la correction suivante pour retrouver la vraie valeur d'un échantillon X quelconque. L'interpolation sera effectuée en prenant les valeurs des échantillons de référence qui encadrent celle de l'échantillon X. Soit (D/H)iXmes la valeur mesurée et (D/H)iXcorr la valeur corrigée, on a:(D/H)iXcorr = (D/H)iBst + a [ (D/H)iXmes (D/H)iBmes ] Exemple:Échantillons de référence fournis et étalonnés par le Bureau communautaire de référence:(D/H)IVst = 102,0 ppm (D/H)IBst = 91,95 ppmÉchantillons de référence mesurés par le laboratoire:(D/H)IVmes = 102,8 ppm (D/H)IBmes = 93,0 ppmÉchantillon suspect non corrigé:(D/H)IXmes = 100,2 ppmOn calcule a = 1,0255 et (D/H)IXcorr = 99,3 ppm6. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Comparer la valeur RX obtenue pour le rapport R de l'échantillon suspect aux rapports obtenus pour les vins témoins. Si RX s'écarte de plus de 2 écarts-type de la valeur moyenne RT obtenue pour les vins témoins, il y a présomption d'adultération.6.1. Enrichissement par du sucre de betterave ou du sucre de canne ou du glucose de maïs 6.1.1. Cas de vins RX supérieur à RT: présomption d'addition de sucre de betterave. RX inférieur à RT: présomption d'addition de sucre de canne ou de sucre de maïs.Noter que (D/H)XII et (D/H)WQX sont augmentés.Examiner (D/H)IX. Il y a présomption de:- Enrichissement au sucre de betterave:(D/H)IX de l'échantillon suspect est inférieur à (D/H)IT, valeur moyenne obtenue avec les échantillons témoins, de plus de 1 écart-type.- Enrichissement au sucre de canne ou au sucre de maïs: (D/H)IX es supérieur à (D/H)IT, de plus de 1 écart-type.- Calcul de l'enrichissement, E, exprimé en % vol. d'éthanol:- Cas d'un enrichissement au sucre de betterave:(D/H)IB rapport isotopique pour le site I de l'alcool de betterave: (D/H)IB = 92.5 (8).tV = titre alcoométrique du vin analysé (X)- Cas d'un enrichissement au sucre de canne ou de maïs:(D/H)IC = rapport isotopique pour le site I de l'alcool de canne à sucre ou de maïs: (D/H)IC = 110.5 (9).tV = titre alcoométrique du vin analysé (X).6.1.2. Cas des moûts, des moûts concentrés et des moûts concentrés rectifiés Les valeurs des paramètres isotopiques de l'alcool extrait comme indiqué en 3.1 du produit fermenté obtenu (3.2) à partir du moût, du moût, concentré et du moût concentré rectifié sont examinés selon les prescriptions données en 6 «Interprétation des résultats», point 6.1.1, comparativement à l'alcool extrait du produit de fermentation des moûts naturels témoins. L'enrichissement, E % vol., exprime le volume d'alcool apporté au produit fermenté. Connaissant la dilution éventuelle effectuée avant la fermentation (moûts concentrés et moûts concentrés rectifiés), en admettant que 16,83 g de sucre donnent 1 % vol. d'alcool, calculer la quantité en masse de sucre ajouté par litre de moût, de moût concentré ou de moût concentré rectifié.6.2. Enrichissement par un mélange de sucre de betterave et de sucre de canne ou de glucose de maïs Les rapports isotopiques (D/H)I et R sont moins modifiés que dans le cas de l'enrichissement avec 1 seul type de sucre. (D/H)II est augmenté ainsi que (D/H)WQ.La confirmation de ces additions peut être faite par la détermination du rapport13C/12C de l'éthanol par spectrométrie masse; ce rapport est augmenté dans ce cas. 9. CENDRES 1. DÉFINITION On appelle cendres l'ensemble des produits de l'incinération du résidu d'évaporation du vin, conduite de façon à obtenir la totalité des cations (ammonium exclu) sous forme de carbonates et autres sels minéraux anhydres.2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Incinération de l'extrait du vin conduite entre 500 °C et 550 °C jusqu'à combustion complète du carbone.3. APPAREILLAGE 3.1. Bain d'eau à 100 °C. 3.2. Balance sensible au 1/10e de milligramme. 3.3. Plaque chauffante ou évaporateur à infra-rouge. 3.4. Four électrique à régulation de température. 3.5. Dessiccateur. 3.6. Capsule de platine de 70 mm de diamètre et de 25 mm de hauteur à fond plat.4. MODE OPÉRATOIRE Placer 20 ml de vin dans la capsule de platine préalablement tarée (Po g). Évaporer sur bain d'eau à 100 °C, chauffer le résidu sur la plaque chauffante à 200 °C ou sous l'évaporateur à infra-rouge jusqu'à carbonisation. Lorsque le résidu n'émet plus de vapeur, placer la capsule dans le four électrique porté à 525 °C ± 25 °C. Après 15 minutes de carbonisation, retirer la capsule du four, ajouter 5 ml d'eau distillée que l'on évapore ensuite sur le bain d'eau ou sous l'évaporateur à infra-rouge et chauffer à nouveau à 525 °C pendant une dizaine de minutes. Si la combustion des particules carbonées n'est pas totale, recommencer les opérations de lavage des particules carbonées, d'évaporation de l'eau et d'incinération. Pour les vins riches en sucres, il est commode d'ajouter à l'extrait quelques gouttes d'huile végétale pure avant la première incinération, pour empêcher le débordement du contenu. Après refroidissement dans le dessicateur, la capsule est pesée, soit P1 g. Le poids de cendres correspondant à la prise d'essai (20 ml) est: p = (P1 Po) g.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS Mode de calcul Le poids P des cendres exprimé en grammes par litre avec 2 décimales sera: P = 50 · p 10. ALCALINITÉ DES CENDRES 1. DÉFINITION On appelle alcalinité des cendres la somme des cations, autres que l'ammonium, combinés aux acides organiques du vin.2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Titrimétrie en présence de méthylorange sur les cendres solubilisées à chaud par un excès connu d'acide titré.3. RÉACTIFS ET MATÉRIEL 3.1. Solution 0,05 M d'acide sulfurique (H2SO4) 3.2. Solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) 3.3. Solution de méthylorange à 0,1 g pour 100 ml dans l'eau distillée 3.4. Bain d'eau à 100 °C. 4. MODE OPÉRATOIRE Dans la capsule de platine contenant les cendres de 20 ml de vin ajouter 10 ml de solution 0,05 M d'acide sulfurique (3.1); la placer sur un bain d'eau à 100 °C pendant 15 minutes environ, en écrasant le résidu avec une baguette de verre pour activer la dissolution. Ajouter ensuite II gouttes de solution de méthylorange et titrer l'excès d'acide sulfurique par la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2) jusqu'à virage au jaune de l'indicateur. 5. EXPRESSION DES RÉSULTATS Mode de calcul L'alcalinité des cendres exprimée en milliéquivalents par litre, avec 1 décimale sera: A = 5 (10-n)n = nombre de millilitres d'hydroxyde de sodium 0,1 M. 11. CHLORURES 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Les chlorures sont dosés directement dans le vin par potentiométrie en utilisant l'électrode Ag/AgCl.2. APPAREILLAGE 2.1. pH mètre millivoltmètre gradué au moins de 2 en 2 mV. 2.2. Agitateur magnétique. 2.3. Électrode Ag/AgCl, avec une solution saturée de nitrate de potassium comme électrolyte. 2.4. Microburette graduée au 1/100e de ml. 2.5. Chronomètre.3. RÉACTIFS 3.1. Solution étalon de chlorures; 2,1027 g de chlorure de potassium, KCl (max. 0,005 % Br), desséchés avant l'emploi par conservation durant quelques jours dans un dessiccateur, sont dissous dans de l'eau distillée; porter au litre: 1 ml de cette solution contient 1 mg de Cl . 3.2. Solution titrée de nitrate d'argent: 4,7912 g de nitrate d'argent, AgNO3, pour analyse, sont dissous et portés au litre dans une solution alcoolique à 10 pour 100 (v/v): 1 ml de cette solution correspond à 1 mg de Cl . 3.3. Acide nitrique pur au moins à 65 pour 100 (r20 = 1,40 g/ml).4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. 5,0 ml de solution étalon de chlorures sont introduits dans un vase cylindrique de 150 ml placé sur un agitateur magnétique, dilués à 100 ml environ avec de l'eau distillée et acidifiés avec 1,0 ml d'acide nitrique à 65 pour 100 au minimum. Après plongée de l'électrode, titrer en ajoutant à la microburette la solution titrée de nitrate d'argent, l'agitation étant modérée. Les additions effectuées sont d'abord de 1,00 ml pour les quatre premiers millilitres, lire les valeurs en millivolts correspondantes. Puis ajouter les 2 ml suivants par fractions de 0,20 ml. Enfin reprendre les additions par fractions de 1 ml jusqu'à ce qu'on ait versé 10 ml au total. Après chaque addition attendre environ 30 secondes avant d'effectuer la lecture des millivolts correspondants. Porter les valeurs obtenues sur un papier millimétré, en fonction des millilitres de solution titrée correspondants et déterminer le potentiel du point équivalent d'après le point singulier de la courbe obtenue. 4.2. 5 ml de la solution étalon de chlorures sont introduits dans un vase cylindrique de 150 ml ainsi que 95 ml d'eau distillée et 1 ml d'acide nitrique à 65 pour 100 au minimum. Plonger l'électrode et titrer en agitant jusqu'à obtention du potentiel du point équivalent. Cette détermination est répétée jusqu'à ce que l'on ait obtenu une bonne concordance des résultats. Il faut effectuer ce contrôle avant chaque série de dosages de chlorures dans les échantillons. 4.3. 50 ml de vin à analyser sont introduits dans un vase cylindrique de 150 ml. Ajouter 50 ml d'eau distillée et 1 ml d'acide nitrique à au moins 65 pour 100 et titrer suivant le procédé indiqué en 4.2.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Calculs Si n représente le nombre de millilitres de solution titrée de nitrate d'argent, la teneur en chlorure du liquide étudié est: 20 × n exprimée en milligrammes de Cl par litre;0,5633 × n exprimée en milliéquivalents par litre;32,9 × n exprimée en milligrammes de chlorure de sodium par litre.5.2. Répétabilité (r) r = 1,2 mg de Cl par litrer = 0,03 mé/lr = 2,0 mg NaCl/l.5.3. Reproductibilité (R) R = 4,1 mg de Cl par litreR = 0,12 mé/lR = 6,8 mg NaCl/l.6. Remarque: Dosage très précis On se réfère à la courbe de titration complète obtenue au cours du dosage du liquide étudié par la solution de nitrate d'argent. a) Placer 50 ml de vin à analyser dans un vase cylindrique de 150 ml. Ajouter 50 ml d'eau distillée et 1 ml d'acide nitrique à au moins 65 pour 100. Titrer au moyen de la solution de nitrate d'argent, en procédant à des additions de 0,5 ml pour lesquelles on relève le potentiel en millivolts correspondant. Déduire de ce premier titrage le volume approximatif de solution de nitrate d'argent nécessaire. b) Recommencer le dosage dans les mêmes conditions. Procéder tout d'abord à des additions de 0,5 ml de solution titrante jusqu'à ce que le volume versé soit inférieur de 1,5 à 2 ml au volume déterminé en a). Procéder alors à des additions de 0,2 ml; continuer les affusions au-delà du point équivalent approximativement repéré, d'une manière symétrique, par addition de 0,2 ml, puis de 0,5 ml. Le point final du dosage et le volume de solution de nitrate d'argent exactement consommé est obtenu:- soit en traçant la courbe et en déterminant le point équivalent;- soit par le calcul:avecV = volume de solution titrée au point équivalent;V2 = volume de solution titrée avant le plus grand saut de potentiel.D Vi = volume constant des fractions de solution titrée ajouté, soit 0,2 ml;DD E1 = différence de potentiel seconde avant la plus grande variation du potentiel;DD E2 = différence de potentiel seconde après la plus grande variation du potentiel. Exemple: Volume de solution titrée de AgNO3Potentiel E en mVDifférence D EDifférence seconde DD E0 204 4 0,2208 0 4 0,4212 2 6 0,6218 0 6 0,8224 0 6 1,0230 2 8 1,2238 4 12 1,4250 10 22 1,6272 22 44 1,8316 10 34 2,0350 8 26 2,2376 6 20 2,4396 Dans cet exemple, le point final du titrage se situe entre 1,6 et 1,8 ml: car c'est dans cet intervalle qu'apparaît le plus grand saut de potentiel (D E = 44 mV). Le volume de solution titrée de nitrate d'argent consommé pour doser les chlorures dans la prise d'essai est: 12. SULFATES 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence Précipitation du sulfate de baryum et pesée. Le phosphate de baryum précipité dans les mêmes conditions est éliminé par un lavage du précipité à l'acide chlorhydrique. Dans le cas des moûts ou des vins riches en dioxyde de soufre, un désulfitage préalable par ébullition à l'abri de l'air est prescrit.1.2. Méthode rapide d'essai Classement des vins en plusieurs catégories par une méthode dite des limites, basée sur la précipitation du sulfate de baryum à l'aide d'une solution titrée d'ion baryum.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Réactifs 2.1.1. Acide chlorhydrique en solution 2 M. 2.1.2. Chlorure de baryum en solution à 200 g/l de BaCl2, 2H2O.2.2. Mode opératoire 2.2.1. Cas général Introduire dans un tube à centrifugation de 50 ml, 40 ml d'échantillon à analyser; ajouter 2 ml d'acide chlorhydrique 2 M et 2 ml de solution de chlorure de baryum à 200 g/l; agiter avec une baguette de verre; rincer la baguette avec un peu d'eau distillée et abandonner au repos pendant 5 minutes. Centrifuger pendant 5 minutes, puis décanter avec précaution le liquide surnageant. Laver ensuite le précipité de sulfate de baryum en procédant de la façon suivante: ajouter 10 ml d'acide chlorhydrique 2 M, mettre le précipité en suspension et centrifuger pendant 5 minutes. Séparer avec précaution le liquide surnageant. Répéter deux fois le lavage du précipité dans les mêmes conditions avec 15 ml d'eau distillée chaque fois. Transvaser quantitativement en rinçant, avec de l'eau distillée, le précipité dans une capsule de platine tarée et la placer sur un bain d'eau à 100 °C jusqu'à évaporation à sec. Le précipité desséché est calciné plusieurs fois brièvement sur flamme jusqu'à obtention d'un résidu blanc. Laisser refroidir dans un dessicateur et peser. Soit m la masse en milligrammes de sulfate de baryum obtenue.2.2.2. Cas particulier: moûts sulfités et vin à teneur élevée en dioxyde de soufre Procéder au préalable à l'élimination du dioxyde de soufre. Dans une fiole conique de 500 ml, munie d'une ampoule à robinet et d'un tube de dégagement, introduire 25 ml d'eau et 1 ml d'acide chlorhydrique pur (r20 = 1,15 1,18 g/ml). Faire bouillir cette solution pour chasser l'air et introduire 100 ml de vin par l'ampoule à robinet, tout en maintenant l'ébullition. Poursuivre l'ébullition jusqu'à ce que le volume de liquide contenu dans la fiole conique soit réduit à environ 75 ml et le transvaser quantitativement, après refroidissement dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter au trait de jauge avec de l'eau. Procéder au dosage des sulfates sur une prise d'essai de 40 ml, comme il est indiqué en 2.2.1.2.3. Expression des résultats 2.3.1. Calculs La teneur en sulfates, exprimée en milligrammes par litre de sulfate de potassium, K2SO4, est:18,67 × m La teneur du moût ou du vin en sulfates est exprimée en milligrammes par litre de sulfate de potassium, sans décimale.2.3.2. Répétabilité jusqu'à 1 000 mg/l : r = 27 mg/lenviron 1 500 mg/l : r = 41 mg/l2.3.3. Reproductibilité jusqu'à 1 000 mg/l : R = 51 mg/lenviron 1 500 mg/l : R = 81 mg/l3. MÉTHODE RAPIDE D'ESSAI 3.1. Réactifs 3.1.1. Solution titrée de chlorure de baryum 2,804 g de chlorure de baryum, BaCl2, 2H2O et 10 ml d'acide chlorhydrique (r 20 = 1,15 à 1,18 g/ml) sont dissous dans une quantité d'eau suffisante pour obtenir 1 l de solution, 1 ml de cette solution précipite une quantité d'ions sulfates équivalente à 2 mg de sulfate de potassium. 3.1.2. Acide sulfurique (r 20 = 1,84 g/ml) en solution diluée 1/10e (m/v).3.2. Mode opératoire Dans trois tubes à essai, placer 10 ml de moût ou de vin; ajouter au no 1: 3,5 ml, au no 2: 5 ml et au no 3: 10 ml de la solution de chlorure de baryum. Agiter et porter à ébullition; laisser reposer 1 à 2 heures. Le liquide de chaque tube, décanté, est filtré et divisé en deux parties. Dans l'une, ajouter quelques gouttes de la solution diluée d'acide sulfurique, dans l'autre ajouter quelques gouttes de la solution de chlorure de baryum. Examiner chaque tube et noter sa limpidité ou son trouble. L'interprétation en est donnée dans le tableau ci-après. VinChlorure de baryumVin filtré +acide sulfurique diluésolution de chlorure de baryum1er essai(ml)(ml)troublelimpide103,5(moins de 0,7 g K2SO4/l) limpide trouble (plus de 0,7 g K2SO4/l)2e essai105troublelimpide(moins de 1 g K2SO4/l) limpide trouble (plus de 1 g K2SO4/l)3³ essai1010troublelimpide(moins de 2 g K2SO4/l) limpide trouble (plus de 2 g K2SO4/l) 13. ACIDITÉ TOTALE 1. DÉFINITION L'acidité totale est la somme des acidités titrables lorsqu'on amène le pH à 7 par addition d'une solution alcaline titrée. Le dioxyde de carbone n'est pas compris dans l'acidité totale.2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Titrage potentiométrique ou titrage en présence de bleu de bromothymol comme indicateur de fin de réaction par comparaison à un étalon de coloration.3. RÉACTIFS 3.1. Solution tampon pH 7,0:Phosphate monopotassique KH2PO4: 107,3 g Solution M d'hydroxyde de sodium (NaOH): 500 ml Eau q.s.p.: 1 000 ml. Les solutions tampons de référence du commerce peuvent également être utilisées. 3.2. Solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH). 3.3. Solution de bleu de bromothymol à 4 g/l. Bleu de bromothymol (C27H28Br2O5S) 4 gAlcool neutre 96 % vol. 200 mlAprès solubilisation ajouter:Eau sans CO2 200 mlSolution M d'hydroxyde de sodiumq.s.p. coloration bleu-vert (pH 7) 7,5 mlEau q.s.p.1 000 ml4. APPAREILLAGE 4.1. Trompe à vide à eau. 4.2. Fiole à vide de 500 ml. 4.3. Potentiomètre à échelle étalonnée en unités pH et électrodes. L'électrode de verre doit être conservée dans l'eau distillée. L'électrode au calomel-chlorure de potassium saturé doit être conservée dans une solution saturée de chlorure de potassium. Une électrode combinée est le plus souvent employée, la conserver dans l'eau distillée. 4.4. Vases cylindriques de 50 ml de capacité (cas des vins) et de 100 ml de capacité (cas des moûts concentrés rectifiés).5. MODE OPÉRATOIRE 5.1. Préparation de l'échantillon 5.1.1. Cas des vins Élimination du dioxyde de carbone. Placer environ 50 ml de vin dans une fiole à vide, agiter et en même temps faire le vide au moyen de la trompe à vide à eau. L'agitation doit durer 1 à 2 minutes.5.1.2. Cas des moûts concentrés rectifiés Introduire 200 g de moût concentré rectifié exactement pesé dans un ballon jaugé de 500 ml. Compléter au trait avec de l'eau. Homogénéiser.5.2. Titrage potentiométrique 5.2.1. Étalonnage du pH mètre L'étalonnage du pH mètre s'effectue à 20 °C en suivant les indications données pour l'appareil utilisé avec la solution tampon de pH 7,00 à 20 °C.5.2.2. Technique d'une mesure Dans un vase cylindrique (4.4) placer un volume d'échantillon, préparé comme indiqué en 5.1, égal à 10 ml dans le cas du vin et à 50 ml dans le cas du moût concentré rectifié. Ajouter 10 ml environ d'eau distillée et verser à la burette la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2) jusqu'à ce que le pH soit égal à 7 à 20 °C. L'addition de liqueur alcaline doit être faite lentement et la solution constamment agitée. Soit n le nombre de millilitres de NaOH 0,1 M versés.5.3. Titrage avec indicateur (bleu de bromothymol) 5.3.1. Essai préalable: établissement de l'étalon de coloration Dans un vase cylindrique (4.4), placer 25 ml d'eau distillée bouillie, 1 ml de solution de bleu de bromothymol (3.3) et un volume préparé comme indiqué en 5.1 égal à 10 ml dans le cas du vin et à 50 ml dans le cas du moût concentré rectifié. Ajouter la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2) jusqu'à obtention d'une coloration bleu-vert. Ajouter 5 ml de la solution tampon pH 7 (3.1).5.3.2. Dosage Dans un vase cylindrique (4.4), placer 30 ml d'eau distillée bouillie, 1 ml de solution de bleu de bromothymol (3.3), un volume d'échantillon préparé comme indiqué en 5.1 égal à 10 ml dans le cas du vin et à 50 ml dans le cas du moût concentré rectifié. Ajouter la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2) jusqu'à obtention d'une coloration identique à celle obtenue à l'essai préalable (5.3.1). Soit n le nombre de millilitres de solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M versés.6. EXPRESSION DES RÉSULTATS 6.1. Mode de calcul 6.1.1. Cas des vins L'acidité totale exprimée en milliéquivalents par litre sera: A = 10 nElle est donnée avec 1 décimale.L'acidité totale exprimée en grammes d'acide tartrique par litre sera: A2 = 0,075· AElle est donnée avec 1 décimale.6.1.2. Cas des moûts concentrés rectifiés - Acidité totale exprimée en milliéquivalents par kilogramme de moût concentré rectifié: a = 5 · n- Acidité totale exprimée en milliéquivalents par kilogramme de sucres totaux:P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux. Elle est exprimée avec 1 décimale.6.2. Répétabilité (r) pour le titrage avec indicateur r = 0,9 me/lr = 0,07 g d'acide tartrique/lpour les vins blancs, rosés et rouges.6.3. Reproductibilité (R) pour le titrage avec indicateur (5.3) Pour les vins blancs et rosés:R = 3,6 me/lR = 0,3 g d'acide tartrique/l. Pour les vins rouges:R = 5,1 me/lR = 0,4 g d'acide tartrique/l. 14. ACIDITÉ VOLATILE 1. DÉFINITION L'acidité volatile est constituée par les acides appartenant à la série acétique qui se trouvent dans le vin à l'état libre et à l'état salifié.2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Titrage des acides volatiles séparés du vin par entraînement à la vapeur d'eau et rectification des vapeurs. Le vin est au préalable débarrassé du dioxyde de carbone. L'acidité du dioxyde de soufre libre et du dioxyde de soufre combiné distillés dans ces conditions doit être retranchée de l'acidité du distillat. L'acidité de l'acide sorbique éventuellement ajouté au vin doit également être retranchée. Remarque:L'acide salicylique utilisé dans certains pays pour stabiliser les vins préalablement à l'analyse se retrouve en partie dans le distillat. Il est nécessaire de le doser et de le défalquer de l'acidité. La méthode de dosage est donnée au paragraphe 7 de ce chapitre.3. RÉACTIFS 3.1. Acide tartrique cristallisé (C4H6O6) 3.2. Solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) 3.3. Solution de phénolphtaléine à 1 pour 100 dans l'alcool à 96 % vol. neutre 3.4. Acide chlorhydrique (r20 = 1,18 à 1,19 g/ml) dilué 1/4 (v/v) 3.5. Solution 0,005 M d'iode (I2) 3.6. Iodure de potassium cristallisé (Kl) 3.7. Empois d'amidon à 5 g/l:Délayer 5 g d'amidon dans 500 ml d'eau environ. Porter à ébullition en agitant et maintenir l'ébullition pendant 10 minutes; ajouter 200 g de chlorure de sodium. Porter au litre après refroidissement. 3.8. Solution saturée de borate de sodium (Na2B4O7, 10 H2O), soit environ 55 g/l à 20° C.4. APPAREILLAGE 4.1. Appareil à entraînement à la vapeur d'eau composé:1) d'un générateur de vapeur d'eau; la vapeur d'eau produite doit être exempte de dioxyde de carbone;2) d'un barboteur;3) d'une colonne rectificatrice;4) d'un réfrigérant.Cet appareil doit répondre aux trois essais suivants:a) placer dans le barboteur 20 ml d'eau bouillie; recueillir 250 ml de distillat et les additionner de 0,1 ml de solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2) et II gouttes de la solution de phénolphtaléine (3.3); la coloration rose doit être stable pendant au moins 10 secondes (vapeur d'eau exempte de dioxyde de carbone).b) Placer dans le barboteur 20 ml d'une solution 0,1 M d'acide acétique. Recueillir 250 ml de distillat. Titrer avec la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2). Le volume versé doit être au moins égal à 19,9 ml. (Acide acétique entraîné D 99,5 %).c) Placer dans le barboteur 20 ml d'une solution M d'acide lactique. Recueillir 250 ml de distillat et titrer l'acidité avec la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium (3.2).Le volume versé doit être inférieur ou égal à 1,0 ml (Acide lactique distillé d 0,5 %).Tout appareil ou toute technique qui satisfait à ces essais constitue un appareil ou une technique officielle internationale. 4.2. Trompe à vide d'eau. 4.3. Fiole à vide.5. MODE OPÉRATOIRE 5.1. Préparation de l'échantillon:élimination du dioxyde de carbone. Placer environ 50 ml de vin dans une fiole à vvide; agiter et en même temps faire le vide au moyen de la trompe à vide d'eau. L'agitation doit durer 1 à 2 minutes.5.2. Entraînement à la vapeur d'eau. Placer 20 ml de vin décarboniqué comme indiqué en 5.1 dans le barboteur. Ajouter 0,5 g environ d'acide tartrique (3.1). Recueillir au moins 250 ml de distillat.5.3. Titrage Titrer par la solution 0,1 M d'hydroxyde (3.2) de sodium en présence de II gouttes de solution de phénolphtaléine (3.3), soit n ml le volume versé. Ajouter IV gouttes d'acide chlorhydrique dilué 1/4 (3.4), 2 ml d'empois d'amidon (3.7) et quelques cristaux d'iodure de potassium (3.6). Titrer le dioxyde de soufre libre par la solution 0,005 M d'iode (3.5). Soit n2 ml le volume versé. Ajouter la solution saturée de borate de sodium (3.8) jusqu'à réapparition de la coloration rose. Titrer le dioxyde de soufre combiné par la solution 0,005 M d'iode (3.5). Soit n" ml le volume versé.6. EXPRESSION DES RÉSULTATS 6.1. Mode de calcul L'acidité volatile exprimée en milliéquivalents par litre avec 1 décimale sera:A = 5 (n 0,1 n2 0,05 n") L'acidité volatile exprimée en grammes d'acide acétique par litre avec 2 décimales sera:0,300 (n 0,1 n2 0,05 n")6.2. Répétabilité (r) r = 0,7 me/lr = 0,04 g d'acide acétique/l.6.3. Reproductibilité (R) R = 1,3 me/lR = 0,08 g d'acide acétique/l.6.4. Cas d'un vin additionné d'acide sorbique L'acide sorbique étant entraînable à la vapeur d'eau à 96 % pour un volume de distillat de 250 ml, son acidité doit être retranchée de l'acidité volatile, sachant que 100 mg d'acide sorbique correspondent à une acidité de 0,89 milliéquivalent, ou de 0,053 g d'acide acétique et connaissant la teneur en acide sorbique (mg/l) déterminée par ailleurs.7. DOSAGE DE L'ACIDE SALICYLIQUE ENTRAÎNÉ DANS LE DISTILLAT DE L'ACIDITÉ VOLATILE 7.1. Principe Après le dosage de l'acidité volatile et la correction du dioxyde de soufre, la présence d'acide salicylique est caractérisée, après acidification, par la coloration violette qui apparaît après addition d'un sel de fer III. Le dosage de l'acide salicylique entraîné dans le distillat avec l'acidité volatile est effectué sur un deuxième distillat de volume égal à celui sur lequel a été effectué le dosage de l'acidité volatile. Dans ce distillat, l'acide salicylique est dosé par une méthode colorimétrique de comparaison. Il est défalqué de l'acidité du distillat de l'acidité volatile.7.2. Réactifs 7.2.1. Acide chlorhydrique (HCl) (r20 = 1,18 à 1,19 g/ml). 7.2.2. Thiosulfate de sodium (Na2 S2 O3, 5 H2O) 0,1 M. 7.2.3. Solution de sulfate de fer LI et d'ammonium [Fe2 (SO4)3, (NH4)2 SO4· 24 H2O] à 10 p. 100 (m/v). 7.2.4. Solution de salicylate de sodium 0,01 M. Solution contenant 1,60 g/l de salicylate de sodium (Na C7 H5 O3).7.3. Mode opératoire 7.3.1. Caractérisation de l'acide salicylique dans le distillat de l'acidité volatile. Immédiatement après le dosage de l'acidité volatile et la correction du dioxyde de soufre libre et combiné ajouter dans la fiole conique 0,5 ml d'acide chlorhydrique (7.2.1), 3 ml de la solution 0,1 M de thiosulfate de sodium (7.2.2) et 1 ml de la solution de sulfate de fer III et d'ammonium (7.2.3). En présence d'acide salicylique, une coloration violette apparaît.7.3.2. Dosage de l'acide salicylique Sur la fiole conique précédente, indiquer par un trait repère le volume du distillat. Vider et rincer la fiole. Soumettre à l'entraînement à la vapeur d'eau une nouvelle prise d'essai de 20 ml de vin et recueillir le distillat dans la fiole conique jusqu'au trait repère. Ajouter 0,3 ml d'acide chlorhydrique pur (7.2.1) et 1 ml de la solution de sulfate de fer III et d'ammonium (7.2.3). Le contenu de la fiole conique se colore en violet. Dans une fiole conique identique à celle portant le trait repère, placer de l'eau distillée jusqu'au même niveau que celui du distillat. Ajouter 0,3 ml d'acide chlorhydrique pur (7.2.1), 1 ml de solution de sulfate de fer III et d'ammonium (7.2.3). Verser à la burette la solution de salicylate de sodium 0,01 M (7.2.4) jusqu'à obtention d'une coloration violette de même intensité que celle de la fiole conique contenant le distillat de vin. soit n2", le nombre de millilitres versés.7.4. Correction de l'acidité volatile Retrancher le volume 0,1 · n2" du volume n ml de solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M utilisé pour titrer l'acidité du distillat lors du dosage de l'acidité volatile. 15. ACIDITÉ FIXE 1. PRINCIPE L'acidité fixe est déterminée par la différence entre l'acidité totale el l'acidité volatile.2. EXPRESSION DES RÉSULTATS L'acidité fixe est exprimée:- en milliéquivalents par litre,- en grammes d'acide tartrique par litre. 16. ACIDE TARTRIQUE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence L'acide tartrique, précipité sous forme de racémate de calcium, est dosé pondéralement. Ce dosage peut être complété par un dosage volumétrique de comparaison. Les conditions de précipitation: pH, volume total mis en oeuvre, concentration des ions précipitants, sont telles que la précipitation du racémate de calcium est totale tandis que le D ( )tartrate de calcium demeure en solution. Lorsque le vin a été additionné d'acide métatartrique, qui rend la précipitation du racémate de calcium incomplète, il devra subir un traitement préalable d'hydrolyse.1.2. Méthode usuelle L'acide tartrique, isolé à l'aide d'une colonne échangeuse d'anions, est dosé colorimétriquement dans l'éluat grâce à la coloration rouge qu'il donne avec l'acide vanadique. Cet éluat contient aussi les acides lactique et malique qui ne sont pas gênants.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Méthode pondérale 2.1.1. Réactifs 2.1.1.1. Solution d'acétate de calcium contenant 10 g/l de calcium: Carbonate de calcium: Ca CO325 gAcide acétique (CH3 COOH) (r20 = 1,05 g/ml)40 mlEau q.s.p. 1 l 2.1.1.2. Racémate de calcium cristallisé: CaC4O6H4, 4H2O:Dans un vase cylindrique de 400 ml, introduire 20 ml d'une solution d'acide L(+) tartrique à 5 g/l, 20 ml d'une solution de D( ) tartrate d'ammonium à 6,126 g/l et 6 ml de la solution d'acétate de calcium à 10 g/l de calcium (2.1.1.1).Laisser précipiter pendant 2 heures. Recueillir le précipité sur un creuset filtrant de porosité no 4, le laver à 3 reprises avec 30 ml environ d'eau distillée. Sécher à l'étuve à 70 °C jusqu'à poids constant. Avec les quantités de réactif mises en oeuvre, on obtient environ 340 mg de racémate de calcium cristallisé. Conserver en flacon bouché. 2.1.1.3. Liqueur de précipitation (pH 4,75):- Acide D( ) tartrique 122 mg- Hydroxyde d'ammonium (r20 = 0,97 g/ml) dilué à 25 % (v/v) 0,3 ml- Solution d'acétate de calcium à 10 g de calcium par litre 8,8 mlEau q.s.p.1 000 ml Dissoudre l'acide D( ) tartrique et ajouter l'hydroxyde d'ammonium; porter le volume à 900 ml environ; ajouter 8,8 ml de solution d'acétate de calcium (2.1.1.1) et après mélange ajuster le pH à 4,75 avec l'acide acétique. Porter au litre. Le racémate de calcium étant légèrement soluble dans cette liqueur, il convient d'y introduire 5 mg de racémate de calcium par litre, de soumettre à l'agitation pendant 12 heures et de filtrer.2.1.2. Mode opératoire 2.1.2.1. Cas des vins non additionnés d'acide métatartrique Dans un vase cylindrique de 600 ml, placer 500 ml de liqueur de précipitation et 10 ml de vin. Mélanger et amorcer la précipitation en frottant les parois du vase avec l'extrémité d'une baguette de verre. Laisser précipiter pendant 12 heures (1 nuit). Filtrer sur creuset filtrant de porosité no 4, taré et disposé sur une fiole à vide propre, en entraînant le précipité. Rincer le vase où s'est effectuée la précipitation avec le filtrat et entraîner les dernières particules de précipité. Sécher à l'étuve à 70 °C jusqu'à poids constant. Peser: soit p le poids de racémate de calcium CaC4O6H4 cristallisé avec 4 molécules d'eau. 2.1.2.2. Cas des vins additionnés d'acide métatartrique Lorsqu'on a affaire à un vin additionné d'acide métatartrique ou que l'on soupçonne cette addition, procéder à l'hydrolyse de cet acide dans les conditions suivantes. Dans une fiole conique de 50 ml, placer 10 ml de vin et 0,4 ml d'acide acétique pur (CH3 COOH, r20 = 1,05 g/ml). Fermer la fiole par un bouchon muni d'un crachoir et porter à ébullition pendant 30 minutes. Après refroidissement, transvaser le liquide contenu dans la fiole conique dans un vase cylindrique; rincer la fiole 2 fois par 5 ml d'eau et continuer comme il est indiqué dans le mode opératoire ci-dessus. L'acide métatartrique est compté comme acide tartrique dans le résultat du dosage.2.1.3. Expression des résultats Une molécule de racémate de calcium correspond à une demi-molécule d'acide L(+) tartrique du vin. La quantité d'acide tartrique par litre de vin, exprimée en milliéquivalents est égale à: 384,5 p. Elle est donnée avec 1 décimale. La quantité d'acide tartrique par litre de vin, exprimée en grammes d'acide tartrique, est égale à: 28,84 p. Elle est donnée avec 1 décimale. La quantité d'acide tartrique par litre de vin, exprimée en grammes de tartrate acide de potassium, est égale à: 36,15 p. Elle est donnée avec 1 décimale.2.2. Dosage volumétrique de comparaison 2.2.1. Réactifs 2.2.1.1. Acide chlorhydrique (HCI) (r20 = 1,18 à 1,19 g/ml) dilué au 1/5 (v/v). 2.2.1.2. Solution d'EDTA 0,05 M:EDTA (sel disodique bihydraté de l'acide éthylènediamine-tétracétique (C10H14N2O8Na2, 2H2O) 18,61 gEau distillée q.s.p.1 000 ml 2.2.1.3. Solution d'hydroxyde de sodium à 40 % (m/v):Hydroxyde de sodium (NaOH) 40 gEau distillée q.s.p. 100 ml 2.2.1.4. Indicateur compléxométrique à l'acide calcone-carbonique: 1 % (m/m)Acide calcone carbonique ou acide 2-hydroxy-4-sulfo-1-naphtylazo-3-naphtoëque (C21H14N2O7S, 3H2O) 1 gSulfate de sodium anhydre (Na2SO4)100 g2.2.2. Mode opératoire Après pesée, replacer le creuset contenant le précipité de racémate de calcium sur la fiole à vide et dissoudre le précipité avec 10 ml d'acide chlorhydrique dilué (2.2.1.1). Laver le creuset filtrant avec 50 ml d'eau distillée. Ajouter 5 ml de solution d'hydroxyde de sodium 40 % (2.2.1.3) et 30 mg environ d'indicateur (2.2.1.4). Titrer par l'EDTA 0,05 M (2.2.1.2). Soit n le nombre de millilitres versés.2.2.3. Expression des résultats La quantité d'acide tartrique par litre de vin, exprimée en milliéquivalents est égale à: 5 n. Elle est donnée avec 1 décimale. La quantité d'acide tartrique par litre de vin, exprimée en grammes d'acide tartrique est égale à: 0,375 n. Elle est donnée avec 1 décimale. La quantité d'acide tartrique par litre de vin exprimée en grammes de tartrate acide de potassium est égale à: 0,470 n. Elle est donnée avec 1 décimale.3. MÉTHODE USUELLE 3.1. Réactifs 3.1.1. Pour le traitement préliminaire du vin. 3.1.1.1. Acide acétique CH3 COOH (r20 = 1,05 g/ml) dilué à 30 pour 100 (v/v). 3.1.1.2.Échangeur d'anions de forte basicité (par exemple: échangeur d'anions III de Merck 20-50 mesh) sous forme acétate. Préparer une suspension de l'échangeur (100 g environ) dans 200 ml d'acide acétique dilué à 30 pour 100 (3.1.1.1). Laisser en contact durant au moins 24 heures avant utilisation. Conserver l'échangeur dans l'acide acétique dilué à 30 pour 100 pour des dosages ultérieurs. 3.1.1.3. Acide acétique CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) dilué à 0,5 pour 100 (v/v). 3.1.1.4. Solution de sulfate de sodium à 7,1 g pour 100 ml (0,5 M). Dissoudre 71 g de sulfate de sodium (Na2SO4) anhydre dans de l'eau distillée et ajuster au volume de 1 000 ml avec de l'eau distillée.3.1.2.Pour le dosage de l'acide tartrique 3.1.2.1. Solution d'acétate de sodium (Na CH3COO) à 27 pour 100 (m/v). Dissoudre 270 g d'acétate de sodium anhydre, Na CH3 COO, dans de l'eau distillée et ajuster au volume de 1 000 ml. 3.1.2.2. Réactif vanadique. Dissoudre 10 g de métavanadate d'ammonium (NH4 VO3), dans 150 ml de solution d'hydroxyde de sodium M (3.1.2.10). Transvaser cette solution dans une fiole jaugée de 500 ml, ajouter 200 ml de la solution d'acétate de sodium à 27 pour 100 (3.1.2.1). Porter à 500 ml avec de l'eau distillée. 3.1.2.3. Solution de H2 SO4 1 M. 3.1.2.4. Solution de H2 SO4 0,5 M. 3.1.2.5. Solution de H2 SO4 0,05 M. 3.1.2.6. Solution d'acide périodique 0,05 M. Dans uns fiole jaugée de 1 000 ml, introduire 10,696 g de periodate de sodium, Na IO4, 50 ml d'acide sulfurique 0,5 M (3.1.2.4) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau distillée. 3.1.2.7. Solution de glycérol à 10 pour 100 (m/v). Dans une fiole jaugée de 100 ml, placer 10 g de glycérol C3H8O3; compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. 3.1.2.8. Solution de sulfate de sodium à 7,1, g pour 100 ml (voir en 3.1.1.4). 3.1.2.9. Solution d'acide tartrique à 1 g/l. Dans une fiole jaugée de 500 ml, introduire 0,5 g d'acide tartrique, 6,66 ml de solution d'hydroxyde de sodium M (3.1.2.10) et compléter à 500 ml avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 (3.1.1.4). 3.1.2.10. Solution d'hydroxyde de sodium, NaOH, 1 M.3.2.Appareillage 3.2.1. Colonne de verre de 300 mm environ de longueur et de 10-11 mm de diamètre intérieur munie d'un robinet. 3.2.2. Spectrophotomètre permettant les mesures d'absorbance à la longueur d'onde de 490 nm, avec cuves de 10 mm de trajet optique.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Préparation de la colonne d'échangeur d'ions Placer dans la colonne de verre au-dessus du robinet (3.2.1), un tampon de coton de verre. Imprégner ce tampon avec de l'eau distillée. Verser dans la colonne 10 ml de la suspension de l'échangeur d'ions en phase acétate (3.1.1.2). Laisser décanter. Placer un tampon de coton de verre à la surface de l'échangeur déposé (de manière à éviter au cours des lavages ultérieurs la remise en suspension de l'échangeur). L'échangeur ne doit servir que pour une seule opération.3.3.2. Isolement des acides organiques Le robinet étant ouvert, laisser la solution d'acide acétique s'écouler jusqu'à environ 2-3 mm au-dessus du tampon de coton de verre placé au-dessus de l'échangeur. Ajouter 10 ml de solution d'acide acétique à 0,5 pour 100 (3.1.1.3), puis laisser écouler le liquide jusqu'au même niveau que dans l'opération précédente. Répéter encore 4 fois cette opération de lavage. Après le dernier lavage, le robinet étant fermé, verser sur l'échangeur 10 ml de vin ou de moût. Laisser écouler le vin goutte à goutte (débit moyen 1 goutte par seconde) et arrêter l'écoulement juste au-dessus de l'échangeur. Ajouter à nouveau dans la colonne 10 ml de solution d'acide acétique à 0,5 pour 100 (3.1.1.3), laisser écouler à la même vitesse que dans l'opération précédente et répéter l'opération de lavage à 7 reprises avec 10 ml d'eau à chaque opération. Au dernier lavage, fermer le robinet dès que le niveau du liquide se trouve un peu au-dessus du tampon de coton de verre supérieur. Éluer les acides fixés sur l'échangeur à l'aide de la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 (3.1.1.4); recueillir l'éluat dans une fiole jaugée de 100 ml jusqu'à ajustage au trait repère.3.3.3. Dosage de l'acide tartrique 3.3.3.1. Cas des vins non additionnés d'acide métatartrique Dans 2 fioles coniques, a et b, introduire 20 ml d'éluat. La fiolea sert au dosage, la fiole b, dans laquelle l'acide tartrique est détruit par l'acide périodique, constitue le témoin. Introduire dans la fiole a:- 2 ml de H2 SO4 M (3.1.2.3),- 5 ml de H2 SO4 0,05 M (3.1.2.5),- 1 ml de glycérol à 10 p. 100 (3.1.2.7). Introduire dans la fioleb:- 2 ml de H2 SO4 M (3.1.2.3),- 5 ml de solution d'acide périodique 0,05 M (3.1.2.6). Attendre 15 minutes; ajouter: 1 ml de solution de glycérol à 10p. 100 (3.1.2.7) pour détruire l'excès d'acide périodique Attendre 2 minutes. Verser alors en agitant, d'abord dans la fiole b, puis aussitôt après dans la fiole a, 5 ml de réactif vanadique (3.1.2.2). Déclencher immédiatement un chronomètre et placer le contenu des fioles a et b dans les cuves du spectrophotomètre. Au bout de 90 secondes, mesurer l'absorbance à 490 nm du liquide provenant de la fiole a (dosage) par rapport au témoin (fiole b). Si l'éluat est trop riche en acide tartrique et que l'absorbance soit trop élevée, diluer l'éluat avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 et procéder à la mesure sur la solution diluée.3.3.3.2. Cas des vins additionnés d'acide métatartrique Lorsqu'on a affaire à un vin additionné d'acide métatartrique ou que l'on soupçonne cette addition, procéder à l'hydrolyse de cet acide comme il est indiqué pour la méthode de référence. Après refroidissement, le contenu de la fiole conique est versé au sommet de la colonne d'échangeur, ainsi que les eaux de rinçage (2 fois 5 ml). Continuer comme il est indiqué ci-dessus. L'acide métatartrique est compté comme acide tartrique dans le résultat du dosage.3.3.4. Établissement de la courbe d'étalonnage Introduire 10, 20, 30, 40 et 50 ml de la solution d'acide tartrique à 1 g/l (3.1.2.9) dans des fioles jaugées de 100 ml et compléter à 100 ml avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 ml (3.1.1.4). Les concentrations de ces solutions correspondent à des éluats obtenus à partir de vins contenant 1, 2, 3, 4 et 5 g d'acide tartrique par litre. Dans 2 fioles coniques, a et b,introduire 20 ml de ces solutions et continuer comme il est indiqué ci-dessus pour l'éluat de vin. La représentation graphique des absorbances de ces solutions en fonction de la teneur en acide tartrique est une droite qui s'incurve légèrement vers le point zéro. Préciser, si nécessaire, cette partie de la courbe en soumettant à la mesure des solutions de titre exactement connu inférieur à 1,0 g/l.3.3.5. Expression des résultats Reporter l'absorbance mesurée pour l'éluat sur la courbe d'étalonnage pour obtenir la teneur du vin en acide tartrique en grammes par litre. Cette teneur est exprimée avec 1 décimale. 17. ACIDE CITRIQUE 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'acide citrique est transformé en oxaloacétate et acétate dans une réaction catalysée par la citrate-lyase (CL):citrate oxaloacétate + acétate En présence de la malate-deshydrogénase (MDH) et de la lactatedeshydrogénase (LDH), l'oxaloacétate et son dérivé de décarboxylation, le pyruvate, sont réduits en L-malate et en L-lactate par le nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH):Oxaloacétate + NADH + H+ L-malate + NAD+Pyruvate + NADH + H+ L-lactate + NAD+ La quantité de NADH oxydé en NAD+ dans ces réactions est proportionnelle au citrate présent. L'oxydation du NADH est mesurée par la diminution de son absorbance à la longueur d'onde 340 nm.2. RÉACTIFS 2.1. Tampon pH 7,8 (glycylglycine 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+ : 0,6 × 10 3M) :dissoudre 7,13 g de glycylglycine dans environ 70 ml d'eau bidistillée. Ajuster le pH à 7,8 avec environ 13 ml de solution d'hydroxyde de sodium 5 M; ajouter 10 ml de solution de chlorure de zinc ZnCl2, à 80 mg dans 100 ml et porter à 100 ml avec de l'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 4 semaines à + 4 °C. 2.2. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH), environ 6.10 3 M, dissoudre 30 mg de NADH et 60 mg de NaHCO3 avec 6 ml d'eau bidistillée. 2.3. Solution de malate deshydrogénase/lactate deshydrogénase, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml) : on fait un mélange de 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml de solution de sulfate d'ammonium (3,2 M) et 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Cette suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. 2.4. Citrate-lyase CL (5 mg de protéine/ml). Dissoudre 168 mg de lyophilisat dans 1 ml d'eau glacée. La solution est stable pendant au moins une semaine à + 4 °C et pendant au moins 4 semaines sous forme congelée. Il est recommandé de procéder, préalablement au dosage, à la vérification de l'activité de l'enzyme. 2.5. Polyvinylpolypyrolidone (PVPP) Remarque:L'ensemble des réactifs nécessaires pour ce dosage est commercialisé.3. APPAREILLAGE 3.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH. À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm. S'agissant de mesures absolues d'absorbance (pas de gamme d'étalonnage, mais référence au coefficient d'extinction du NADH), les échelles des longueurs d'onde et des absorbances de l'appareil doivent être contrôlées. 3.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique. 3.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes allant de 0,02 à 2 ml.4. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON Le dosage du citrate s'effectue généralement directement sur le vin sans décoloration préalable et sans dilution, à condition que la teneur en acide citrique soit inférieure à 400 mg/l. Sinon, procéder à la dilution du vin de manière que la concentration en citrate se situe entre 20 et 400 mg/l (quantité de citrate dans la prise d'essai comprise entre 5 µg et 80 µg). Dans le case de vin rouge riche en composés phénoliques, il est recommandé de le traiter au préalable par la PVPP: mettre en suspension dans l'eau 0,2 g environ de PVPP, laisser reposer 15 minutes. Filtrer sur filtre plissé. À 10 ml de vin placé dans une fiole conique de 50 ml, ajouter la PVPP humide prélevée à la spatule sur le filtre. Agiter pendant 2 à 3 minutes. Filtrer.5. MODE OPÉRATOIRE Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm, l'absorbance zéro étant réglée par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique). Dans les cuves de 1 cm d'épaisseur, introduire: Témoin DosageSolution 2.1 1,00 ml 1,00 mlSolution 2.2 0,10 ml 0,10 mlÉchantillon ---- 0,20 mlEau bidistillée 2,00 ml 1,80 mlSolution 2.3 0,02 ml 0,02 ml Mélanger; après environ 5 minutes, lire les absorbances des solutions témoin et dosage (A1). Ajouter:Solution 2.4 0,02 ml 0,02 ml Mélanger; attendre la fin de la réaction (environ 5 minutes) et lire les absorbances des solutions témoin et dosage (A2). Déterminer les différences d'absorbances (A1-A2) du témoin et du dosage. Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbances du dosage:D A = D A D D AT Remarque: Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot.6. EXPRESSION DES RÉSULTATS La teneur en acide citrique est donnée, en milligrammes par litre (mg/l) sans décimale.6.1. Mode de calcul La concentration en milligrammes par litre est donnée par la formule générale:V = volume du test en millilitres (ici 3,14 ml)v = volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,2 ml)P.M = masse moléculaire de la substance à doser (ici, acide citrique anhydre = 192,1)d = trajet optique de la cuve en centimètres (ici 1 cm)e = coefficient d'absorption du NADH; à 340 nm,e = 6,3 mmole 1 × l × cm 1. On obtient:C = 479 × DA Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque:à 334 nm: C = 488 × D A (e = 6,2 mmole 1 × l × cm 1)à 365 nm: C = 887 × D A (e = 3,4 mmole 1 × l × cm 1)6.2. Répétabilité (r) Teneur en acide citrique inférieure à 400 mg/l : r = 14 mg/l.Teneur en acide citrique supérieure à 400 mg/l : r = 28 mg/l.6.3. Reproductibilité (R) Teneur en acide citrique inférieure à 400 mg/l : R = 39 mg/l.Teneur en acide citrique supérieure à 400 mg/l : R = 65 mg/l. 18. ACIDE LACTIQUE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) l'acide lactique total (L-lactate et D-lactate) est oxydé en pyruvate dans une réaction catalysée par la L-lactate déshydrogénase (L-LDH) et la D-lactate déshydrogénase (D-LDH). L'équilibre de la réaction est en faveur du lactate. L'élimination du pyruvate du milieu réactionnel déplace l'équilibre de la réaction dans le sens de la formation de pyruvate. En présence de L-glutamate, le pyruvate est transformé en L-alanine, réaction catalysée par la glutamate-pyruvate-transaminase (GPT)(1) L-lactate + NAD+ pyruvate + NADH + H+(2) D-lactate + NAD+ pyruvate + NADH + H+(3) Pyruvate + L-glutamate L-alanine + a cétoglutarate La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur d'onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de lactate présente. Remarque:L'acide L-lactique peut être déterminé individuellement par application des réactions (1) et (3). L'acide D-lactique peut être déterminé individuellement par application des réactions (2) et (3).1.2. Méthode usuelle L'acide lactique, séparé sur colonne de résine échangeuse d'anions, est oxydé en éthanal et dosé par colorimétrie après réaction avec le nitroprussiate et la pipéridine.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Réactifs 2.1.1. Solution tampon pH 10 (glycylglycine 0,6 mole/l; L-glutamate 0,1 mole/l). Dissoudre 4,75 g de glycylglycine, 0,88 g d'acide L-glutamique dans environ 50 ml d'eau bidistillée; ajuster le pH à 10 avec quelques millilitres de solution d'hydroxyde de sodium 10 M et porter à 60 ml avec de l'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 12 semaines à + 4 °C. 2.1.2. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) environ 40 × 10 3 M; dissoudre 900 mg de NAD dans 30 ml d'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 4 semaines à + 4 °C. 2.1.3. Suspension de glutamate-pyruvate-transaminase (GPT) à 20 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. 2.1.4. Suspension de L-lactate-déshydrogénase (L-LDH) à 5 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. 2.1.5. Suspension de D-lactate-déshydrogénase (D-LDH) à 5 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. Il est recommandé de procéder, préalablement au dosage, à la vérification de l'activité de l'enzyme. Remarque: L'ensemble des réactifs nécessaires pour le dosage est commercialisé.2.2. Appareillage 2.2.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH. À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm. S'agissant de mesures absolues d'absorbance (pas de gamme d'étalonnage, mais référence au coefficient d'extinction du NADH), les échelles des longueurs d'onde et des absorbances de l'appareil doivent être contrôlées. 2.2.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique. 2.2.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,02 et 2 ml.2.3. Préparation de l'échantillon Éviter de toucher avec les doigts la partie de la verrerie qui entre en contact avec le milieu réactionnel, ceci pouvant être une cause d'apport d'acide L-lactique qui fausserait le résultat. Le dosage du lactate s'effectue généralement directement sur le vin sans décoloration préalable et sans dilution si la concentration en acide lactique est inférieure à 100 mg/l. Si la concentration du vin en acide lactique est comprise entre:100 mg/l et 1 g/l diluer 1/10e avec de l'eau bidistillée;1 g/l et 2,5 g/l diluer 1/25e avec de l'eau bidistillée;2,5 g/l et 5 g/l diluer 1/50e avec de l'eau bidistillée.2.4. Mode opératoire 2.4.1. Dosage de l'acide lactique total La solution tampon doit être ramenée à 20-25 °C avant de procéder au dosage. Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l'absorbance zéro étant réglée par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport à l'eau. Dans les cuves de 1 cm de trajet optique introduire: Témoin DosageSolution 2.1.1 1,00 ml 1,00 mlSolution 2.1.2 0,20 ml 0,20 mlEau bidistillée 1,00 ml 0,80 mlSuspension 2.1.3 0,02 ml 0,02 mlÉchantillon - 0,20 ml Mélanger à l'aide d'un agitateur de verre ou d'une baguette de matière synthétique à bout aplati; après environ 5 minutes, mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A1). Ajouter 0,02 ml de solution 2.1.4 et 0,05 ml de solution 2.1.5, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 30 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A2). Déterminer les différences d'absorbances (A2-A1) du témoin et du dosage. Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbance du dosage. D A = D AD - D AT2.4.2. Dosage de l'acide L-lactique et de l'acide D-lactique Le dosage de l'acide L-lactique et D-lactique peut être réalisé individuellement en appliquant le mode opératoire indiqué pour l'acide lactique total, mais en opérant ainsi après avoir déterminé A1: Ajouter 0,02 ml de solution 2.1.4, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 20 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A2). Ajouter 0,05 ml de solution 2.1.5, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 30 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A3). Déterminer les différences d'absorbances (A2-A1) pour l'acide L-lactique et (A3-A2) pour l'acide D-lactique dans le cas du témoin et dans le cas du dosage. Déduire la différence d'absorbance du témoin de la différence d'absorbance du dosage D A = D AD - D AT Remarque: Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot. Lorsqu'on dose l'acide L-lactique seul, le temps d'incubation après addition de la L-lactate déshydrogénase peut être ramené à 10 minutes.2.5. Expression des résultats La concentration en acide lactique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale.2.5.1. Mode de calcul La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale:V = volume du test en millilitres (V = 2,24 ml pour l'acide L-lactique, V = 2,29 ml pour l'acide D-lactique et l'acide lactique total)v = volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,2 ml)PM = masse moléculaire de la substance à doser (ici acide DL-lactique = 90,08)d = trajet optique de la cuve en centimètres (ici 1 cm)e = coefficient d'absorption du NADH à 340 nm e = 6,3 (mmole 1 × l × cm 1)2.5.1.1. Acide lactique total et acide D-lactique C = 0,164 × D A Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque:Mesure à 334 nm: C = 0,167 × D A (e = 6,2 mmole 1 × l × cm 1)Mesure à 365 nm: C = 0,303 × D A (e = 3,4 mmole 1 × l × cm 1)2.5.1.2. Acide L-lactique C = 0,160 × D A Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque:Mesure à 334 nm: C = 0,163 × D A (e = 6,2 mmole 1 × l × cm 1)Mesure à 365 nm: C = 0,297 × D A (e = 3,4 mmole 1 × l × cm 1)2.5.2. Répétabilité (r) r = 0,02 + 0,07 xi g/l xi = concentration en acide lactique de l'échantillon en grammes par litre2.5.3. Reproductibilité (R) R = 0,05 + 0,125 xi g/l xi = concentration en acide lactique de l'échantillon en grammes par litre3. MÉTHODE USUELLE 3.1.1. Pour le traitement préliminaire du vin Se reporter au chapitre «Acide tartrique», méthode usuelle, en 3.1.1.3.1.2.Pour le dosage de l'acide lactique 3.1.2.1. Solution 0,1 M de sulfate de cérium IV dans de l'acide sulfurique 0,35 M. Dissoudre à froid 40,431 g de sulfate de cérium IV, Ce (SO4)2, 4H2O, dans 350 ml d'une solution M d'acide sulfurique exactement titrée (3.1.2.4). Ajuster à 1 000 ml avec de l'eau distillée. 3.1.2.2. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 2,5 M. 3.1.2.3. Solution d'acétate de sodium à 270 g par litre (préparée à partir d'acétate de sodium sec, Na CH3 COO). 3.1.2.4. Solution d'acide sulfurique (H2SO4) 1 M. 3.1.2.5. Solution de nitroprussiate de sodium [Na2 (Fe (CN)5NO), 2H2O] à 2 pour 100 (m/v). Conserver en flacon bien bouché et à l'obscurité. Limite de conservation de la solution 8 jours. 3.1.2.6. Solution de pipéridine (C5 H11 N) à 10 pour 100 (v/v). 3.1.2.7. Solution d'acide lactique M. 100 ml d'acide lactique (C3H6O3) sont dilués dans 400 ml d'eau. Cette solution placée dans une capsule est chauffée sur un bain d'eau bouillant pendant 4 heures, en complétant de temps en temps le volume avec de l'eau distillée. Porter au litre après refroidissement. Titrer l'acide lactique sur 10 ml de cette solution avec une solution d'hydroxyde de sodium M (3.1.2.8). Ajuster la solution à 1 M d'acide lactique (90 g). 3.1.2.8. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M.3.2. Appareillage 3.2.1. Colonne de verre de 300 mm environ de longueur et de 10-11 mm de diamètre intérieur munie d'un régulateur de débit (robinet). 3.2.2. Bain d'eau thermostaté à 65 °C. 3.2.3. Spectrophomètre permettant les mesures d'absorbance à la longueur d'onde de 570 nm avec des cuves de 1 cm de trajet optique.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Préparation de la colonne d'échangeur d'ions Se reporter au chapitre «Acide tartrique», méthode usuelle, en 3.3.1.3.3.2. Isolement des acides organiques Se reporter au chapitre «Acide tartrique», méthode usuelle, en 3.3.2.3.3.3. Dosage de l'acide lactique Placer 10 ml d'éluat dans un tube de verre de 50 ml de capacité muni d'un bouchon rodé, ajouter 10 ml de solution de sulfate de cérium (3.1.2.1). Agiter; placer le tube dans un bain d'eau thermostaté à 65 °C durant 10 minutes exactement. Au moment de l'immersion soulever pendant quelques secondes le bouchon de verre de manière à compenser la pression due à l'échauffement, puis boucher hermétiquement le tube de manière à éviter les pertes d'éthanal formé. Retirer le tube, refroidir sous courant d'eau pour amener à une température voisine de 20 °C, ajouter 5 ml de la solution d'hydroxyde de sodium 2,5 M (3.1.2.2), mélanger et filtrer. Prélever 15 ml de filtrat et les verser dans une fiole de 50 ml, bouchant à l'émeri, contenant déjà un mélange homogène de 5 ml de solution d'acétate de sodium à 27 pour 100 (3.1.2.3) et de 2 ml d'acide sulfurique M (3.1.2.4). Ajouter 5 ml de la solution de nitroprussiate de sodium (3.1.2.5), mélanger, puis 5 ml de la solution de pipéridine (3.1.2.6), mélanger rapidement et introduire immédiatement cette solution dans la cuve du spectrophotomètre. La coloration produite qui varie du vert au violet est mesurée à 570 nm par rapport à l'air (pas de cuve dans le trajet optique); elle augmente pour diminuer ensuite rapidement. Suivre l'évolution de l'absorbance correspondante et choisir comme valeur définitive, sa valeur maximale. Si l'éluat est trop riche en acide lactique et que l'absorbance soit trop élevée, diluer l'éluat avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 (3.1.1) et procéder à la mesure sur la solution diluée.3.3.4. Établissement de la courbe d'étalonnage Introduire 10 ml de la solution d'acide lactique 1 M (3.1.2.7) et 10 ml de solution titrée d'hydroxyde de sodium 1 M (3.1.2.8) dans une fiole jaugée de 1 000 ml et compléter au trait avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100. En prélever 5, 10, 15, 20 et 25 ml et les introduire dans des fioles jaugées de 100 ml. Compléter au trait repère avec la solution de sulfate de sodium à 7,1 pour 100 (3.1.1). Prélever 10 ml des solutions ainsi obtenues et déterminer pour chacune d'elles la valeur de l'absorbance en suivant le mode opératoire décrit en 3.3.3 pour l'éluat. Ces solutions correspondent aux éluats obtenus à partir de vins contenant 0,45- 0,9- 1,35- 1,80 et 2,25 g/l d'acide lactique. La représentation graphique des absorbances de ces solutions en fonction de la teneur en acide lactique est une droite.3.4. Expression des résultats Reporter l'absorbance mesurée pour l'éluat sur la courbe d'étalonnage pour obtenir la teneur du vin en acide lactique en grammes par litre. Cette teneur est exprimée avec 1 décimale. Remarque:Les vins contenant plus de 250 mg/l de dioxyde de soufre peuvent présenter une teneur en acide éthanalsulfonique qui est compté comme acide lactique. Dans ce cas il faut corriger le résultat du dosage par celui donné par l'opération complémentaire suivante: 15 ml de l'éluat sont mélangés dans une éprouvette bouchée à l'éméri avec 5 ml d'acétate de sodium à 27 pour 100 (3.1.2.3) et 2 ml d'H2SO4 0,775 M (77,5 ml H2SO4 M sont portés à 100 ml avec de l'eau distillée). Puis comme dans le dosage de l'acide lactique, on ajoute 5 ml de nitroprussiate de sodium (3.1.2.5) à 2 pour 100 et 5 ml de pipéridine à 10 pour 100 (3.1.2.6). Après avoir mélangé, mesurer l'absorbance dans les conditions décrites pour le dosage de l'acide lactique. Reporter cette absorbance sur la droite d'étalonnage pour obtenir la valeur apparente B de l'acide lactique en grammes par litre due à l'acide éthanalsulfonique. Si L' est la tenur apparente du vin en acide lactique en grammes par litre, la teneur réelle L en acide lactique est obtenue par: L = L' - B × 0,4 (en g/l) 19. ACIDE L-MALIQUE 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) l'acide L-malique (L-malate) est oxydé en oxaloacétate dans une réaction catalysée par la L-malate-deshydrogénase (L-MDH). L'équilibre de la réaction est en faveur du malate. L'élimination de l'oxaloacétate du milieu réactionnel délace l'équilibre de la réaction dans le sens de la formation d'oxaloacétate. En présence de L-glutamate, l'oxaloacétate est transformé en L-aspartate, réaction catalysée par la glutamate-oxaloacétate-transaminase (GOT). (1) L-malate + NAD + oxaloacétate + NADH + H+ (2) Oxaloacétate + L-glutamate L-aspartate +a - cétoglutarate La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur d'onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de L-malate présente.2. RÉACTIFS 2.1. Tampon pH 10 (Glycylglycine 0,60 M, L-glutamate 0,1 M) Dissoudre 4,75 g de glycylglycine et 0,88 g d'acide L-glutamique dans environ 50 ml d'eau bidistillée; ajuster le pH à 10 avec environ 4,6 ml de solution d'hydroxyde de sodium 10 M et porter à 60 ml avec de l'eau bidistillée.La solution reste stable pendant au moins 12 semaines + 4 °C. 2.2. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD), environ 47 × 10 3 M : dissoudre 420 mg de NAD dans 12 ml d'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 4 semaines à + 4 °C. 2.3. Suspension de glutamate-oxaloacétate-transaminase (GOT) à 2 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C. 2.4. Solution de L-malate-deshydrogénase (L-MDH) à 5 mg/ml. La solution est stable pendant au moins un an à + 4 °C. Remarque: L'ensemble des réactifs nécessaires pour le dosage est commercialisé.3. APPAREILLAGE 3.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH.À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm. S'agissant de mesures absolues d'absorbance (pas de gamme d'étalonnage, mais référence au coefficient d'extinction du NADH), les échelles des longueurs d'onde et des absorbances de l'appareil doivent être contrôlées. 3.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique. 3.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,01 et 2 ml.4. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON Le dosage du L-malate s'effectue généralement directement sur le vin sans décoloration préalable et sans dilution, à condition que la teneur en acide L-malique soit inférieure à 350 mg/l (mesures à 365 nm). Sinon, procéder à la dilution du vin avec de l'eau bidistillée de sorte que la concentration en L-malate se situe entre 30 et 350 mg/l (quantité de L-malate dans la prise d'essai comprise entre 3 et 35 µg). Si la concentration en malate du vin est inférieure à 30 mg/l le volume de la prise d'essai peut être augmenté jusqu'à 1 ml. Dans ce cas le volume de l'eau à ajouter est réduit afin que les volumes totaux soient les mêmes dans les deux cuves.5. MODE OPÉRATOIRE Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l'absorbance zéro étant réglée par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport à l'eau. Dans les cuves de 1 cm de trajet optique introduire: Témoin DosageSolution 2.1 1,00 ml 1,00 mlSolution 2.2 0,20 ml 0,20 mlEau bidistillée 1,00 ml 0,90 mlSuspension 2.3 0,01 ml 0,01 mlÉchantillon - 0,10 ml Mélanger; après environ 3 minutes, mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A1). Ajouter:Solution 2.4 0,01 ml 0,01 ml Mélanger; attendre la fin de la réaction (environ 5 à 10 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A2). Déterminer les différences d'absorbances (A2-A1) dutémoin et du dosage. Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbances du dosage. D A = D AD - D AT Remarque: Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot.6. EXPRESSION DES RÉSULTATS La concentration en acide L-malique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale.6.1. Mode de calcul La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale:V = volume du test en millilitres (ici 2,22 ml)v = volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,1 ml)PM = masse moléculaire de la substance à doser (ici acide L-malique = 134,09)d = trajet optique de la cuve en cm (ici 1 cm)e = coefficient d'absorption du NADH, à 340 nm e = 6,3 mmole 1 × l × cm 1 On obtient pour le L-malate:C = 0,473 × D A g/l Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque:mesure à 334 nm C = 0,482 × D A mesure à 365 nm C = 0,876 × D A6.2. Répétabilité (r) r = 0,03 + 0,034 xi xi = concentration en acide malique de l'échantillon en grammes par litre6.3. Reproductibilité (R) R = 0,05 + 0,071 xi xi = concentration en acide malique de l'échantillon en grammes par litre 20. ACIDE D-MALIQUE (méthode enzymatique) TEST-COMBINATION POUR ENVIRON 30 DÉTERMINATIONS1. PRINCIPE En présence de D-malate-deshydrogénase décarboxyl. (D-MDH) l'acide D-malique (D-malate) est oxydé en oxaloacétate par le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) en oxaloacétate. L'oxaloacétate formé est transformé en pyruvate et en acide carbonique. D-malate + NAD+ + pyruvate + CO2 + NADH + H+ La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur d'onde de 334, 340 et 365 nm est proportionnelle à la quantité de D-malate présent.2. COMPOSITION DU COFFRET a) Flacon 1 contenant environ 30 ml de solution de tampon Hepes 4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazinethan-acide sulfonique), pH = 9,0 et stabilisateurs.b) Flacon 2 contenant environ 210 mg de lyophilisat - NAD.c) Trois flacons 3 contenant le lyophilisat de D-MDH, chacun à environ 8 U.2.1. Préparation des solutions 2.1.1. Utiliser le contenu du flacon 2.a) sans dilution. Thermostater les solutions à 20-25 °C avant l'emploi. 2.1.2. Dissoudre le contenu du flacon 2.b) dans 4 ml d'eau bidistillée. 2.1.3. Dissoudre le contenu d'un des flacons 2.c) dans 0,6 ml d'eau bidistillée. Thermostater la solution à 20-25 °C avant l'emploi.2.2. Stabilité des solutions Le contenu du flacon 2.1.1 se conserve au moins un an à + 4 °C. Solution 2.1.2 se conserve environ 3 semaines à + 4 °C et 2 mois à 20 °C.Solution 2.1.3 se conserve 5 jours à + 4 °C.3. APPAREILLAGE 3.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH et du NADPH.À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm. 3.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique. 3.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,01 et 2 ml.4. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON La quantité de D-malate dans la cuve doit être comprise entre 2 µg et 50 µg. Diluer donc la solution d'essai de telle manière que la concentration en malate soit comprise entre 0,02 et 0,5 g/l, respectivement 0,02 et 0,3 g/l. Si la différence d'absorption DA est < 0,100, le volume d'essai peut être augmenté jusqu'à 1,80 ml en réduisant le volume de l'eau à ajouter, afin que les volumes totaux soient les mêmes dans les deux cuves (essai et témoin).5. MODE OPÉRATOIRE Température: 20 à 25 °CVolume du test: 2,95 ml Mesurer contre l'air (pas de cuve dans le trajet optique) ou contre l'eau. Introduire dans les cuvesTémoinEssaiSolution 2.1.1.1,00 ml1,00 mlSolution 2.1.20,10 ml0,10 mlEau bidistillée1,80 ml1,70 mlEssai 0,10 mlMélanger. Après environ 6 minutes, lire les absorbances des solutions (A1). Déclencher la réaction par addition de:Solution 2.1.30,05 ml0,05 mlMélanger. À la fin de la réaction (environ 20 minutes), lire les absorbances des solutions (A2). Déterminer les différences d'absorbances (A2 A1), du témoin et de l'essai. Déduire la différence d'absorbance du témoin de celle de l'essai.D A = D Ae D AT6. EXPRESSION DES RÉSULTATS La concentration en acide D-malique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale.6.1. Mode de calcul La formule générale pour le calcul des concentrations est la suivante:V = volume du test (ml)v = volume de l'essai (ml)PM = poids moléculaire de la substance à doserd = épaisseur de la cuve (cm)e = coefficient d'absorption du NADH: Hg 340 nm = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1)Hg 334 nm = 6,18 (mmol 1 · l · cm 1)Hg 365 nm = 3,4 (mmol 1 · l · cm 1) On obtient ainsi pour le D-malateSi une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution F.6.2. Répétabilité (r) r = 0,05 xi6.3. Reproductibilité (R) R = 0,1 × xi xi = concentration en acide D-malique en g/l. 21. ACIDE MALIQUE TOTAL MÉTHODE USUELLE1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'acide malique isolé à l'aide d'une colonne de résine échangeuse d'anions est dosé colorimétriquement dans l'éluat grâce à la coloration jaune qu'il donne sous l'action de l'acide sulfurique à 96 pour 100 et de l'acide chromotropique. Les substances contenues dans l'éluat interfèrent dans cette réaction. Mais ces substances réagissent, contrairement à l'acide malique, avec l'acide sulfurique à 86 pour 100 et l'acide chromotropique. Pour éliminer cette interférence, il suffit donc de soustraire de l'absorbance obtenue après réaction avec l'acide chromotropique et l'acide sulfurique à 96 pour 100, l'absorbance obtenue après réaction avec l'acide chromotropique et l'acide sulfurique à 86 pour 100.2. APPAREILLAGE 2.1. Colonne de verre de 250 mm environ de longueur et de 35 mm de diamètre intérieur, munie d'un robinet. 2.2. Colonne de verre de 300 mm environ de longueur et de 10-11 mm de diamètre intérieur, munie d'un robinet. 2.3. Bain d'eau à 100 °C. 2.4. Spectrophotomètre permettant les mesures d'absorbance à la longueur d'onde de 420 nm avec cuves de 10 mm de trajet optique.3. RÉACTIFS 3.1. Échangeur d'anions de forte basicité (par exemple Merck III). 3.2. Hydroxyde de sodium à 5 pour 100 (m/v). 3.3. Acide acétique à 30 pour 100 (m/v). 3.4. Acide acétique à 0,5 pour 100 (m/v). 3.5. Solution de sulfate de sodium (Na2SO4) à 10 pour 100 (m/v). 3.6. Acide sulfurique concentré à 95-97 % (m/m). 3.7. Acide sulfurique à 86 pour 100 (m/m). 3.8. Solution d'acide chromotropique à 5 pour 100 (m/v). À préparer extemporanément avant chaque dosage en dissolvant 500 mg de chromotropate de sodium (C10H6Na2O8S2, 2 H2O) dans 10 ml d'eau distillée. 3.9. Solution d'acide DL-malique à 0,5 g/l. Dissoudre 250 mg/l d'acide malique (C4H6O5) dans une quantité suffisante de solution de sulfate de sodium à 10 pour 100 (3.5) pour avoir 500 ml.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échangeur d'ions Placer dans la colonne de verre 35 × 250 mm au-dessus du robinet un tampon de coton de verre imprégné d'eau distillée. Verser dans la colonne de l'échangeur d'ions mis en suspension dans l'eau de manière à avoir un espace libre d'environ 50 mm au-dessus de la surface de l'échangeur d'ions. Après rinçage avec 1 000 ml d'eau distillée, remplir la colonne avec la solution d'hydroxyde de sodium à 5 pour 100, laisser écouler le liquide jusqu'à environ 2-3 mm au-dessus de la surface de l'échangeur d'ions, répéter encore 2 fois cette opération et laisser en contact durant 1 heure. Laver la colonne avec 1 000 ml d'eau distillée. Ensuite remplir la colonne avec la solution d'acide acétique à 30 pour 100, laisser écouler le liquide jusqu'à environ 2-3 mm au-dessus de la surface de l'échangeur d'ions, répéter cette opération 2 fois et laisser en contact durant au moins 24 heures avant l'emploi. Conserver ensuite l'échangeur d'ions dans l'acide acétique à 30 pour 100 pour les dosages ultérieurs.4.2. Préparation de la colonne d'échangeur d'ions Placer dans la colonne de verre 11 × 300 mm au-dessus du robinet un tampon de coton de verre. Verser dans la colonne l'échangeur d'ions, préparé comme décrit en 4.1, sur une hauteur de 10 cm. Le robinet étant ouvert, laisser la solution d'acide acétique à 30 pour 100 s'écouler jusqu'à environ 2-3 mm au-dessus de la surface de l'échangeur. Laver l'échangeur avec 50 ml de la solution d'acide acétique à 0,5 pour 100.4.3. Isolement de l'acide DL-malique Verser sur l'échangeur préparé comme décrit en 4.2 10 ml de vin ou de moût. Laisser écouler le vin goutte à goutte (débit moyen: une goutte par seconde) jusqu'à environ 2-3 mm au-dessus de la surface de l'échangeur d'ions. Laver la colonne d'abord avec environ 50 ml de la solution d'acide acétique à 0,5 pour 100 et puis avec environ 50 ml d'eau distillée; laisser écouler ces liquides avec la même vitesse que le vin. Éluer les acides fixés sur l'échangeur d'ions à l'aide de la solution de sulfate de sodium à 10 pour 100 avec la même vitesse que les opérations précédentes (1 goutte par seconde), recueillir l'éluat dans une fiole jaugée de 100 ml jusqu'à ajustage au trait de jauge. On peut régénérer l'échangeur comme décrit en 4.1. 4.4. Dosage de l'acide malique Prendre deux tubes à large ouverture de 30 ml, bouchés à l'émeri,«A» et «B». Introduire dans chaque tube 1,0 ml d'éluat et 1,0 ml de la solution d'acide chromotropique à 5 pour 100. Ajouter dans le tube «A» 10,0 ml d'acide sulfurique à 86 pour 100 (témoin) et dans le tube «B» 10,0 ml d'acide sulfurique à 96 pour 100 (mesure). Boucher et agiter pour obtenir une homogénéité parfaite sans mouiller le rodage. Plonger les tubes pendant 10 minutes exactement dans un bain d'eau porté préalablement à une vive ébullition. Refroidir les tubes à 20 °C à l'obscurité. Exactement 90 minutes après le début du refroidissement, mesurer l'absorbance du tube «B» par rapport au témoin (tube «A») à la longueur d'onde 420 nm dans les cuves de 10 mm de trajet optique.4.5. Établissement de la courbe d'étalonnage Prélever 5 - 10 - 15 et 20 ml de la solution d'acide malique à 0,5 g/l et les introduire dans des fioles jaugées de 50 ml; porter au trait de jauge avec la solution de sulfate de sodium à 10 pour 100. Les solutions ainsi obtenues correspondent à des éluats obtenus à partir de vins contenant 0,5 - 1,0 - 1,5 et 2,0 g d'acide DL-malique par litre. Continuer comme il est indiqué en 4.4. Les valeurs de l'absorbance obtenues avec ces solutions-étalos reportées en fonction des teneurs en acide malique correspondantes s'alignent sur une droite passant par l'origine. Étant donné que l'intensité de la coloration dépend beaucoup de la concentration de l'acide sulfurique, il est nécessaire de vérifier la courbe d'étalonnage pour au moins 1 point lors de chaque série de mesures pour mettre en évidence un changement éventuel dans la concentration de l'acide sulfurique.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS Reporter l'absorbance mesurée pour l'éluat sur la courbe d'étalonnage pour obtenir la teneur en acide DL-malique en grammes par litre. Cette teneur est exprimée avec 1 décimale. Répétabilité (r) teneur < 2 g/l: r = 0,1 g/lteneur > 2 g/l: r = 0,2 g/l. Reproductibilité (R) R = 0,3 g/l. 22. ACIDE SORBIQUE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de dosage par spectrophotométrie d'absorption dans l'ultra-violet L'acide sorbique (acide hexadiène 2,4 oïque trans, trans) extrait par entraînement à la vapeur d'eau est dosé dans le distillat du vin par spectrophotométrie d'absorption dans l'ultra-violet. Les substances interférant sur la mesure d'absorption dans l'ultra-violet sont éliminées par évaporation à sec de la prise d'essai du distillat légèrement alcalinisée par une solution d'hydroxyde de calcium. Les teneurs inférieures à 20 mg/l doivent être confirmées par la caractérisation par chromatographie en couche mince (sensibilité: 1 mg/l).1.2. Méthode de dosage par chromatographie gazeuse L'acide sorbique extrait dans l'éther éthylique est dosé par chromatographie en phase gazeuse en présence d'un étalon interne.1.3. Méthode de recherche de traces par chromatographie sur couche mince L'acide sorbique extrait dans l'éther éthylique est séparé par chromatographie sur couche mince et sa concentration est évaluée semi-quantitativement.2. MÉTHODE DE DOSAGE PAR SPECTROPHOTOMÉTRIE D'ABSORPTION DANS L'ULTRA-VIOLET 2.1. Réactifs 2.1.1. Acide tartrique, C4H6O6 cristallisé. 2.1.2. Solution d'hydroxyde de calcium, Ca (OH)2 environ 0,02 M. 2.1.3. Solution de référence d'acide sorbique à 20 mg par litre. Dissoudre 20 mg d'acide sorbique, C6H8O2 dans 2 ml environ de solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium. Verser dans une fiole jaugée de 1 000 ml, ajuster au trait repère avec de l'eau. On peut également dissoudre 26,8 mg de sorbate de potassium, C6H7KO2 dans l'eau et compléter à 1 000 ml avec de l'eau.2.2. Appareillage 2.2.1. Appareil d'entraînement par la vapeur d'eau (voir «Acidité volatile»). 2.2.2. Bain d'eau à 100 °C. 2.2.3. Spectrophotomètre permettant des mesures à la longueur d'onde de 256 nm avec cuves en quartz de 1 cm de trajet optique.2.3. Mode opératoire 2.3.1.Distillation Placer dans le barboteur de l'appareil d'entraînement par la vapeur d'eau 10 ml de vin, ajouter 1 à 2 g d'acide tartrique (2.1.1). Recueillir 250 ml de distillat.2.3.2. Courbe d'étalonnage Préparer par dilutions avec l'eau à partir de la solution de référence (2.1.3) quatre solutions de référence diluées titrant respectivement 0,5 - 1 - 2,5 et 5 mg d'acide sorbique par litre; mesurer à l'aide du spectrophotomètre leurs absorbances respectives à 256 nm par rapport à l'eau distillée. Tracer la courbe des variations de l'absorbance en fonction des concentrations des solutions. La variation est linéaire.2.3.3. Dosage Dans une capsule de 55 mm de diamètre placer 5 ml de distillat, ajouter 1 ml de solution d'hydroxyde de calcium (2.1.2). Évaporer à sec sur bain d'eau bouillante. Reprendre le résidu par quelques millilitres d'eau distillée, entraîner quantitativement dans une fiole jaugée de 20 ml et ajuster au trait repère avec les eaux de rinçage. Mesurer l'absorbance à 256 nm à l'aide du spectrophotomètre comparativement à une solution témoin obtenue par dilution à 20 ml avec de l'eau de 1 ml de solution d'hydroxyde de calcium (2.1.2). Porter la valeur de l'absorbance mesurée sur la droite d'étalonnage, en déduire la concentration C de la solution en acide sorbique. Remarque: Dans la pratique courante, cette évaporation à sec peut être négligée. Opérer directement la mesure d'absorbance sur le distillat dilué au 1/4 par rapport à l'eau distillée.2.4. Expression des résultats 2.4.1. Mode de calcul La concentration en acide sorbique du vin exprimée en milligrammes par litre est égale à:100 × C C = concentration en acide sorbique de la solution analysée par spectrophotométrie, exprimée en milligrammes par litre.3. MÉTHODE DE DOSAGE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE 3.1. Réactifs 3.1.1. Éther éthylique, (C2H5)2O distillé au moment de l'utilisation. 3.1.2. Solution de l'étalon interne: solution d'acide undécanoïque, C11H22O2 dans l'éthanol à 95 pour 100 (vol.) titrant 1 g par litre. 3.1.3. Solution aqueuse d'acide sulfurique, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) dilué 1/3 (v/v).3.2. Appareillage 3.2.1. Chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne en acier inoxydable (4 m × 1/8 de pouce) préalablement traitée par le diméthyldichlorosilane et garnie de phase stationnaire, constituée par un mélange de diéthylèneglycol succinate (5 %) et d'acide phosphorique (1 %) (DEGS- H3 PO4) ou par un mélange de diéthylèneglycol adipate (7 %) et d'acide phosphorique (1 %) (DEGA - H3 PO4) fixé sur Gaschrom Q 80 - 100 mesh. Pour le traitement au diméthyldichlorosilane (DMDCS), faire passer dans la colonne une solution titrant 2 à 3 g de DMDCS dans le toluène. Laver immédiatement la colonne avec du méthanol; faire passer un courant d'azote, puis de l'hexane et à nouveau un courant d'azote. La remplir ensuite. Conditions opératoires:Température du four: 175 °C.Température de l'injecteur et du détecteur: 230 °C. Gaz vecteur: azote (débit 20 ml/min.). 3.2.2. Microseringue de 10 microlitres de capacité graduée par 0,1 microlitre. Remarque: D'autres types de colonnes peuvent également permettre une bonne séparation, notamment la colonne capillaire (par exemple, FFAP). Le mode opératoire décrit ci-dessous est donné à titre d'exemple.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Préparation de l'échantillon à analyser Dans un tube de verre de 40 ml environ de capacité et muni d'un bouchon rodé introduire 20 ml de vin, ajouter 2 ml de solution de l'étalon interne (3.1.2) et 1 ml de solution diluée d'acide sulfurique (3.1.3). Après agitation par retournements successifs, ajouter au contenu du tube 10 ml d'éther éthylique (3.1.1). Extraire l'acide sorbique dans la phase organique par agitation du tube durant 5 minutes. Laisser décanter.3.3.2. Préparation de la solution de référence Sélectionner un vin dont le chromatogramme de l'extrait à l'éther ne présente aucun pic au niveau de l'élution de l'acide sorbique; surcharger ce vin en acide sorbique à la concentration de 100 mg par litre. Traiter 20 ml de l'échantillon ainsi préparé selon le mode opératoire décrit en 3.3.1.3.3.3. Chromatographie Injecter successivement dans le chromatographe à l'aide d'une microseringue 2 µl de la phase éthérée obtenue en 3.3.2 et 2 µl de la phase éthérée obtenue en 3.3.1. Enregistrer les chromatogrammes respectifs; vérifier l'identité des temps de rétention respectifs de l'acide sorbique et de l'étalon interne. Mesurer la hauteur (ou la surface) de chacun des pics enregistrés.3.4. Expression des résultats 3.4.1. Mode de calcul La concentration en acide sorbique du vin analysé, exprimée en milligrammes par litre, est égale à:H = hauteur du pic de l'acide sorbique dans la solution de référenceh = hauteur du pic de l'acide sorbique dans l'échantillon à analyserl = hauteur du pic de l'étalon interne dans la solution de référencei = hauteur du pic de l'étalon interne dans l'échantillon à analyser Note: La concentration en acide sorbique peut être déterminée de la même manière à partir des mesures de la surface des pics respectifs.4. MÉTHODE DE RECHERCHE DE TRACES D'ACIDE SORBIQUE PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE 4.1. Réactifs 4.1.1. Éther éthylique, (C2H5)2O. 4.1.2. Solution aqueuse d'acide sulfurique, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) dilué 1/3 (v/v). 4.1.3. Solution de référence d'acide sorbique dans un mélange hydroéthanolique à 10 % d'éthanol (vol.) environ titrant 20 mg par litre. 4.1.4. Phase mobile: hexane - pentane - acide acétique (20:20:3) (C6H14 - C5H12 - CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml).4.2. Appareillage 4.2.1. Plaques pour chromatographie sur couche mince prêtes à l'emploi, 20 × 20 cm recouvertes de gel de polyamide (épaisseur: 0,15 mm) additionné d'un indicateur de fluorescence. 4.2.2. Cuve pour chromatographie sur couche mince. 4.2.3. Micropipette ou microseringue permettant de délivrer des volumes de 5 microlitres à ± 0,1 microlitre près. 4.2.4. Lampe à rayonnement ultra-violet (254 nm).4.3. Mode opératoire 4.3.1. Préparation de l'échantillon à analyser Dans un tube en verre de 25 ml environ de capacité et muni d'un bouchon rodé, placer 10 ml de vin, ajouter 1 ml de solution d'acide sulfurique dilué (4.1.2) et 5 ml d'éther éthylique (4.1.1). Agiter par retournements successifs. Laisser décanter.4.3.2. Préparation des solutions diluées de référence Par dilution à partir de la solution 4.1.3 préparer cinq solutions diluées de référence titrant respectivement 2 - 4 - 6 - 8 et 10 mg d'acide sorbique par litre.4.3.3. Chromatographie À 2 cm du bord inférieur de la plaque, déposer à l'aide d'une microseringue ou d'une micropipette 5 µl de phase éthérée obtenue en 4.3.1 et 5 µl de chacune des solutions diluées de référence (4.3.2), les dépôts étant distants de 2 cm. Placer la phase mobile (4.1.4) dans la cuve pour chromatographie sur une hauteur de 0,5 cm environ et laisser l'atmosphère de la cuve se saturer des vapeurs des solvants. Placer la plaque dans la cuve. Laisser développer le chromatogramme sur 12 à 15 cm (la durée de développement est de 30 minutes environ). Sécher la plaque sous un courant d'air froid. Examiner le chromatogramme sous une lampe à rayonnement ultra-violet à 254 nm. Les taches relatives à l'acide sorbique apparaissent en violet sombre sur le fond jaune fluorescent de la plaque.4.4. Expression des résultats La comparaison de l'intensité du spot de l'échantillon à analyser et des spots des solutions de référence permet d'évaluer semi-quantitativement la concentration en acide sorbique entre 2 et 10 mg par litre. Une concentration égale à 1 mg par litre pourra être déterminée avec un dépôt de 10 µl de solution de l'échantillon à analyser.Des concentrations supérieures à 10 mg par litre pourront être déterminées avec un volume de dépôt de la solution à analyser inférieur à 5 µl (mesuré à l'aide d'une microseringue). 23. ACIDE L-ASCORBIQUE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES Les méthodes proposées permettent de doser l'acide L-ascorbique et l'acide déhydroascorbique présents dans les vins ou les moûts.1.1. Méthode de référence (fluorimétrique) L'acide L-ascorbique est oxydé par action du charbon actif en acide déhydroascorbique. Ceci forme un composé fluorescent par réaction avec l'orthophénylènediamine (O.P.D.A.). Un essai témoin en présence d'acide borique permet de déterminer la fluorescence parasite (par formation d'un complexe acide borique - acide déhydroascorbique) et de la déduire du dosage fluorimétrique.1.2. Méthode usuelle (colorimétrique) L'acide L-ascorbique est oxydé par l'iode en acide déhydroascorbique. Ce composé est précipité par la 2,4 dinitrophénylhydrazine en bis (2,4 - dinitrophénylhydrazone). Après séparation par chromatographie sur couche mince et solubilisation en milieu acétique, ce composé coloré en rouge est dosé par spectrophotométrie à 500 nm.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE (MÉTHODE FLUORIMÉTRIQUE) 2.1.Réactifs 2.1.1. Solution de dihydrochlorure d'ortho-phénylènediamine (C6H10Cl2N2), à 0,02 g pour 100 ml, préparée extemporanément. 2.1.2. Solution d'acétate de sodium trihydraté (CH3COONa 3H2O), à 500 g/l. 2.1.3. Solution mixte d'acide borique et d'acétate de sodiumDissoudre 3 g d'acide borique (H3BO3), dans 100 ml de solution d'acétate de sodium (2.1.2). Cette solution doit être préparée extemporanément. 2.1.4. Solution d'acide acétique cristallisable CH3COOH, (r20 = 1,05 g/ml) dilué à 56 pour 100 (v/v) de pH voisin de 1,2. 2.1.5. Solution de référence d'acide L-ascorbique à 1 g par litreDissoudre au moment de l'emploi 50 mg d'acide L-ascorbique (C6H8O6), préalablement déshydraté dans un dessiccateur à l'abri de la lumière, dans 50 ml de solution d'acide acétique (2.1.4). 2.1.6. Charbon actif très pur pour analyses (10) Placer dans une fiole conique de 2 l de capacité 100 g de charbon actif, ajouter 500 ml d'une solution d'acide chlorhydrique (HCl), (r20 = 1,19 g/ml) à 10 pour 100 (v/v). Porter à l'ébullition, filtrer sur filtre en verre fritté de porosité 3. Recueillir le charbon ainsi traité dans une fiole conique de 2 l de capacité, ajouter 1 l d'eau, agiter et filtrer sur filtre de verre fritté de porosité 3. Répéter deux fois cette opération. Plaçer le résidu dans une étuve réglée à 115 ± 5 °C pendant 12 heures (une nuit par exemple).2.2. Appareillage 2.2.1. Fluorimètre. Utiliser un spectrofluorimètre équipé d'une lampe à spectre continu en se plaçant à la puissance minimale de la lampe. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission optimales pour l'essai seront déterminées préalablement et dépendent de l'appareil utilisé. À titre indicatif la longueur d'onde d'excitation se situe au voisinage de 350 nm, la longueur d'onde d'émission au voisinage de 430 nm.Cuves de 1 cm de trajet optique. 2.2.2. Filtre en verre fritté de porosité 3. 2.2.3. Tubes à essai (diamètre7 10 mm). 2.2.4. Agitateur pour tubes à essai.2.3. Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon de vin ou de moût Prélever un volume de vin ou de moût et le diluer à 100 ml dans une fiole jaugée avec la solution d'acide acétique à 56 % (2.1.4) afin d'obtenir une solution dont la concentration en acide L-ascorbique soit comprise entre 0 et 60 mg/litre. Homogénéiser le contenu de la fiole jaugée par agitation. Ajouter 2 g de charbon actif (2.1.6) et laisser en contact durant 15 minutes en agitant de temps en temps. Filtrer sur papier filtre ordinaire en éliminant les premiers millilitres de filtrat. Dans deux fioles jaugées de 100 ml introduire 5 ml de filtrat et, respectivement, 5 ml de solution mixte d'acide borique et d'acétate de sodium (2.1.3) (témoin) et 5 ml de solution d'acétate de sodium (2.1.2) (solution mesure). Laisser en contact durant 15 minutes en agitant de temps en temps, compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Prélever 2 ml du contenu de chacune des fioles, ajouter 5 ml de solution d'ortho-phénylènediamine (2.1.1), agiter; laisser la réaction se développer durant 30 minutes à l'obscurité, puis effectuer la mesure au spectrofluorimètre.2.3.2. Courbe d'étalonnage Dans trois fioles jaugées de 100 ml placer respectivement 2, 4, 6 ml de solution de référence d'acide L-ascorbique (2.1.5), compléter à 100 ml avec la solution d'acide acétique (2.1.4), homogénéiser par agitation. Les solutions de référence préparées contiennent respectivement 2 - 4 - 6 mg/100 ml. Ajouter 2 g de charbon actif (2.1.6) dans chacune des fioles et laisser en contact durant 15 minutes en agitant de temps en temps. Filtrer sur papier filtre ordinaire en éliminant les premiers millilitres. Introduire respectivement 5 ml de chacun des filtrats recueillis dans trois fioles jaugées de 100 ml (première série), répéter l'opération dans une deuxième série de trois fioles jaugées. Ajouter dans chacune des fioles de la première série (correspondant à l'essai témoin) 5 ml de solution mixte d'acide borique et d'acétate de sodium (2.1.3) et dans chacune des fioles de la deuxième série 5 ml de solution d'acétate de sodium (2.1.2). Laisser en contact durant 15 minutes en agitant de temps en temps, compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Prélever 2 ml du contenu de chacune des fioles, ajouter 5 ml de solution d'orthophénylènediamine (2.1.1), agiter, laisser la réaction se développer durant 30 minutes à l'obscurité, puis effectuer la mesure au spectrofluorimètre.2.3.3. Détermination fluorimétrique Régler pour chaque solution de la courbe d'étalonnage et pour la solution du dosage le zéro de l'échelle des mesures sur l'essai témoin correspondant. Effectuer ensuite la mesure de l'intensité de la fluorescence pour chaque solution de la gamme d'étalonnage et pour le dosage. Tracer la courbe d'étalonnage; elle doit être linéaire et passer par l'origine. Reporter sur cette droite la valeur relative au dosage et déduire la teneur C en acide L-ascorbique + acide déhydroascorbique de la solution analysée.2.3.4. Expression des résultats La concentration du vin en acide L-ascorbique + acide déhydroascorbique exprimée en milligrammes par litre sera:C· F F = facteur de dilution3. MÉTHODE USUELLE (COLORIMÉTRIQUE) 3.1. Réactifs 3.1.1. Solution d'acide métaphosphorique à 30 pour 100 (m/v)Prélever 30 g d'acide métaphosphorique (HPO3)n, préalablement broyé au mortier. Laver rapidement par immersion et agitation dans l'eau distillée. Dissoudre l'acide lavé dans de l'eau distillée en agitant dans une fiole jaugée de 100 ml, ajuster au trait repère, la solution obtenue titre environ 30 pour 100 (m/v) en acide métaphosphorique. 3.1.2. Solution d'acide métaphosphorique à 3 pour 100 (m/v) préparée extemporanément par dilution 1/10 avec l'eau distillée de la solution 3.1.1. 3.1.3. Solution d'acide métaphosphorique à 1 pour 100 (m/v) préparée extemporanément par dilution 1/30 avec l'eau distillée de la solution 3.1.1. 3.1.4. Suspension de polyamideMettre en suspension 10 g de poudre de polyamide pour chromatographie avec 60 ml d'eau distillée, laisser en contact durant 2 heures. La quantité préparée est suffisante pour 4 déterminations. 3.1.5. Thiourée (H2NCSNH2) 3.1.6. Solution d'iode (I2) 0,05 M. 3.1.7. Solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine à 6 % (m/v). Mettre en suspension 6 g de 2,4-dinitrophénylhydrazine (C6H6N4O4) dans 50 ml d'acide acétique cristallisable (r20 = 1,05 g/ml); ajouter 50 ml d'acide sulfurique (r20 = 1,84 g/ml); la 2,4-dinitrophénylhydrazine se dissout par agitation. 3.1.8. Acétate d'éthyle (C4H8O2) additionné de 2 pour 100 (v/v) d'acide acétique cristallisable (3.1.12). 3.1.9. Chloroforme (CHCl3). 3.1.10. Solution aqueuse d'amidon à 0,5 pour 100 (m/v). 3.1.11. Phase mobile:acétate d'éthyle50 vol.chloroforme60 vol.acide acétique cristallisable 5 vol. Laisser au repos le mélange solvant 12 heures avant l'emploi. 3.1.12. Acide acétique cristallisable (CH3COOH) (r20 = 1,05 g/ml). 3.1.13. Solution d'acide L-ascorbique à 0,1 g pour 100 ml de solution d'acide métaphosphorique à 1 pour 100 (3.1.3).3.2. Appareillage 3.2.1. Centrifugeuse de laboratoire et tubes à centrifuger de 50 ml de capacité et à bouchons rodés. 3.2.2. Bain d'eau refroidie thermostaté entre 5 et 10 °C. 3.2.3. Bain d'eau refroidie thermostaté à 20 °C. 3.2.4. Plaques pour chromatographie sur couche mince prêtes à l'emploi, 20 × 20 cm, recouvertes de gel de silice G (épaisseur 0,25 ou 0,3 mm). 3.2.5. Cuve pour chromatographie. 3.2.6. Micropipette permettant de délivrer des volumes de 0,2 ml. 3.2.7. Spectrophotomètre permettant d'effectuer des mesures d'absorbance à 500 nm équipé de cuves de 1 cm de trajet optique.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Oxydation de l'acide L-ascorbique en acide déhydroascorbique Placer 50 ml de vin dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 15 ml de suspension de polyamide (3.1.4) et ajuster au trait repère avec la solution d'acide métaphosphorique à 3 pour 100 (3.1.2). Laisser en contact durant 1 heure en agitant à intervalles rapprochés. Filtrer sur filtre plissé. Recueillir 20 ml de filtrat dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml de solution 0,05 M d'iode (3.1.6). Homogénéiser le contenu par agitation du tube à centrifuger bouché et, après 1 minute, réduire l'excès d'iode par 25 mg environ de thiourée.3.3.2. Formation et extraction de la bis (2,4-dinitrophénylhydrazone) de l'acide dicétogulonique Placer le tube dans un bain d'eau refroidie entre 5 et 10 °C, ajouter 4 ml de solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine (3.1.7). Homogénéiser le contenu du tube en évitant de mouiller le bouchon de verre. Boucher soigneusement le tube et l'abandonner dans un bain d'eau à 20 °C durant 16 heures environ (une nuit par exemple). Ajouter au contenu du tube à centrifuger 15 ml d'acétate d'éthyle (3.1.8), reboucher le tube, agiter durant 30 secondes et centrifuger durant 5 minutes en appliquant une force centrifuge de 350 à 400 g. Prélever à la pipette 10 ml de l'acétate d'éthyle d'extraction et les placer dans une fiole conique à bouchon rodé. Ajouter au contenu du tube à centrifuger 5 ml d'acétate d'éthyle (3.1.8). Boucher le tube. Agiter durant 30 secondes et centrifuger pendant 5 minutes à la même vitesse. Prélever 5 ml de l'acétate d'éthyle d'extraction et rajouter ce volume à la solution de la première extraction dans la fiole conique. Homogénéiser le mélange par agitation.3.3.3. Séparation par chromatographie de labis (2,4-dinitrophénylhydrazone): à effectuer dans les 2 heures qui suivent l'extraction (3.3.2) À partir d'une marge de 2 cm au bas de la plaque et de 2 cm latéralement, déposer linéairement sur toute la distance 0,2 ml de l'extrait d'acétate d'éthyle. Placer la phase mobile (3.1.11) dans la cuve sur une hauteur de 1 cm et laisser l'atmosphère de la cuve se saturer des vapeurs des solvants. Introduire la plaque, laisser migrer le solvant jusqu'au bord supérieur de la plaque, sécher la plaque durant une heure sous une hotte ventilée. Décrocher, à l'aide d'une spatule, perpendiculairement à la zone de migration, la zone colorée en rouge (caractéristique de la 2,4-dinitrophénylhydrazone). Recueillir le substrat sur une feuille de papier glacé et le transvaser quantitativement dans une fiole conique à bouchon rodé, ajouter 4 ml d'acide acétique (3.1.12). Laisser en contact durant 30 minutes en agitant fréquemment. Filtrer sur papier plissé directement dans la cuve du spectrophotomètre (3.2.7). Le filtrat obtenu doit être limpide. Régler le zéro de l'échelle des absorbances à 500 nm avec l'acide acétique (3.1.12), mesurer l'absorbance de la solution.3.3.4. Courbe d'étalonnage Placer dans 3 fioles jaugées de 100 ml respectivement 5-10 et 15 ml de solution d'acide L-ascorbique (3.1.13), ajuster au trait repère avec la solution d'acide métaphosphorique à 1 pour 100 (3.1.3). Les solutions obtenues titrent respectivement 50-100-150 mg/litre en acide ascorbique. Traiter 50 ml de chacune de ces solutions selon le mode opératoire décrit en 3.3.1, 3.3.2 et 3.3.3. Tracer la courbe d'étalonnage, elle doit être linéaire et passer par l'origine.3.3.5. Expression des résultats La concentration du vin en acide L-ascorbique + acide déhydroascorbique est exprimée en milligrammes par litre.3.3.5.1. Calcul Porter sur la droite d'étalonnage la valeur de l'absorbance mesurée en 3.3.3, en déduire la concentration en acide L-ascorbique + acide déhydroascorbique de la solution analysée. Remarque: Si la concentration en acide L-ascorbique + acide déhydroascorbique est supérieure à 150 mg/litre, réduire le volume de la prise d'essai à 25,20 ou 10 ml de vin et multiplier le résultat obtenu par le facteur de dilution F. 24. pH 1. PRINCIPE Mesure de la différence de potentiel entre deux électrodes plongées dans le liquide étudié. L'une des électrodes a un potentiel qui est une fonction définie du pH du liquide, l'autre a un potentiel fixe et connu et constitue l'électrode de référence.2. APPAREILS 2.1. pH mètre étalonné en unités pH permettant des mesures à 0,05 unité près au moins. 2.2. Électrodes: 2.2.1. Électrode de verre, à conserver dans l'eau distillée. 2.2.2. Électrode de référence au calomel-chlorure de potassium saturé, à conserver dans une solution saturée de chlorure de potassium. 2.2.3. Ou électrode combinée à conserver dans l'eau distillée.3. RÉACTIFS 3.1. Solutions tampons: 3.1.1. Solution saturée de tartrate acide de potassium. Solution contenant au moins 5,7 g/l de tartrate acide de potassium (C4H5KO6), à 20 °C. Cette solution peut se conserver 2 mois en présence de 0,1 g de thymol pour 200 ml). pH 3,57 à 20 °CpH 3,56 à 25 °CpH 3,55 à 30 °C 3.1.2. Solution 0,05 M de phtalate acide de potassium. Solution contenant 10,211 g/l de phtalate acide de potassium (C8H5KO4), à 20 °C. (Durée maximale de conservation: 2 mois).pH 3,999 à 15 °CpH 4,003 à 20 °CpH 4,008 à 25 °CpH 4,015 à 30 °C 3.1.3. Solution contenant: Phosphate monopotassique, KH2 PO43,402 gPhosphate dipotassique, K2 H PO44,354 gEau q.s.p.1 l (Durée maximale de conservation: 2 mois)pH 6,90 à 15 °CpH 6,88 à 20°CpH 6,86 à 25 °CpH 6,85 à 30 °C Remarque: Les solutions tampons de référence du commerce peuvent également être utilisées.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon à analyser 4.1.1. Cas du moût et du vin Opérer directement sur le moût ou le vin.4.1.2. Cas du moût concentré rectifié Diluer le moût concentré rectifié avec de l'eau pour obtenir une concentration de 25 ± 0,5 pour 100 (m/m) en sucres totaux (25 ° Brix). Si P est la teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux du moût concentré rectifié, peser une masse égale àet compléter à 100 g avec de l'eau. L'eau utilisée doit avoir une conductivité inférieure à 2 microsiemens par centimètre.4.2. Mise au zéro de l'appareil La mise au zéro s'effectue avant toute mesure, en suivant les indications données pour l'appareil utilisé.4.3. Étalonnage du pH mètre L'étalonnage s'effectue à 20 °C en suivant les indications données pour l'appareil utilisé avec les solutions tampons de pH 6,88 et 3,57 à 20 °C. Utiliser la solution tampon de pH 4,00 à 20 °C pour contrôler le calibrage de l'échelle.4.4. Mesure Plonger l'électrode dans l'échantillon analysé dont la température doit être comprise entre 20 et 25 °C et aussi proche que possible de 20 °C. Lire directement sur l'échelle la valeur du pH. Effectuer au moins deux déterminations sur le même échantillon. Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations.5.EXPRESSION DES RÉSULTATS Le pH du moût, du vin ou de la solution à 25 pour 100 (m/m) (25 ° Brix) du moût concentré rectifié est exprimé avec 2 décimales. 25. DIOXYDE DE SOUFRE 1. DÉFINITIONS On appelle dioxyde de soufre, le dioxyde de soufre présent dans le moût ou le vin sous les formes suivantes: H2SO3, H SO3 dont l'équilibre est fonction du pH et de la température:H2SO3 H+ + HSO3 H2SO3 représente le dioxyde de soufre moléculaire. On appelle dioxyde de soufre total l'ensemble des différentes formes de dioxyde de soufre présentes dans le vin à l'état libre ou combiné à ses constituants.2. DIOXYDE DE SOUFRE LIBRE ET TOTAL 2.1. Principe des méthodes 2.1.1. Méthode de référence 2.1.1.1. Cas des vins et des moûts Le dioxyde de soufre est entraîné par un courant d'air ou d'azote; il est fixé et oxydé par barbotage dans une solution diluée et neutre de peroxyde d'hydrogène. L'acide sulfurique formé est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. Le dioxyde de soufre libre est extrait du vin par entraînement à froid (10 °C). Le dioxyde de soufre total est extrait du vin par entraînement à chaud (100 °C environ).2.1.1.2. Cas des moûts concentrés rectifiés Le dioxyde de soufre total est extrait par entraînement à chaud (100 °C environ) du moût concentré rectifié préalablement dilué.2.1.2. Méthode rapide d'essai (cas des vins et des moûts) Le dioxyde de soufre libre est dosé par titrage iodométrique direct. Le dioxyde de soufre combiné est dosé, à la suite, par titrage iodométrique après hydrolyse alcaline. Ajouté au dioxyde de soufre libre, il permet d'obtenir le dioxyde de soufre total.2.2. Méthode de référence 2.2.1. Appareillage 2.2.1.1. L'appareil utilisé doit être conforme au schéma ci-dessous, principalement en ce qui concerne le réfrigérant. Figure 1Les dimensions sont indiquées en millimètres. Les diamètres internes des 4 tubes concentriques qui constituent le réfrigérant sont: 45, 34, 27 et 10 mm Le tube d'amenée des gaz dans le barboteur B est terminé par une petite sphère de 1 cm de diamètre comportant sur son grand cercle horizontal 20 trous de 0,2 mm de diamètre. On peut également le terminer par une plaque de verre fritté assurant la formation d'un grand nombre de très petites bulles réalisant un bon contact des phases gazeuse et liquide. Le débit gazeux qui doit parcourir l'appareil doit être de 40 l/h environ. Le flacon placé à la droite de l'appareil est destiné à limiter de 20 à 30 cm d'eau la dépression produite par la trompe à eau. Pour pouvoir régler cette dépression de manière que le débit soit correct, il y a avantage à placer un débitmètre à tube semi-capillaire entre le barboteur et le flacon. 2.2.1.2. Microburette.2.2.2. Réactifs 2.2.2.1. Acide phosphorique à 85 pour 100 (H3PO4) (r20 = 1,71 g/ml). 2.2.2.2. Solution de peroxyde d'hydrogène à 9,1 g d'H2O2/l (3 volumes). 2.2.2.3. Réactif indicateur: rouge de méthyle100 mgbleu de méthylène 50 mgalcool à 50 % vol.100 ml 2.2.2.4. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), 0,01 M. 2.2.3. Mode opératoire 2.2.3.1. Dosage du dioxyde de soufre libre Le vin doit être maintenu à 20 °C en flacon plein et bouché pendant 2 jours avant le dosage.- Dans le barboteur B, placer 2 à 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène (2.2.2.2) Il gouttes de réactif indicateur et neutraliser la solution de peroxyde d'hydrogène par la solution 0,01 M d'hydroxyde de sodium (2.2.2.4). Adapter ce barboteur à l'appareil.- Dans le ballon A de 250 ml de l'appareil à entraînement, introduire 50 ml d'échantillon et 15 ml d'acide phosphorique (2.2.2.1). Mettre en place le ballon.Faire ensuite barboter l'air (ou l'azote) pendant 15 minutes. Le dioxyde de soufre libre entraîné est oxydé en acide sulfurique. Retirer le barboteur de l'appareil et titrer l'acide formé par la solution d'hydroxyde de sodium 0,01 M (2.2.2.4). Soit n le nombre de millilitres versés.2.2.3.2. Expression des résultats Le dioxyde de soufre libre est exprimé en milligrammes par litre (mg/l) sans décimale. 2.2.3.2.1. Calcul Dioxyde de soufre libre en milligrammes par litre: 6,4 n.2.2.3.3. Dosage du dioxyde de soufre total 2.2.3.3.1. Dans le cas des moûts concentrés rectifiés, utiliser la solution obtenue en diluant l'échantillon à analyser à 40 pour 100 (m/v) comme il est indiqué au chapitre «Acidité totale» en 5.1.2. Dans le ballon A de 250 ml de l'appareil à entraînement, introduire 50 ml de cette solution et 5 ml d'acide phosphorique (2.2.2.1). Mettre en place le ballon. 2.2.3.3.2. Cas des vins et des moûts Teneur présumée de l'échantillonE50 mg/l SO2 total. Dans le ballon A de 250 ml de l'appareil à entraînement, introduire 50 ml d'échantillon et 15 ml d'acide phosphorique (2.2.2.1). Mettre en place le ballon. Toutefois, jusqu'au 31 décembre 1992 au plus tard, pour analyser la teneur en dioxyde de soufre des jus de raisins on emploie 5 ml d'acide phosphorique (2.2.2.1) dilué à 25 pour 100 (m/v). 2.2.3.3.3. Teneur présumée de l'échantillon F50 mg/l de SO2 total. Dans le ballon A de 100 ml de l'appareil à entraînement, introduire 20 ml d'échantillon et 5 ml d'acide phosphorique (2.2.2.1). Mettre en place le ballon. Placer dans le barboteur B 2 à 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène (2.2.2.2), la neutraliser comme précédemment, porter le vin contenu dans le ballon A à l'ébullition au moyen d'une petite flamme de 4 à 5 cm de haut qui doit lécher directement le fond du ballon. Ne pas placer sous le ballon une toile métallique, mais le poser sur un disque percé d'un trou de 30 mm de diamètre. On évite ainsi la pyrogénation des matières extractives du vin sur les parois du ballon. Maintenir l'ébullition pendant le passage du courant d'air (ou d'azote). En 15 minutes, le dioxyde de soufre total a été entraîné et oxydé. Doser l'acide sulfurique formé par la solution 0,01 M d'hydroxyde de sodium (2.2.2.4). Soit n le nombre de millilitres versés.2.2.3.4. Expression des résultats Le dioxyde de soufre total est exprimé en milligrammes par litre (mg/l) respectivement en milligrammes par kilogramme (mg/kg) de sucres totaux sans décimale. 2.2.3.4.1. Calcul - Cas des vins et des moûtsDioxyde de soufre total en milligrammes par litre.- Échantillons pauvres en dioxyde de soufre (prise d'essai 50 ml): 6,4 · n- Autres échantillons (prise d'essai 20 ml): 16 · n - Cas des moûts concentrés rectifiésDioxyde de soufre en milligrammes par kilo de sucres totaux (prise d'essai 50 ml d'échantillon préparé) (2.2.3.3.1):P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux 2.2.3.4.2. Répétabilité (r)Teneur < 50 mg/l (prise d'essai de 50 ml), r = 1 mg/lTeneur > 50 mg/l (prise d'essai de 20 ml), r = 6 mg/l 2.2.3.4.3. Reproductibilité (R)Teneur < 50 mg/l (prise d'essai de 50 ml), R = 9 mg/lTeneur > 50 mg/l (prise d'essai de 20 ml), R = 15 mg/l2.3. Méthode rapide d'essai 2.3.1. Réactifs 2.3.1.1. EDTA (Complexon III): sel disodique de l'acide éthylène diamine tétracétique (C10H14N2Na2O8, 2H2O). 2.3.1.2. Solution 4 M d'hydroxyde de sodium NaOH (160 g/l). 2.3.1.3. Acide sulfurique H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml, solution au 1/10e (v/v). 2.3.1.4. Empois d'amidon solution à 5 g/l. Délayer 5 g d'amidon dans 500 ml d'eau environ. Porter à ébullition en agitant et maintenir l'ébullition pendant 10 minutes; ajouter 200 g de chlorure de sodium (NaCl). Porter au litre après refroidissement. 2.3.1.5. Solution 0,025 M d'iode (I2).2.3.2. Matériel 2.3.2.1. Fioles coniques de 500 ml. 2.3.2.2. Burette. 2.3.2.3. Pipettes de 1, 2, 5 et 50 ml.2.3.3. Mode opératoire 2.3.3.1. Dioxyde de soufre libre Dans une fiole conique de 500 ml, placer:- 50 ml de vin- 5 ml d'empois d'amidon (2.3.1.4)- 30 mg de EDTA (2.3.1.1)- 3 ml de H2SO4 au 1/10e (v/v) (2.3.1.3) Titrer immédiatement par l'iode 0,025 M (2.3.1.5) jusqu'à ce que la coloration bleue persiste nettement durant 10 à 15 secondes. Soit n ml le volume d'iode utilisé.2.3.3.2. Dioxyde de soufre combiné Ajouter 8 ml de solution 4 M d'hydroxyde de sodium (2.3.1.2), agiter une seule fois et laisser 5 minutes en contact. Verser d'un seul coup et en agitant énergiquement le contenu d'un petit vase cylindrique dans lequel 10 ml d'acide sulfurique au 1/10e (2.3.1.3) avaient été placés. Titrer immédiatement par l'iode 0,025 M, (2.3.1.5). Soit n' le volume d'iode employé. Ajouter 20 ml de solution 4 M d'hydroxyde de sodium (2.3.1.2), laisser en contact 5 minutes après avoir agité une seule fois. Diluer avec 200 ml d'eau aussi froide que possible. En agitant énergiquement, verser d'un seul coup 30 ml d'acide sulfurique au 1/10e (2.3.1.3) préalablement placés dans une éprouvette. Titrer par l'iode 0,025 M (2.3.1.5) le dioxyde de soufre libéré. Soit n" le volume d'iode employé.2.3.4. Expression des résultats 2.3.4.1. Calcul Dioxyde de soufre libre en milligrammes par litre : 32 n Dioxyde de soufre total en milligrammes par litre : 32 (n + n2 + n"). Remarques:1. Pour les vins rouges pauvres en SO2 il y a intérêt à employer de l'iode plus dilué que 0,025 M, par exemple : 0,01M. Remplacer le coefficient 32 par 12,8 dans les formules ci-dessus.2. Pour les vins rouges, il y a avantage à éclairer le vin par-dessous avec un faisceau de lumière jaune obtenue à l'aide d'une ampoule électrique ordinaire et d'une solution de chromate de potassium ou à l'aide d'une lampe à vapeur de sodium. Il faut se placer dans une chambre noire et observer la transparence du vin, qui devient opaque dès que le virage de l'empois est atteint.3. Lorsque la quantité de dioxyde de soufre trouvée avoisine ou dépasse la limite légale, il convient de doser le dioxyde de soufre total par la méthode de référence.4. Lorsqu'on attache un intérêt particulier au dosage du dioxyde de soufre, il sera conventionnellement déterminé sur un échantillon maintenu pendant 2 jours à l'abri de l'air à la température de 20 °C avant l'analyse: celle-ci sera également exécutée à cette température.5. Étant donné que certaines substances sont oxydées par l'iode en milieu acide, il est nécessaire - pour des dosages plus précis - d'évaluer la quantité d'iode ainsi utilisée. Pour cela, il faut combiner le dioxyde de soufre libre par un excès d'éthanal ou de propanal, avant d'effectuer le titrage par l'iode. À 50 ml de vin placés dans une fiole conique de 300 ml, ajouter 5 ml de solution d'éthanal (C2H4O à 7 g/l) ou 5 ml d'une solution de propanal (C3H6O) à 10 g/l.Boucher et laisser au repos 30 minutes au moins. Ajouter 3 ml d'acide sulfurique au 1/10e (2.3.1.3) et de l'iode 0,025 M (2.3.1.5) en quantité suffisante pour faire virer l'empois d'amidon. Soit n4 le volume d'iode employé. Il doit être retranché de n (dioxyde de soufre libre) et de n + n2 + n" (dioxyde de soufre total).n4 est généralement faible: 0,2 à 0,3 ml d'iode 0,025 M. Si le vin a été additionné d'acide ascorbique, n4 est beaucoup plus élevé et on peut, au moins approximativement, mesurer la quantité de ce produit par la valeur de n4 sachant que 1 ml d'iode 0,025 M oxyde 4,4 mg d'acide ascorbique. Par la mesure de n4, on peut ainsi déceler sans difficultés les vins qui ont été additionnés d'acide ascorbique en quantité supérieure à 20 mg/l et qui ne s'est pas transformé en produits d'oxydation.3. DIOXYDE DE SOUFRE MOLÉCULAIRE 3.1. Principe de la méthode Le pourcentage de dioxyde de soufre moléculaire, H2SO3, dans le dioxyde de soufre libre, est évalué en fonction du pH, du titre alcoométrique et de la température. Pour une température et un titre alcoométrique donnés:H2SO3 H+ + HSO3-I = force ioniqueA et B = coefficients qui varient avec la température et le titre alcoométriqueKT = constante thermodynamique de dissociation; la valeur de pkT est donnée dans le tableau 1 en fonction du titre alcoométrique et de la températureKM = constante mixte de dissociation En prenant pour la force ionique i la valeur moyenne 0,038 le tableau 2 donne les valeurs de pkM en fonction de la température et du titre alcoométrique. La teneur en dioxyde de soufre moléculaire calculée à partir de la relation (1) est donnée dans le tableau 3 en fonction du pH, de la température et du titre alcoométrique.3.2. Calcul Connaissant le pH du vin, son titre alcoométrique, le pourcentage de dioxyde de soufre moléculaire est donné par le tableau 3 pour la température t °C; soit X %. Teneur en dioxyde de soufre moléculaire en mg/l:X · CC = teneur en dioxyde de soufre libre en mg/l. TABLEAU 1Valeurs de la constante thermodynamique pkT TABLEAU 2Valeurs de la constante mixte pkM (I = 0,038) TABLEAU 3Dioxyde de soufre moléculaire en pourcentage du dioxyde de soufre libre (I = 0,038) TABLEAU 3 (suite)Dioxyde de soufre moléculaire en pourcentage du dioxyde de soufre libre (I = 0,038) 26. SODIUM 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence: spectrophotométrie d'absorption atomique Le sodium est dosé directement dans le vin par spectrophotométrie d'absorption atomique après addition d'un tampon spectral de chlorure de césium pour éviter l'ionisation du sodium.1.2. Méthode usuelle: photométrie de flamme Le sodium est dosé directement dans le vin dilué au moins 1/10e par photométrie de flamme.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Réactifs 2.1.1. Solution de sodium à 1 g par litre Utiliser une solution standard de sodium du commerce à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 2,542 g de chlorure de sodium NaCl, desséché, dans de l'eau distillée et en ajustant le volume à 1 litre. Conserver cette solution dans un flacon en polyéthylène.2.1.2. Solution modèle Acide citrique C6H8O7, H2O 3,5 gSaccharose C12H22O11 1,5 gGlycérol C3H8O3 5,0 gChlorure de calcium anhydre Ca Cl2 50 mgChlorure de magnésium anhydre Mg Cl2 50 mgAlcool absolu C2H5OH 50 mlEau q.s.p.500 ml2.1.3. Solution de chlorure de césium à 5 pour 100 en césium Dissoudre 6,330 g de chlorure de césium, Cs Cl, dans 100 ml d'eau distillée.2.2. Appareils 2.2.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 2.2.2. Lampe à cathode creuse au sodium.2.3. Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon Prélever 2,5 ml de vin, les placer dans une fiole jaugée de 50 ml, ajouter 1 ml de la solution de chlorure de césium (2.1.3) et amener au trait repère avec de l'eau distillée.2.3.2. Étalonnage Dans une série de fioles jaugées de 100 ml introduire 5,0 ml de solution modèle, placer 0 - 2,5 - 5 - 7,5 - 10 ml de la solution de sodium à 1 g/l (2.1.1) préalablement diluée 1/100, ajouter dans toutes les fioles 2 ml de la solution de chlorure de césium (2.1.3) et ajuster le volume à 100 ml avec de l'eau distillée. Les solutions étalons préparées titrent respectivement 0 - 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1,00 mg de sodium par litre et contiennent 1 g de césium par litre. Ces solutions seront conservées dans des flacons en polyéthylène.2.3.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 589,0 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec la solution modèle contenant 1 g de césium par litre (2.3.2). Aspirer directement le vin dilué dans le brûleur du spectrophotomètre puis successivement les solutions étalons (2.3.2). Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.2.4. Expression des résultats 2.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en sodium des solutions étalons. Reporter la valeur moyenne des absorbances obtenues pour l'échantillon sur cette courbe et déterminer la concentration C en sodium en milligrammes par litre. La concentration en sodium exprimée en milligrammes par litre de vin sans décimale sera:20 · C2.4.2. Répétabilité (r) r = 1 + 0,024 ximg/lxi = concentration en sodium de l'échantillon en mg/l.2.4.3. Reproductibilité (R) R = 2,5 + 0,05 xi mg/lxi = concentration en sodium de l'échantillon en mg/l.3. Méthode usuelle 3.1. Réactifs 3.1.1. Solution étalon de sodium à 20 mg par litre Alcool absolu (C2H5OH) 10 mlAcide citrique (C6H8O7, H2O) 700 mgSaccharose (C12H22O11) 300 mgGlycérol (C3H8O3)1 000 mgTartrate acide de potassium (C4H5KO6) 481,3 mgChlorure de calcium anhydre (Ca Cl2) 10 mgChlorure de magnésium anhydre (Mg Cl2) 10 mgChlorure de sodium desséché (NaCl) 50,84 mgEau q.s.p. 1 l3.1.2. Solution de dilution Alcool absolu (C2H5OH) 10 mlAcide citrique (C6H8O7, H2O) 700 mgSaccharose (C12H22O11) 300 mgGlycérol (C3H8O3)1 000 mgTartrate acide de potassium (C4H5KO6) 481,3 mgChlorure de calcium anhydre (Ca Cl2) 10 mgChlorure de magnésium anhydre (Mg Cl2) 10 mgEau q.s.p. 1 l Pour préparer les solutions 3.1.1 et 3.1.2, dissoudre le tartrate acide de potassium dans 500 ml environ d'eau distillée très chaude, mélanger la solution aux autres constituants préalablement dissous dans 400 ml d'eau distillée et ajuster à 1 litre. Ces solutions additionnées de 2 gouttes d'isothiocyanate d'allyle seront conservées dans des flacons en polyéthylène.3.2. Appareil 3.2.1. Photomètre de flamme alimenté par un mélange air-butane.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Étalonnage Dans cinq fioles jaugées de 100 ml, placer 5 - 10 - 15 - 20 - 25 ml de la solution de sodium à 20 mg/l (3.1.1) et compléter à 100 ml avec la solution de dilution (3.1.2). On obtient ainsi des solutions contenant respectivement 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg de sodium par litre.3.3.2. Dosage Effectuer les mesures à 589,0 nm. Régler le 100 % de transmission avec de l'eau distillée. Aspirer directement dans le brûleur du photomètre, successivement les solutions-étalons (3.3.1), puis le vin dilué au 1/10e avec de l'eau distillée et relever les pourcentages de transmission. Si cela est nécessaire, diluer le vin déjà dilué au 1/10e avec la solution de dilution (3.1.2).3.4. Expression des résultats 3.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe des variations du pourcentage de transmission en fonction de la concentration en sodium des solutions étalons. Reporter la transmission obtenue pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et relever la concentration C en sodium. La concentration en milligrammes de sodium par litre sans décimale sera:C · FF = Facteur de dilution.3.4.2. Répétabilité (r) (Sauf vins de liqueur) : r = 1,4 mg/lVins de liqueur r = 2,0 mg/l.3.4.3. Reproductibilité (R) R = 4,7 + 0,08 xi mg/l.xi = concentration en sodium de l'échantillon en mg/l. 27. POTASSIUM 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence Le potassium est dosé directement dans le vin dilué par spectrophotométrie d'absorption atomique après addition d'un tampon spectral de chlorure de césium pour éviter l'ionisation du potassium.1.2. Méthode usuelle Le potassium est dosé directement dans le vin dilué par photométrie de flamme.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Réactifs 2.1.1. Solution de potassium à 1 g par litre Utiliser une solution standard de potassium du commerce à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 4,813 g de tartrate acide de potassium (C4H5KO6) dans de l'eau distillée et en ajustant le volume à 1 litre. 2.1.2. Solution modèle Acide citrique (C6H8O7, H2O) 3,5 gSaccharose (C12H22O11) 1,5 gGlycérol (C3H8O3) 5,0 gChlorure de calcium anhydre (Ca Cl2) 50 mgChlorure de magnésium anhydre (Mg Cl2) 50 mgAlcool absolu (C2H5OH) 50 mlEau q.s.p.500 ml2.1.3. Solution de chlorure de césium à 5 pour 100 en césium Dissoudre 6,330 g de chlorure de césium (Cs Cl) dans 100 ml d'eau distillée.2.2. Appareils 2.2.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 2.2.2. Lampe à cathode creuse au potassium.2.3. Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon Prélever 2,5 ml de vin (préalablement dilué 1/10e), les placer dans une fiole jaugée de 50 ml, ajouter 1 ml de la solution de chlorure de césium (2.1.3) et amener au trait de jauge avec de l'eau distillée.2.3.2. Étalonnage Dans une série de fioles jaugées de 100 ml, introduire 5 ml de solution modèle (2.1.2) placer 0 - 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 ml de la solution de potassium à 1 g par litre (2.1.1) (préalablement diluée au 1/10e), ajouter dans toutes les fioles 2 ml de la solution de chlorure de césium (2.1.3), ajuster le volume à 100 ml avec de l'eau distillée. Les solutions-étalons préparées titrent respectivement 0 - 2 - 4 - 6 - 8 mg de potassium par litre et contiennent 1 g de césium par litre. Ces solutions seront conservées dans des flacons en polyéthylène.2.3.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 769,9 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec la solution modèle contenant 1 g de césium par litre (2.3.2). Aspirer directement le vin dilué (2.3.1) dans le brûleur du spectrophotomètre puis successivement les solutions étalons (2.3.2); relever les absorbances. Effecteur les déterminations en double.2.4. Expression des résultats 2.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en potassium des solutions-étalons. Reporter la valeur moyenne des absorbances obtenues pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et déterminer la concentration C en potassium en milligrammes par litre. La concentration en potassium exprimée en milligrammes par litre de vin, sans décimale, sera: F· CF = facteur de dilution (ici 200).2.4.2. Répétabilité (r)r = 35 mg/l. 2.4.3. Reproductibilité (R)R = 66 mg/l.2.4.4. Autres expressions des résultats - en milliéquivalents par litre: 0,0256 · F · C- en tartrate acide de potassium en milligrammes par litre4,813 · F · C.3. MÉTHODE USUELLE: SPECTROPHOTOMÉTRIE DE FLAMME 3.1. Réactifs 3.1.1. Solution de référence à 100 mg de potassium par litre Alcool absolu (C2H5OH) 10 mlAcide citrique (C6H8O7, H2O) 700 mgSaccharose (C12H22O11) 300 mgGlycérol (C3H8O3)1 000 mgChlorure de sodium (NaCl) 50,8 mgChlorure de calcium anhydre (Ca Cl2) 10 mgChlorure de magnésium anhydre (Mg Cl2) 10 mgTartrate acide de potassium desseché (C4H5KO6) 481,3 mgEau q.s.p.1 000 ml Dissoudre le tartrate acide de potassium dans environ 500 ml d'eau distillée très chaude, mélanger la solution aux autres constituants préalablement dissous dans 400 ml d'eau distillée et ajuster à 1 litre.3.1.2. Solution de dilution Alcool absolu (C2H5OH) 10 mlAcide citrique (C6H8O7, H2O) 700 mgSaccharose (C12H22O11) 300 mgGlycérol (C3H8O3)1 000 mgChlorure de sodium (NaCl) 50,8 mgChlorure de calcium anhydre (Ca Cl2) 10 mgChlorure de magnésium anhydre (Mg Cl2) 10 mgAcide tartrique (C4H6O6) 383 mgEau q.s.p.1 000 ml Ces solutions, additionnées de 2 gouttes d'isothiocyanate d'allyle seront conservées dans des flacons en polyéthylène.3.2. Appareils 3.2.1. Photomètre à flamme alimenté par un mélange air-butane.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Étalonnage Dans quatre fioles jaugées de 100 ml, placer 25 - 50 - 75 - 100 ml de la solution de référence (3.1.1) et compléter à 100 ml avec la solution de dilution (3.1.2). On obtient ainsi des solutions contenant respectivement 25 - 50 - 75 - 100 mg par litre de potassium.3.3.2. Dosage Effectuer les mesures à 766 nm. Régler le 100 % de transmission avec de l'eau distillée. Aspirer directement dans le brûleur du photomètre, successivement les solutions-étalons (3.3.1), puis le vin dilué au 1/10e avec de l'eau distillée et relever les pourcentages de transmission. Si cela est nécessaire, diluer à nouveau le vin déjà dilué au 1/10e, avec la solution de dilution (3.1.2).3.4. Expression des résultats 3.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation des pourcentages de transmission en fonction de la concentration en potassium des solutions-étalons. Reporter la transmission obtenue pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et déterminer la concentration C en potassium. La concentration en milligrammes de potassium par litre sans décimale sera:C · FF = facteur de dilution.3.4.2.Répétabilité (r) r = 17 mg/l.3.4.3. Reproductibilité (R) R = 66 mg/l.3.4.4. Autres expressions des résultats: - en milliéquivalents par litre: 0,0256 · F · C- en tartrate acide de potassium en milligrammes par litre: 4,813 · F · C. 28. MAGNÉSIUM 1. PRINCIPE Le magnésium est dosé directement dans le vin convenablement dilué par spectrophotométrie d'absorption atomique.2. RÉACTIFS 2.1. Solution étalon concentrée de magnésium titrant 1 g par litre Utiliser une solution standard de magnésium du commerce, à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 8,3646 g de chlorure de magnésium (MgCl2, 6 H2O) dans de l'eau distillée et en ajustant le volume à 1 litre.2.2. Solution étalon diluée de magnésium titrant 5 mg par litre Remarque: Conserver les solutions-étalons de magnésium dans des flacons en polyéthylène.3. APPAREILLAGE 3.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 3.2. Lampe à cathode creuse au magnésium.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1.Préparation de l'échantillon Diluer le vin au 1/100e avec de l'eau distillée.4.2. Étalonnage Dans une série de fioles jaugées de 100 ml, placer 5 - 10 - 15 et 20 ml de la solution 2.2 et compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Les solutions préparées titrent respectivement 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1 mg de magnésium par litre. Ces solutions seront conservées dans des flacons en polyéthylène.4.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 285 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau distillée. Aspirer directement le vin dilué dans le brûleur du spectrophotomètre, puis successivement les solutions-étalons préparées en 4.2. Relever les absorbances; effectuer les déterminations en double.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en magnésium des solutions-étalons. Reporter la valeur moyenne des absorbances obtenues pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et déterminer la concentration en C en magnésium. La concentration en magnésium exprimée en milligrammes par litre de vin sans décimale sera:100 · C.5.2. Répétabilité (r) r = 3 mg/l.5.3. Reproductibilité (R) R = 8 mg/l. 29. CALCIUM 1. PRINCIPE Le calcium est dosé directement dans le vin convenablement dilué par spectrophotométrie d'absorption atomique, après addition d'un tampon spectral.2. RÉACTIFS 2.1. Solution étalon de calcium titrant 1 g par litre Utiliser une solution standard de calcium du commerce, à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 2,5 g de carbonate de calcium (Ca CO3), dans la quantité suffisante de HCl dilué au 1/10e (v/v) pour obtenir sa dissolution et en ajustant le volume à 1 litre avec de l'eau distillée.2.2. Solution étalon diluée de calcium titrant 50 mg par litre Remarque: Conserver les solutions-étalons de calcium dans des flacons en polyéthylène.2.3. Solution de chlorure de lanthane à 50 g/l en lanthane Dissoudre 13,369 g de chlorure de lanthane (La Cl3, 7 H2O), dans de l'eau distillée; ajouter 1 ml de HCl dilué 1/10 (v/v) et ajuster le volume à 100 ml.3. APPAREILLAGE 3.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 3.2. Lampe à cathode creuse au calcium.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Dans une fiole jaugée de 20 ml, placer 1 ml de vin, 2 ml de solution 2.3 et amener au trait de jauge avec de l'eau distillée. Le vin dilué au 1/20e titre 5 g de lanthane par litre. Remarque: Pour les vins doux, la concentration de 5 g de lanthane par litre est suffisante à condition que la dilution amène la teneur en sucres à moins de 2,5 g par litre. Pour des concentrations supérieures en sucres, il est nécessaire de porter à 10 g par litre la teneur en lanthane.4.2. Étalonnage Dans cinq fioles jaugées de 100 ml placer 0 - 5 - 10 - 15 et 20 ml de la solution 2.2, ajouter dans toutes les fioles 10 ml de la solution 2.3 et ajuster le volume à 100 ml avec de l'eau distillée. Les solutions-étalons préparées titrent respectivement 0 - 2,5 - 5 - 7,5 et 10 mg de calcium par litre et contiennent 5 g de lanthane par litre. Ces solutions seront conservées dans des flacons en polyéthylène.4.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 422,7 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec la solution contenant 5 g de lanthane par litre (4.2). Aspirer directement le vin dilué dans le brûleur du spectrophotomètre, puis successivement les solutions-étalons préparées en 4.2. Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en calcium des solutions-étalons. Reporter la valeur moyenne des absorbances obtenues pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et déterminer sa concentration C en calcium. La concentration en calcium exprimé en milligrammes par litre de vin sans décimale sera: 20 · C5.2. Répétabilité (r) Teneur < 60 mg/l: r = 2,7 mg/lTeneur > 60 mg/l: r = 4 mg/l.5.3.Reproductibilité (R) R = 0,114 ×i - 0,5×i = concentration en mg/l de l'échantillon. 30. FER 1. PRINCIPE DES MÉTHODES MÉTHODE DE RÉFÉRENCE Après dilution convenable du vin et élimination de l'alcool, le fer est dosé directement par spectrophotométrie d'absorption atomique. MÉTHODE USUELLE Après minéralisation du vin par le perhydrol, le fer qui se trouve à l'état de fer III est réduit à l'état de fer II est dosé grâce à la coloration rouge qu'il donne avec l'orthophénanthroline.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Réactifs 2.1.1. Solution étalon concentrée de fer III titrant 1 g par litre. Utiliser une solution standard du commerce à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 8,6341 g de sulfate de fer III et d'ammonium (FeNH4(SO4)2, 12H2O) dans de l'eau distillée légèrement acidifiée par de l'acide chlorhydrique M et en ajustant le volume à 1 litre. 2.1.2. Solution étalon diluée de fer titrant 100 milligrammes par litre.2.2. Appareillage 2.2.1. Évaporateur rotatif avec bain d'eau thermostaté. 2.2.2. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 2.2.3. Lampe à cathode creuse en fer.2.3. Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon Éliminer l'alcool du vin par concentration du volume de l'échantillon au demi à l'aide d'un évaporateur rotatif (50-60 °C). Ramener au volume initial avec de l'eau distillée. Effectuer si nécessaire une dilution préalablement au dosage.2.3.2. Étalonnage Dans cinq fioles jaugées de 100 ml, placer 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml de la solution de fer à 100 milligrammes par litre (2.1.2) et compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Les solutions préparées titrent respectivement 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg de fer par litre. Ces solutions seront conservées dans des flacons en polyéthylène.2.3.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 248,3 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau distillée. Aspirer directement l'échantillon dilué dans le brûleur du spectrophotomètre puis successivement les solutions-étalons préparées en 2.3.2. Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.2.4. Expression des résultats 2.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en fer des solutions-étalons. Reporter la valeur moyenne de l'absorbance obtenue pour l'échantillon de vin dilué sur cette courbe et déterminer la concentration en fer C. La concentration en fer exprimée en milligrammes par litre de vin avec 1 décimale sera:C · FF = facteur de dilution.3. MÉTHODE USUELLE 3.1. Réactifs 3.1.1. Solution de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à 30 pour 100 (m/g) exempt de fer. 3.1.2. Solution d'acide chlorhydrique, exempt de fer, 1 M. 3.1.3. Hydroxyde d'ammonium, NH4OH (r20 = 0,92 g/ml). 3.1.4. Pierre ponce traitée par l'acide chlorhydrique au 1/2 bouillant et lavée avec de l'eau distillée. 3.1.5. Solution d'hydroquinone (C6H6O2) à 2,5 pour 100, acidifiée par 1 ml d'acide sulfurique pur (r20 = 1,84 g/ml) pour 100 ml de solution. Cette solution est conservée dans un flacon jaune au réfrigérateur et remplacée dès apparition du moindre brunissement. 3.1.6. Solution de sulfite de sodium (NA2SO3) à 20 pour 100 préparée à partir du sulfite neutre et anhydre. 3.1.7. Solution d'orthophénantroline (C12H8N2, H2O) à 0,5 pour 100 dans l'alcool à 96 % vol. 3.1.8. Solution d'acétate d'ammonium (CH3 COONH4) à 20 pour 100 (m/v). 3.1.9. Solution de fer III à 1 g de fer par litre. Utiliser une solution standard du commerce. Cette solution peut être préparée en dissolvant 8,6341 g de sulfate de fer et d'ammonium (NH4Fe(SO4)2, 12H2O) dans 100 ml de solution 1M d'acide chlorhydrique (3.1.2) et en ajustant le volume à 1 litre avec la solution 1M d'acide chlorhydrique (3.1.2). 3.1.10 Solution étalon diluée de fer à 100 milligrammes par litre.3.2. Appareillage 3.2.1. Fiole ovoïde de Kjeldahl de 100 ml. 3.2.2. Spectrophotomètre permettant d'effectuer des mesures à la longueur d'onde de 508 nm.3.3. Mode opératoire 3.3.1.Minéralisation 3.3.1.1. Vin dont la teneur en sucres est inférieure à 50 g/l Dans la fiole de Kjeldahl introduire 25 ml de vin, 10 ml de solution de peroxyde d'hydrogène (3.1.1) et quelques grains de pierre ponce (3.1.4). Concentrer le liquide jusqu'à un volume de 2 à 3 ml. Après refroidissement, ajouter au résidu obtenu, sans mouiller les parois du ballon, de l'hydroxyde d'ammonium (3.1.3) en quantité nécessaire pour alcaliniser le milieu et précipiter les hydroxydes. Après refroidissement, additionner le liquide alcalin de solution 1M d'acide chlorhydrique (3.1.2) en quantité nécessaire pour dissoudre le précipité des hydroxydes et transvaser la solution obtenue dans une fiole jaugée de 100 ml. Après rinçage de la fiole de Kjeldahl avec la solution M d'acide chlorhydrique (3.1.2), ajuster le volume à 100 ml à l'aide de la même solution.3.3.1.2. Moûts et vins dont la teneur en sucres est supérieure à 50 g/l 3.3.1.2.1. Teneur en sucres comprise entre 50 et 200 g/l:la prise d'essai de 25 ml de moût ou de vin est traitée par 20 ml de solution de peroxyde d'hydrogène (3.1.1).Continuer comme il est décrit en 3.3.1.1. 3.3.1.2.2. Teneur en sucres supérieure à 200 g/l:les échantillons de moût ou de vin doivent être préalablement dilués au 1/2 ou même au 1/4 et traités selon le mode opératoire 3.3.1.2.1.3.3.2. Essai à blanc Effectuer un essai à blanc avec de l'eau distillée en employant le même volume de solution de peroxyde d'hydrogène (3.1.1) que celui utilisé pour la minéralisation et en suivant le protocole expérimental décrit en 3.3.1.1.3.3.3. Dosage Prélever 20 ml de la solution chlorhydrique du produit de minéralisation de l'échantillon (3.3.1.1) et 20 ml de la solution chlorhydrique «essai à blanc» (3.3.2) et les introduire dans deux fioles jaugées de 50 ml. Ajouter dans chaque fiole 2 ml de la solution d'hydroquinone (3.1.5), 2 ml de la solution de sulfite (3.1.6) et 1 ml de la solution d'orthophénanthroline (3.1.7). Laisser au repos pendant 15 minutes pour favoriser la réduction du Fe III en Fe II. Ajouter 10 ml de la solution d'acétate d'ammonium (3.1.8), ajuster le volume à 50 ml avec de l'eau distillée et agiter les deux fioles jaugées. Mesurer l'absorbance à 508 nm de la solution à doser en réglant le zéro de l'échelle des absorbances avec la solution provenant de l'essai à blanc.3.3.4. Étalonnage Dans quatre fioles jaugées de 50 ml, placer 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ml de la solution à 100 mg de fer par litre (3.1.10), 20 ml d'eau distillée; continuer selon le mode opératoire décrit en 3.3.3. Ces solutions correspondent respectivement à 50 - 100 - 150 - 200 microgrammes de fer dans la prise d'essai.3.4. Expression des résultats 3.4.1. Mode de calcul Tracer la courbe des variations de l'absorbance en fonction de la concentration en fer des solutions étalons. Reporter l'absorbance obtenue pour la solution à examiner et déterminer la concentration en fer C contenue dans la prise d'essai de 20 ml de solution chlorhydrique de minéralisation, c'est-à-dire dans 5 ml d'échantillon à analyser. La concentration en fer exprimée en milligrammes par litre de vin avec 1 décimale sera:200 · C. Si le vin (ou le moût) a été dilué, la concentration en fer exprimée en milligrammes par litre de vin avec 1 décimale sera:200 · C · F.F = facteur de dilution. 31. CUIVRE 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Emploi de la spectrophotométrie d'absorption atomique.2. APPAREILS 2.1. Capsule de platine. 2.2. Spectrophotomètre d'absorption atomique. 2.3. Lampe à cathode creuse au cuivre. 2.4. Gaz d'alimentation: air/acétylène ou protoxyde d'azote/acétylène.3. RÉACTIFS 3.1. Cuivre métal. 3.2. Acide nitrique concentré 65 % (HNO3,r20 = 1,38 g/ml). 3.3. Acide nitrique dilué 1/2 (v/v).3.4. Solution de cuivre à 1 g/l Utiliser une solution standard de cuivre du commerce, a 1 g/l. Cette solution peut être préparée en pesant 1,000 g de cuivre métal et en transférant quantitativement dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Ajouter de l'acide nitrique dilué 1/2 (3.3), en quantité strictement suffisante pour dissoudre le métal, ajouter 10 ml d'acide nitrique concentré (3.2), porter au trait repère avec de l'eau bidistillée.3.5. Solution de cuivre à 100 mg/l Prélever 10 ml de la solution 3.4 et les placer dans une fiole jaugée de 100 ml en complétant le volume avec de l'eau bidistillée.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon et dosage du cuivre Si nécessaire préparer une dilution appropriée avec de l'eau bidistillée.4.2. Étalonnage Prélever 0,5 - 1 - 2 ml de solution 3.5 (100 mg de cuivre par litre), les placer dans des fioles jaugées de 100 ml en complétant le volume avec de l'eau bidistillée; les solutions obtenues contiennent respectivement 0,5 - 1 - 2 mg/l de cuivre.4.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 324,8 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau bidistillée. Aspirer directement l'échantillon dilué dans le brûleur du spectrophotomètre puis successivement les solutions-étalons préparées en 4.2. Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en cuivre des solutions-étalons. Reporter l'absorbance lue pour l'échantillon du vin dilué sur la courbe d'étalonnage et relever la concentration C en mg/l. Si F est le facteur de dilution, la teneur du vin en cuivre en milligrammes par litre est: F · C. Elle est donnée avec 2 décimales. Remarques:a) Les solutions pour l'établissement de la courbe d'étalonnage et les dilutions de l'échantillon doivent toutefois être choisies en fonction de la sensibilité de l'appareil utilisé et de la concentration en cuivre présente dans l'échantillon. b) Pour des concentrations très faibles en cuivre dans l'échantillon, le mode opératoire est le suivant: placer 100 ml d'échantillon dans une capsule de platine, évaporer au bain d'eau à 100 °C jusqu'à consistance sirupeuse, ajouter goutte à goutte 2,5 ml d'acide nitrique concentré (3.2) en cherchant à recouvrir tout le fond de la capsule. Procéder avec précaution à l'incinération du résidu sur une plaque chauffante électrique ou bien sur une petite flamme; introduire ensuite la capsule dans un four à moufle réglé à 500 °C ± 25 °C, la laisser pendant environ une heure. Après refroidissement, humecter les cendres avec 1 ml d'acide nitrique concentré (3.2) en les écrasant avec une petite baguette de verre, évaporer et incinérer à nouveau comme précédemment. Porter à nouveau la capsule dans le four pendant 15 minutes; répéter au moins trois fois ce traitement avec l'acide nitrique concentré. Solubiliser les cendres en ajoutant dans la capsule 1 ml d'acide nitrique concentré (3.2) et 2 ml d'eau bidistillée; transvaser dans une fiole jaugée de 10 ml. Laver la capsule trois fois avec 2 ml chaque fois d'eau bidistillée, compléter au trait repère avec de l'eau bidistillée. 32. CADMIUM 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le cadmium est dosé directement dans le vin par spectrophotométrie d'absorption atomique sans flamme.2. APPAREILLAGE Toute la verrerie doit être lavée au préalable avec de l'acide nitrique concentré chaud (70-80 °C) et rincée à l'eau bidistillée. 2.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un four graphite, d'un correcteur de bruit de fond et d'un enregistreur multipotentiométrique. 2.2. Lampe à cathode creuse au cadmium. 2.3. Micropipettes de 5 µl munies d'embouts spéciaux pour mesures d'absorption atomique.3. RÉACTIFS L'eau utilisée doit être de l'eau bidistillée dans un appareil en verre borosilicaté ou de l'eau de pureté équivalente. Tous les réactifs doivent être de pureté analytique reconnue, et en particulier être exempts de cadmium. 3.1. Acide phosphorique à 85 pour 100 (r20 = 1,71 g/ml). 3.2. Solution d'acide phosphorique obtenue par dilution de 8 ml d'acide phosphorique à 100 ml avec de l'eau. 3.3. Solution 0,02 M de sel disodique de l'acide éthylénediamine tétracétique (EDTA). 3.4. Solution tampon pH 9 obtenue par dissolution dans une fiole jaugée de 100 ml de 5,4 g de chlorure d'ammonium dans quelques millilitres d'eau, addition de 35 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium (r20 = 0,92 g/ml) diluée à 25 % (v/v) et ajustage au trait repère avec de l'eau. 3.5. Noir ériochrome T: dilution solide à 1 % (m/m) dans du chlorure de sodium.3.6. Sulfate de cadmium (3CdSO4, 8H2O) Le titre du sulfate de cadmium doit être vérifié selon le mode opératoire suivant:Peser exactement 102,6 mg de l'échantillon de sulfate de cadmium, entraîner quantitativement dans un vase cylindrique avec de l'eau, agiter jusqu'à dissolution; ajouter 5 ml de solution tampon pH 9, 20 mg environ de noir ériochrome T. Titrer à l'aide de la solution d'EDTA jusqu'à virage de l'indicateur au bleu. Le volume d'EDTA versé doit être égal à 20 ml. Si le volume est peu différent, corriger en conséquence la prise d'essai de sulfate de cadmium pesée utilisée pour la préparation de la solution de référence.3.7. Solution de référence de cadmium à 1 g par litre Utiliser une solution standard du commerce. Cette solution peut être obtenue par dissolution de 2,2820 g de sulfate de cadmium dans de l'eau et ajustage du volume à 1 litre. Conserver la solution dans un flacon de verre borosilicaté à bouchon rodé.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Diluer le vin au 1/2 (v/v) avec la solution d'acide phosphorique.4.2. Préparation des solutions de la gamme d'étalonnage À partir de la solution de référence de cadmium, préparer par dilutions successives des solutions titrant respectivement 2,5 - 5 - 10 - 15 microgrammes de cadmium par litre.4.3. Détermination 4.3.1. Programme du four (proposé à titre indicatif) Séchage à 100 °C pendant 30 secondes.Minéralisation à 900 °C pendant 20 secondes.Atomisation à 2 250 °C pendant 2 à 3 secondes.Débit d'azote (gaz de balayage): 6 litres par minute. Remarque: En fin d'opération, montée de température jusqu'à 2 700 °C pour purger le four.4.3.2. Mesures d'absorption atomique Sélectionner la longueur d'onde 228,8 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau bidistillée. Injecter dans le four, à l'aide d'une micropipette, trois fois 5 µl de chacune des solutions de la gamme d'étalonnage et de la solution de l'échantillon à analyser. Enregistrer les absorbances mesurées. Calculer la valeur moyenne de l'absorbance à partir des résultats relatifs aux trois injections.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe des variations de l'absorbance en fonction des concentrations en cadmium des solutions de la gamme d'étalonnage. La variation est linéaire. Reporter la valeur moyenne de l'absorbance de la solution de l'échantillon sur la droite d'étalonnage, en déduire la concentration C en cadmium. La concentration en cadmium exprimée en microgrammes par litre de vin est égale à:2 C 33. ARGENT 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Emploi de la spectrophotométrie d'absorption atomique précédée de la minéralisation de l'échantillon.2. APPAREILLAGE 2.1. Capsule de platine. 2.2. Bain d'eau thermostaté à 100 °C. 2.3. Four régulé à 500-525 °C. 2.4. Spectrophotomètre d'absorption atomique. 2.5. Lampe à cathode creuse à l'argent. 2.6. Gaz d'alimentation: air, acétylène.3. RÉACTIFS 3.1. Nitrate d'argent (AgNO3). 3.2. Acide nitrique concentré 65 % (HNO3,r20 = 1,38 g/ml). 3.3. Acide nitrique dilué 1/10 (v/v).3.4. Solution d'argent à 1 g/l Utiliser une solution standard d'argent du commerce.Cette solution peut être préparée en dissolvant 1,575 g de nitrate d'agent dans l'acide nitrique dilué et en ajustant le volume à 1 000 ml avec l'acide nitrique dilué.3.5. Solution d'argent à 10 mg/l 10 ml de solution 3.4 sont dilués à 1 000 ml avec l'acide nitrique dilué.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Placer 20 ml d'échantillon dans une capsule de platine, évaporer à sec sur bain d'eau à 100 °C bouillant. Incinérer au four jusqu'à cendres blanches à 500-525 °C. Reprendre les cendres avec 1 ml d'acide nitrique concentré (3.2), évaporer au bain d'eau à 100 °C, répéter l'addition de 1 ml d'acide nitrique (3.2) et l'évaporation. Ajouter 5 ml d'acide nitrique dilué (3.3) et chauffer légèrement jusqu'à dissolution.4.2. Étalonnage Dans une série de fioles jaugées de 100 ml, placer 2 - 4 - 6 - 8 - 10 et 20 ml de solution 3.5 à 10 mg d'argent par litre et porter au trait repère avec l'acide nitrique dilué (3.3). Ces solutions contiennent 0,20 - 0,40 - 0,60 - 0,80 - 1,0 et 2,0 mg/l d'argent.4.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 328,1 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec l'acide nitrique dilué (3.3). Aspirer directement le liquide obtenu selon 4.1 dans le brûleur du spectrophotomètre, puis successivement les solutions-étalons. Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en argent des solutions-étalons. Reporter l'absorbance lue pour le liquide obtenu selon 4.1 sur la courbe d'étalonnage et relever la concentration C en mg/l. La teneur du vin en argent, exprimée en milligrammes par litre est:0,25 C. Elle est donnée avec 2 décimales. Remarque: Les solutions de référence pour l'établissement de la courbe d'étalonnage, la quantité d'échantillon prélevée et le volume final de liquide peuvent être modifiés en fonction de la sensibilité de l'appareil utilisé. 34. ZINC 1. PRINCIPE Le zinc est dosé directement dans le vin désalcoolisé par spectrophotométrie d'absorption atomique.2. RÉACTIFS L'eau utilisée doit être de l'eau bidistillée dans un appareil en verre borosilicaté ou de l'eau de pureté équivalente. 2.1. Solution étalon de zinc à 1 g par litre. Utiliser une solution standard de zinc du commerce. Cette solution peut être préparée en dissolvant 4,3975 g de sulfate de zinc (Zn SO4, 7 H2O) dans de l'eau et en ajustant le volume à 1 litre. 2.2. Solution étalon diluée de zinc titrant 100 milligrammes par litre.3. APPAREILLAGE 3.1. Évaporateur rotatif avec bain d'eau thermostaté. 3.2. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûleur alimenté par de l'air et de l'acétylène. 3.3. Lampe à cathode creuse en zinc.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Éliminer l'alcool du vin par concentration au 1/2 de 100 ml de vin placés dans un évaporateur rotatif (température: 50-60 °C), ramener au volume initial de 100 ml avec de l'eau bidistillée.4.2. Étalonnage Dans quatre fioles jaugées de 100 ml, placer 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ml de la solution de zinc à 100 mg/l (2.2) et ajuster au trait de jauge avec de l'eau bidistillée. Les solutions étalons correspondent respectivement à 0,5 - 1 - 1,5 et 2 mg de zinc par litre.4.3. Dosage Sélectionner la longueur d'onde 213,9 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau bidistillée. Aspirer directement le vin dans le brûleur du spectrophotomètre, puis successivement les solutions étalons. Relever les absorbances. Effectuer les déterminations en double.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Mode de calcul Tracer la courbe de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en zinc des solutions étalons. Reporter la valeur moyenne des absorbances obtenues pour le vin et déterminer la concentration en zinc en milligrammes par litre de vin, avec 1 décimale. 35. PLOMB 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le plomb est dosé directement dans le vin par spectrophotométrie d'absorption atomique sans flamme.2. APPAREILLAGE Toute la verrerie doit être lavée au préalable avec de l'acide nitrique concentré chaud (70-80 °C) et rincée à l'eau bidistillée. 2.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un four graphite, d'un correcteur d'absorption non spécifique et d'un enregistreur multipotentiométrique. 2.2. Lampe à cathode creuse au plomb. 2.3. Micropipettes de 5 µl munies d'embouts spéciaux pour mesures d'absorption atomique.3. RÉACTIFS Tous les réactifs doivent être de pureté analytique reconnue et, en particulier, être exempts de plomb. L'eau utilisée doit être de l'eau bidistillée dans un appareil en verre borosilicaté ou de l'eau de pureté équivalente. 3.1. Acide phosphorique à 85 pour 100 (r20 = 1,71 g/ml). 3.2. Solution d'acide phosphorique obtenue par dilution de 8 ml d'acide phosphorique à 100 ml avec de l'eau. 3.3. Acide nitrique (r20 = 1,38 g/ml). 3.4. Solution de plomb à 1 g par litre. Utiliser une solution standard du commerce. Cette solution peut être obtenue par dissolution de 1,600 g de nitrate de plomb II, Pb(NO3)2, dans de l'acide nitrique dilué à 1 % (v/v) et ajustage du volume à 1 litre. Conserver la solution dans un flacon de verre borosilicaté à bouchon rodé.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Diluer le vin au 1/2 ou au 1/3 avec la solution d'acide phosphorique (3.2) selon la concentration présumée en plomb.4.2. Préparation des solutions de la gamme d'étalonnage À partir de la solution de référence de plomb, préparer par dilutions successives avec de l'eau bidistillée des solutions titrant respectivement 25 - 50 - 100 - 150 microgrammes de plomb par litre.4.3. Détermination 4.3.1. Programme du four (proposé à titre indicatif) Séchage à 100 °C pendant 30 secondes.Minéralisation à 900 °C pendant 20 secondes.Atomisation à 2 250 °C pendant 2 à 3 secondesDébit d'azote (gaz de balayage): 6 litres par minute. Remarque: En fin d'opération, montée de température jusqu'à 2 700 °C pour purger le four.4.3.2. Mesures Sélectionner la longueur d'onde 217 nm. Régler le zéro de l'échelle des absorbances avec de l'eau bidistillée. Injecter dans le four programmé, à l'aide d'une micropipette, 3 fois 5 µl de chacune des solutions de la gamme d'étalonnage et de la solution de l'échantillon à analyser. Enregistrer les absorbances mesurées. Calculer la valeur moyenne de l'absorbance à partir des résultats relatifs aux 3 injections.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Calcul Tracer la courbe des variations de l'absorbance en fonction des concentrations en plomb des solutions de la gamme d'étalonnage. La variation est linéaire. Reporter la valeur moyenne de l'absorbance de la solution de l'échantillon sur la droite d'étalonnage, en déduire la concentration C en plomb. La concentration en plomb exprimée en microgrammes par litre de vin est égale à:C × FF = facteur de dilution. 36. FLUORURES 1. PRINCIPE La teneur en fluorures du vin, additionné d'une solution tampon, est déterminée à l'aide d'une électrode spécifique à membrane solide. Le potentiel mesuré est proportionnel au logarithme de l'activité des ions fluorures dans le milieu étudié conformément à la relation:E = Eo ± S log aFE = potentiel de l'électrode ionique spécifique mesuré par rapport à l'électrode de référence dans le milieu étudiéEo = potentiel-étalon de la cellule de mesureS = pente de l'électrode ionique spécifique (facteur de Nernst). À 25 °C la pente théorique est égale à 59,2 mVaF = activité des ions fluorures dans la solution étudiée2. APPAREILLAGE 2.1. Électrode à membrane cristalline spécifique de l'ion fluor. 2.2. Électrode de référence (Calomel ou Ag/AgCl). 2.3. Millivoltmètre (pH mètre avec une graduation en millivolts étalée), précision 0,1 mV. 2.4. Agitateur magnétique avec plaque isolante pour protéger la solution analysée de la chaleur du moteur. Cylindre agitateur recouvert de plastique (polyéthylène ou matériau équivalent). 2.5. Béchers en plastique, de 30 ou de 50 ml, et flacons de plastique (polyéthylène ou matériau équivalent). 2.6. Pipettes de précision (pipettes graduées en microlitres ou toutes autres pipettes équivalentes).3. RÉACTIFS 3.1. Solution-mère de fluorure à 1 g/l. Utiliser une solution standard du commerce à 1 g/l. Cette solution peut être préparée en dissolvant 2,210 g de fluorure de sodium (séché 3 à 4 heures à 105 °C) dans l'eau distillée. Porter au trait de jauge de 1 000 ml avec de l'eau distillée. La solution est conservée dans un flacon de plastique. 3.2. Des solutions étalons de fluorure de concentration appropriée sont préparées par dilution de la solution-mère avec de l'eau distillée et conservées dans des flacons de plastique. Les solutions étalons dont la teneur en fluorure est de l'ordre du mg/l doivent être préparées extemporanément. 3.3. Solution tampon pH 5,5. 10 g d'acide cyclohexane-diamine (1,2)-tétracétique (CDTA) sont additionnés d'eau (50 ml environ); ajouter une solution contenant 58 g de chlorure de sodium et 29,4 g de citrate trisodique dans 700 ml d'eau distillée. Le CDTA est dissous en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium à 32 pour 100 (m/v) (environ 6 ml). Ajouter enfin 57 ml d'acide acétique (r20 = 1,05 g/ml) et amener le pH à 5,5 avec la solution d'hydroxyde de sodium à 32 pour 100 (environ 45 ml). Laisser refroidir et porter au litre avec de l'eau distillée.4. MODE OPÉRATOIRE Remarque préliminaire:Il faut prendre garde à ce que toutes les solutions conservent durant la mesure une température de 25 ± 1 °C. (Un écart de ± 1 °C provoque une modification d'environ ± 0,2 mV.)4.1. Méthode directe Dans un bécher de plastique introduire un volume défini de vin et un égal volume de solution tampon. La solution est agitée d'une façon égale et modérée. Lorsque l'appareil indicateur est stable (la stabilité est obtenue lorsque le potentiel varie au maximum de 0,2-0,3 mV/3 minutes), lire la valeur du potentiel en mV.4.2. Méthode des ajouts connus Sans interrompre l'agitation, le milieu étudié est additionné à l'aide d'une pipette de précision d'un volume connu de solution étalon de fluorure. Lorsque l'appareil indicateur est stable, lire la valeur du potentiel en mV. Choisir la concentration de la solution étalon ajoutée de la façon suivante:a) doubler ou tripler la concentration en fluorure du milieu étudié;b) le volume du milieu étudié doit rester pratiquement constant(augmentation du volume E 1 %).La condition b) simplifie les calculs (voir 5). La concentration approximative du milieu étudié est lue sur une droite d'étalonnage qui est tracée en coordonnées semi-logarithmiques avec des solutions étalons titrant 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l de fluorures. Remarque: Si la concentration approximative du milieu étudié dépasse le domaine de concentration des solutions-étalons, diluer l'échantillon. Exemple:Soit 0,25 mg/l F , la teneur approximative du milieu étudié (volume 20 ml); la concentration doit être majorée de 0,25 mg/l. Pour cela ajouter par exemple à la solution, avec la pipette de précision appropriée, 0,20 ml (= 1 %) d'une solution-étalon contenant 25 mg/l F ou 0,050 ml d'une solution-étalon à 100 mg/l F .5. CALCULS La teneur en fluorures du milieu étudié, exprimée en milligrammes par litre, s'obtient à l'aide de la formule suivante:CF = concentration en fluorure du milieu étudié (mg/l)Ca = concentration du fluorure ajouté (mg/l) dans le milieu étudié (Va)Vo = volume initial du milieu étudié avant la surcharge (ml)Va = volume de la solution surchargée (ml)DE = différence entre les potentiels E1 et E2 obtenus en 4.1 et 4.2 (mV)S = pente de l'électrode dans la solution étudiée Si Va est très voisin de Vo (voir 4.2), la formule se simplifie et devient:La valeur obtenue doit être multipliée par le facteur de dilution provenant de l'addition du tampon. 37. DIOXYDE DE CARBONE 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode de référence 1.1.1. Cas des vins tranquilles (surpression de CO2 E 0,5 · 105 Pa) (11) Le volume de vin prélevé sur l'échantillon amené au voisinage de 0 °C est versé dans un excès suffisant de solution titrée d'hydroxyde de sodium pour avoir un pH de 10-11. On titre avec une solution acide en présence d'anhydrase carbonique. La teneur en dioxyde de carbone est déduite du volume versé pour passer de pH 8,6 (forme carbonate acide) à 4,0 (acide carbonique). Un titrage témoin effectué dans les mêmes conditions sur le vin décarboniqué permet de tenir compte du volume de solution d'hydroxyde de sodium consommé par les acides du vin.1.1.2. Cas des vins pétillants et des vins mousseux L'échantillon de vin à analyser est amené au voisinage de son point de congélation. Après soutirage d'un certain volume destiné à servir de témoin après décarbonication, on alcalinise le reste de la bouteille pour fixer tout le CO2 sous forme de Na2CO3. On titre avec une solution acide en présence d'anhydrase carbonique. La teneur en dioxyde de carbone est déduite du volume de solution acide versée pour passer de pH 8,6 (forme carbonate acide) à pH 4,0 (acide carbonique). Un titrage témoin effectué dans les mêmes conditions sur le vin décarboniqué permet de tenir compte du volume de solution d'hydroxyde de sodium consommé par les acides du vin.1.2. Méthode usuelle: cas des vins pétillants et mousseux Méthode manométrique: mesure de la surpression de dioxyde de carbone directement dans la bouteille au moyen d'un aphromètre.2. MÉTHODE DE RÉFÉRENCE 2.1. Cas des vins tranquilles (surpression de dioxyde de carbone E 0,5 · 105 Pa).2.1.1. Appareillage 2.1.1.1. Agitateur magnétique. 2.1.1.2. pH mètre.2.1.2. Réactifs 2.1.2.1. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), 0,1 M. 2.1.2.2. Solution d'acide sulfurique (H2SO4), 0,05 M. 2.1.2.3. Solution d'anhydrase carbonique à 1 gramme par litre.2.1.3. Mode opératoire Refroidir l'échantillon de vin aux environs de 0 °C ainsi que la pipette de 10 ml servant à son prélèvement. Prélever dans un vase cylindrique de 100 ml, 25 ml de solution d'hydroxyde de sodium (2.1.2.1); ajouter 2 gouttes de solution aqueuse d'anhydrase carbonique (2.1.2.3). Y introduire 10 ml de vin au moyen de la pipette refroidie à 0 °C. Placer le vase cylindrique sur l'agitateur magnétique, mettre en place l'électrode et le barreau magnétique et procéder à une agitation modérée. Lorsque le liquide est revenu à la température ambiante, verser par affusion lente la solution d'acide sulfurique (2.1.2.2) jusqu'à pH 8,6. Continuer les affusions d'acide sulfurique (2.1.2.2) jusqu'à pH 4,0. Soit n ml le volume utilisé entre pH 8,6 et 4,0. Procéder par ailleurs à l'élimination du CO2 sur 50 ml environ de l'échantillon de vin par agitation sous vide pendant 3 minutes, en réchauffant la fiole dans un bain d'eau à 25 °C environ. Appliquer sur 10 ml de vin décarboniqué le mode opératoire ci-dessus: soit n2 ml le volume utilisé.2.1.4. Expression des résultats 1 ml de solution titrée d'hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 4,4 mg de CO2. La quantité de CO2 en grammes par litre de vin est donnée0,44 (n n2)Elle est exprimée avec 2 décimales. Remarque: Dans le cas des vins peu chargés en CO2 (CO2 < 1 g/l), l'addition d'anhydrase carbonique pour catalyser l'hydratation du CO2 n'est pas nécessaire.2.2. Cas des vins pétillants et des vins mousseux 2.2.1. Appareillage 2.2.1.1. Agitateur magnétique. 2.2.1.2. pH mètre.2.2.2. Réactifs 2.2.2.1. Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), à 50 pour 100 (m/m). 2.2.2.2. Solution d'acide sulfurique (H2SO4), 0,05 M. 2.2.2.3. Solution d'anhydrase carbonique à 1 gramme par litre.2.2.3. Mode opératoire Sur la bouteille de vin à analyser, tracer un repère au niveau du remplissage et la refroidir jusqu'à début de congélation. Laisser la bouteille se réchauffer légèrement, tout en l'agitant, jusqu'à disparition des cristaux de glace. Déboucher rapidement et mettre de côté, dans une éprouvette graduée, 45 à 50 ml de vin qui serviront au dosage témoin. Le volume exact de ce prélèvement, v ml, sera déterminé par lecture sur l'éprouvette après son retour à la température ambiante. Ajouter, sitôt le prélèvement effectué, 20 ml de solution d'hydroxyde de sodium (2.2.2.1) dans la bouteille pour une contenance de 750 ml. Attendre que le vin soit revenu à la température ambiante. Placer dans un vase cylindrique de 100 ml, 30 ml d'eau distillée bouillie et 2 gouttes de la solution d'anhydrase carbonique (2.2.2.3). Y ajouter 10 ml de vin alcalinisé. Placer le vase sur l'agitation magnétique, mettre en place l'électrode et le barreau magnétique et procéder à une agitation modérée. Verser par affusion lente la solution d'acide sulfurique (2.2.2.2) jusqu'à pH 8,6. Continuer les affusions d'acide sulfurique (2.2.2.2) jusqu'à pH 4,0. Soit n ml le volume utilisé entre pH 8,6 et 4,0. Procéder par ailleurs à l'élimination du CO2 sur les v ml de vin, mis à côté pour le dosage témoin, par agitation sous vide pendant 3 minutes, en réchauffant la fiole dans un bain d'eau à 25 °C environ. Prélever 10 ml de vin décarboniqué dans 30 ml d'eau distillée bouillie, ajouter 2 à 3 gouttes de solution d'hydroxyde de sodium (2.2.2.1) pour amener le pH à 10-11. Apliquer ensuite le mode opératoire ci-dessus. Soit n2 ml, le volume d'acide sulfurique 0,05 M versé.2.2.4. Expression des résultats 1 ml de solution d'acide sulfurique 0,05 M correspond à 4,4 mg de CO2. Vider la bouteille de son vin alcalinisé et déterminer à 1 ml près le volume initial du vin en la remplissant avec de l'eau jusqu'au trait de repère, soit V ml. La quantité de CO2 en grammes par litre de vin est donnée par:Elle est exprimée avec 2 décimales.2.3. Calcul de la surpression La surpression à 20 °C, Paph20, exprimée en pascals, est donnée par la formule:avec:Q: teneur en grammes de CO2 par litre de vinA: titre alcoométrique du vin à 20 °CS: teneur en sucres du vin en grammes par litrePatm: pression atmosphérique, exprimée en pascals3. MÉTHODE USUELLE (VINS PÉTILLANTS ET MOUSSEUX) 3.1. Appareillage 3.1.1. Aphromètre L'appareil permettant la mesure de la surpression dans les bouteilles de vin pétillants et mousseux s'appelle un aphromètre. Il se présente différemment suivant le bouchage de la bouteille (capsule métallique, couronne, bouchon liège ou plastique, voir figures 1 et 2). Ils sont gradués en pascals (abréviation Pa) (12). Il est plus pratique d'utiliser le 105 pascal (105Pa) ou le kilopascal (kPa) comme unité. Ils peuvent être de différentes classes. La classe d'un manomètre est la précision de la lecture par rapport à la pleine échelle exprimée en pourcentage (par exemple manomètre 1 000 kPa classe 1, signifie pression d'utilisation maximale 1 000 kPa lecture à ± 10 kPa). La classe 1 est recommandée pour des mesures précises. Les aphromètres doivent être régulièrement vérifiés (au moins une fois par an).3.2. Mode opératoire La mesure doit s'effectuer sur des bouteilles dont la température est stabilisée depuis au moins 24 heures.Après avoir percé la capsule ou le bouchon la bouteille doit être ensuite fortement agitée jusqu'à pression constante pour effectuer la lecture. Figure 1 - Aphromètre pour capsulesFigure 2 - Aphromètre pour bouchons 3.3. Expression des résultats La surpression à 20 °C (Paph20) est exprimée en pascals (Pa) ou en kilopascals (kPa). Elle doit être en concordance avec la précision du manomètre (par exemple: 6,3 105 Pa ou 630 kPa et non 6,33 105 Pa ou 633 kPa pour un manomètre 1 000 kPa pleine échelle, de classe 1). Quand la température de mesure est différente de 20 °C, il convient d'apporter une correction en multipliant la pression mesurée par le coefficientdonné par le tableau 1 pour la ramener à 20 °C.4. RELATION ENTRE LA PRESSION ET LA QUANTITÉ DE DIOXYDE DE CARBONE CONTENUE DANS UN VIN MOUSSEUX (13) À partir de la surpression à 20 °C (Paph20), on calcule la pression absolue à 20 °C (Pabs20) selon la formule:Pabs20 = Patm + Paph20 où Patm est la pression atmosphérique exprimée en pascals. La quantité de dioxyde de carbone contenue dans un vin est donnée par les relations suivantes:- en litres de CO2 par litre de vin:0,987 · 10 5 Pabs20 (0,86 0,01A) (1 0,00144S)- en grammes de CO2 par litre de vin:1,951 · 10 5 Pabs20 (0,86 0,01A) (1 0,00144S)dans lequelles:A est le tire alcoométrique du vin à 20 °C.S est la teneur en sucres du vin, exprimée en grammes par litre. TABLEAU 1Rapport de la surpression Paph20 d'un vin pétillant ou mousseux à 20 °C à la surpression Papht à une température t 38. DÉRIVÉS CYANÉS 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode rapide d'essai:contrôle des vins traités par l'hexacyanoferrate (II) de potassium. Vérification d'absence de précipité d'hexacyanoferrate (II) de fer (III) en suspension dans le dépôt. Vérification de l'absence de formation d'hexacyanoferrate (II) de fer (III) par addition d'un sel de fer (III) au vin acidifié. Vérification de la présence de fer précipitant par addition au vin acidulé d'un mélange d'hexacyanoferrate (II) et d'hexacyanoferrate (III) alcalins.1.2. Méthode usuelle Dosage argentimétrique de l'acide cyanhydrique total libéré par hydrolyse acide et séparé par distillation.2. MÉTHODE RAPIDE D'ESSAI Contrôle des vins traités par l'hexacyanoferrate (II) de potassium.2.1. Appareils Il faut disposer de l'un ou de l'autre des appareils suivants: 2.1.1. Centrifugeuse permettant d'appliquer une force centrifuge de 1 200 à 1 500 g. 2.1.2. Dispositif de filtration sur filtre écran et filtres écrans (diamètre des pores 0,45 µm).2.2. Réactifs 2.2.1. Acide chlorhydrique dilué 1/2 (v/v) obtenu par dilution en volumes d'acide chlorhydrique (HCl), (r20 = 1,18 à 1,19 g/ml) exempt de fer. 2.2.2. Solution de sulfate de fer (III) et d'ammonium, Fe2(SO4)3, (NH4)2 SO4, 24 H2O, à 15 pour 100 (m/v). 2.2.3. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium, K4 [Fe(CN)6], 3H2O, à 10 pour 100 (m/v). 2.2.4. Solution d'hexacyanoferrate (III) de potassium, K3 [Fe (CN)6], à 10 pour 100 (m/v). À préparer extemporanément.2.3. Mode opératoire 2.3.1. Recherche des traces d'hexacyanoferrate (II) de fer (III) en suspension Après agitation de l'échantillon, placer 20 ml de vin dans un tube à centrifuger conique de 30 ml; ajouter 1 ml d'acide chlorhydrique (2.2.1). Centrifuger 15 minutes ou filtrer sur filtre écran (diamètre des pores 0,45 µm). Le culot de centrifugation ou le filtre doit être totalement exempt de particules bleues.2.3.2. Recherche de traces d'ions hexacyanoferrate (II) en solution Au surnageant ou au filtrat provenant de l'essai 2.3.1, ajouter 1 goutte d'une solution de sulfate de fer (III) et d'ammonium (2.2.2). Agiter, puis laisser reposer au moins 24 heures. Centrifuger 15 minutes ou filtrer sur filtre écran (diamètre des pores 0,45 µm). Le culot de centrifugation ou le filtre doit être totalement exempt de particules bleues d'hexacyanoferrate (II) de fer (III).2.3.3. Vérification de la présence d'ions fer dans le vin Dans un tube à essai, placer 20 ml de vin, 1 ml d'acide chlorhydrique (2.2.1), 1 goutte d'une solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium (2.2.3) et 1 goutte d'une solution d'hexacyanoferrate (III) de potassium (2.2.4). Une coloration ou un précipité de couleur bleue doit apparaître en moins de 30 minutes. Après centrifugation ou après filtration sur filtre écran (diamètre des pores 0,45 µm) suivi du rinçage du filtre 2 fois par 5 ml d'eau, un dépôt bleu doit être observé dans le tube à centrifugation ou sur le filtre écran.3. MÉTHODE USUELLE 3.1. Appareils 3.1.1. Appareil à distillation, constitué par un ballon à fond rond de 500 ml relié par un tube muni de rodages à l'extrémité supérieure d'un réfrigérant, tenu verticalement, d'une longueur de 350 mm au moins. L'extrémité inférieure de ce réfrigérant porte une allonge terminée par une partie effilée qui conduit le distillat au fond d'un ballon de 50 ml, entièrement immergé dans de l'eau glacée. 3.1.2. Bain d'eau thermostaté à 100 °C, chauffé électriquement.3.2. Réactifs 3.2.1. Acide sulfurique dilué 1/5 (v/v) Mélanger avec précaution 200 ml d'acide sulfurique, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) à une quantité d'eau suffisante pour obtenir 1 litre de solution. 3.2.2. Chlorure de cuivre (II) cristallisé, Cu Cl2, 2 H2O. 3.2.3. Solution de rouge de phénol 0,05 g de rouge de phénol sont dissous dans 1,4 ml d'une solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium; porter la solution à 1 000 ml. 3.2.4. Solution d'iodure de potassium Dissoudre 250 g d'iodure de potassium, KI, dans une quantité d'eau suffisante pour obtenir 1 litre de solution. 3.2.5. Solution 0,001 M de nitrate d'argent 10 ml d'une solution 0,1 M de nitrate d'argent (Ag NO3) sont dilués à 1 000 ml après addition de 0,5 ml d'acide nitrique concentré (HNO3, r20 = 1,40 g/ml). 3.2.6. Solution d'hydroxyde de sodium 1 M, exempte de fer.3.3. Mode opératoire Introduire 100 ml de vin filtré (ou non filtré si on désire doser aussi l'acide cyanhydrique contenu dans l'éventuel trouble bleu), ajouter environ 5 mg de chlorure de Cu (II) (3.2.2) et 10 ml d'acide sulfurique dilué (3.2.1). Dans le ballon récepteur placer 5 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.2.6). Distiller jusqu'à ce que le ballon de 50 ml soit plein. Ce distillat est versé dans un vase cylindrique de 400 ml posé sur un bain d'eau à 100 °C et, pour accélérer l'évaporation, diriger un courant d'air froid assez vif produit par une soufflerie à la surface du liquide alcalin. Il faut réduire le volume à 5 à 7 ml, ce qui demande environ 30 minutes (ne jamais réduire le volume à moins de 5 ml). La solution refroidie est filtrée si nécessaire en recueillant le filtrat dans un tube cylindrique de 20 mm de diamètre et de 180 mm de longueur ou transvasée directement dans ce tube. Laver le vase cylindrique et éventuellement le filtre avec quelques millilitres d'eau et les ajouter dans le tube. Le tube de verre est placé sur un fond noir et éclairé latéralement par un faisceau de lumière blanche. Le liquide doit être parfaitement limpide (14). Ajouter 2 gouttes de solution de rouge de phénol (3.2.3) pour sensibiliser le virage (15) et 1 goutte de solution d'iodure de potassium (3.2.4). Titrer avec la solution 0,001 M de nitrate d'argent (3.2.5) jusqu'à obtention d'un trouble faible mais stable. Soit n le volume de solution nécessaire pour obtenir ce résultat. Préparer d'autre part un tube semblable avec 5 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.2.6), 2 gouttes de solution de rouge de phénol (3.2.3). (15), 1 goutte de solution d'iodure de potassium (3.2.4) et une quantité d'eau suffisante pour obtenir un volume identique à celui de l'essai ci-dessus. Ajouter la solution 0,001 M de nitrate d'argent (3.2.5) en quantité suffisante pour obtenir le même trouble, soit n2 le volume employé (16).3.4. Expression des résultats 1 ml de solution 0,001 M de nitrate d'argent correspond à 54 µg d'acide cyanhydrique (HCN). La quantité d'acide cyanhydrique total contenu dans 1 l de vin, exprimée en milligrammes, est: 0,54 (n - n2). Elle est exprimée avec 2 décimales. Ne retenir comme significatifs de la présence de composés cyanhydriques dans le vin que les essais pour lesquels n - n2 est supérieur à 0,5 ml. Lorsque n - n2 est supérieur à 10 ml, recommencer toutes les opérations en utilisant une solution de nitrate d'argent 0,01 M. 39. ISOTHIOCYANATE D'ALLYLE 1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'isothyocyanate d'allyle, éventuellement présent dans le vin, récupéré par distillation, est identifié par une technique de chromatographie en phase gazeuse.2. RÉACTIFS 2.1. Éthanol absolu. 2.2.Solutionstandard: solution dans l'alcool absolu d'isothiocyanate d'allyle contenant 15 mg/l de principe actif. 2.3. Mélange réfrigérant constitué d'éthanol et de neige carbonique (température 60 °C).3. APPAREILS 3.1. Appareil de distillation par entraînement par courant d'azote selon la figure. 3.2. Enveloppe chauffante thermo-réglable. 3.3. Débitmètre. 3.4. Chromatographe en phase gazeuse avec détecteur à spectromètre de flamme muni d'un filtre sélectif pour les composés soufrés (l = 394 nm) ou tout autre détecteur adapté à cette mesure. 3.5. Colonne de chromatographie en acier inoxydable, diamètre intérieur 3 mm, longueur 3 m; remplie de Carbowax 20 M à 10 % sur chromosorb WHP, 80 100 mesh. 3.6. Microseringue de 10 µl.4. MODE OPÉRATOIRE Prélever 2 l de vin et les placer dans le ballon de distillation. Introduire quelques millilitres d'éthanol (2.1) dans les deux tubes de récupération jusqu'à complète immersion de la partie poreuse pour la dispersion gazeuse. Refroidir extérieurement les deux tubes avec le mélange réfrigérant. Relier le ballon aux tubes récepteurs et commencer à envoyer dans l'appareil un courant d'azote d'environ 3 l à l'heure. Réchauffer le vin à 80 °C en réglant la température de l'enceinte chauffante de façon convenable et récupérer au total 45-50 ml de distillat. Stabiliser le chromatographe; les conditions opératoires suivantes sont conseillées:- température de l'injecteur: 200 °C,- température de la colonne: 130 °C,- gaz vecteur hélium à un débit de 20 ml par minute. Injecter à l'aide de la microseringue une quantité de solution standard telle que le pic correspondant à l'isothiocyanate d'allyle puisse être facilement identifié sur le chromatogramme. Injecter de même une partie aliquote de distillat et contrôler la correspondance du temps de rétention de l'isothiocyanate d'allyle et du pic obtenu. Dans les conditions indiquées pour l'essai, aucun composé naturel du vin ne donne d'interférence correspondant au temps de rétention de la substance recherchée. Appareil de distillation sous courant d'azote 40. CARACTÉRISTIQUES CHROMATIQUES 1. CAS DES VINS ET DES MOÛTS 1.1. Définitions On appelle caractéristiques chromatiques d'un vin sa luminosité et sa chromaticité. La luminosité correspond à la transmittance. Elle varie en raison inverse de l'intensité colorante du vin. La chromaticité correspond à la longueur d'onde dominante (qui caractérise la nuance) et à la pureté. Conventionnellement et pour des raisons de commodité, les caractéristiques chromatiques des vins rouges et rosés sont énoncées par l'intensité colorante et la nuance, suivant un procédé adopté comme méthode usuelle.1.2. Principe des méthodes 1.2.1. Méthode de référence Méthode spectrophotométrique qui permet le calcul des valeurs tristimulaires et des coefficients trichromatiques nécessaires à la spécification de la couleur dans les termes de la Commission internationale de l'éclairage (CIE).1.2.2. Méthode usuelle (applicable aux vins rouges et rosés) Méthode spectrophotométrique selon laquelle les caractéristiques chromatiques sont exprimées conventionnellement comme ci-dessous: L'intensité est donnée par la somme des absorbances sous 1 cm de trajet optique pour les radiations de longueurs d'onde égales à 420, 520 et 620 nm. La nuance est exprimée par le rapport de l'absorbance à 420 nm à l'absorbance à 520 nm.1.3. Méthode de référence 1.3.1. Appareillage 1.3.1.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures entre 300 et 700 nm. 1.3.1.2. Cuves en verre, disponibles par paires, de trajet optique, b, égal à 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 et 4 cm.1.3.2. Mode opératoire 1.3.2.1. Préparation de l'échantillon Si le vin est trouble, il doit être clarifié par centrifugation. Les vins jeunes ou mousseux doivent être débarrassés de la plus grande quantité de leur dioxyde de carbone par agitation sous vide.1.3.2.2. Mesures Le trajet optique, b, des cuves utilisées doit être choisi de telle manière que l'absorbance mesurée soit comprise entre 0,3 et 0,7. À titre indicatif, il est conseillé d'utiliser des cuves de 2 cm (ou 4 cm) de trajet optique pour les vins blancs, 1 cm pour les vins rosés et 0,1 cm (ou 0,2 cm) pour les vins rouges. Effectuer les mesures spectrophotométriques en utilisant comme liquide de référence l'eau distillée placée dans une cuve de même trajet optique, b, pour régler le zéro de l'échelle des absorbances aux longueurs d'onde 445, 495, 550 et 625 nm. Relever, pour le trajet optique b, les quatre absorbances obtenues pour le vin, soit A445, A495, A550, A625 (avec 3 décimales).1.3.3. Calculs En reportant les valeurs des absorbances pour b cm de trajet optique sur la table I, relever les transmittances (T %) correspondantes, soit: T445, T495, T550, T625. - Calculer les valeurs tristimulaires X, Y et Z, exprimées en fractions décimales:X = 0,42 × T625 + 0,35 × T550 + 0,21 × T445Y = 0,20 × T625 + 0,63 × T550 + 0,17 × T495Z = 0,24 × T495 + 0,94 × T445- Calculer les coordonnées de la couleur x et y:1.3.4. Expression des résultats 1.3.4.1. La luminosité relative est donnée par la valeur de Y exprimée en pourcentage. (Pour le noir Y % = 0, pour l'incolore Y % = 100). 1.3.4.2. La chromaticité est exprimée par la longueur d'onde dominante et la pureté. Leur détermination fait appel au diagramme de chromaticité, délimité par le spectrum locus, donné sur la figure 1. Il porte le point 0 qui correspond à la source de lumière blanche utilisée, représentée par l'illuminant standard C de coordonnées xO = 0,3101 et yO = 0,3163, représentant la lumière du jour moyennement clair. - Longueur d'onde dominantePlacer sur le diagramme le point C de coordonnées x et y. Lorsque le point C est à l'extérieur du triangle AOB, tracer la droite qui joint le point O au point C et la prolonger; elle coupe le spectrum locus en un point S qui correspond à la longueur d'onde dominante.Lorsque le point C est à l'intérieur du triangle AOB, tracer la droite de C vers O; elle coupe le spectrum locus en un point qui correspond à la longueur d'onde de la couleur complémentaire du vin. Cette longueur d'onde est exprimée par sa valeur suivie de la lettre C.- PuretéLorsque le point C est extérieur au triangle AOB, la pureté est exprimée en pourcentage par le rapport:Lorsque le point C est à l'intérieur du triangle AOC, la pureté est exprimée en pourcentage par le rapport: (17)Le point P étant le point où la droite OC coupe la ligne des pourpres.La pureté est également donnée directement par les diagrammes de chromaticité connaissant x et y (figures 2, 3, 4, 5 et 6). 1.3.4.3. Résultats La luminosité, la chromaticité (exprimée par la longueur d'onde dominante) et la pureté définissent complètement la couleur d'un vin. Elles doivent être indiquées sur le bulletin d'analyse avec la valeur du trajet optique sous lequel les mesures ont été effectuées.4. MÉTHODE USUELLE 1.4.1.Appareillage 1.4.1.1. Spectrophotomètre permettant des mesures entre 300 et 700 nm. 1.4.1.2. Cuves de verre disponibles par paires, de trajet optique, b, égal à 0,1 - 0,2 - 0,5 et 1 cm.1.4.2. Traitement préalable de l'échantillon Si le vin est trouble, le clarifier par centrifugation. Les vins jeunes ou mousseux doivent être débarrassés de la plus grande quantité de leur dioxyde de carbone par agitation sous vide.1.4.3. Mode opératoire Le trajet optique, b, de la cuve de mesure doit être choisi de manière que l'absorbance A soit comprise entre 0,3 et 0,7. Effectuer les mesures spectrophotométriques en utilisant comme liquide de référence l'eau distillée placée dans une cuve de même trajet optique, b, pour régler le zéro de l'échelle d'absorbances de l'appareil aux longueurs d'onde 420, 520 et 620 nm.1.4.4. Expression des résultats 1.4.4.1. Calculs Calculer les absorbances pour 1 cm de trajet optique pour les 3 longueurs d'onde en divisant par b, exprimé en cm, les absorbances relevées, soit A420, A520 et A620. L'intensité est conventionnellement donnée par:I = A420 + A520 + A620Elle est exprimée avec 3 décimales. La nuance est conventionnellement donnée par:Elle est donnée avec 3 décimales. TABLEAU I Transformation des absorbances en transmittances (T %) Mode d'utilisation:Lire le premier chiffre décimal de la valeur de l'absorbance dans la colonne verticale 1 et le deuxième chiffre décimal sur la ligne horizontale 2. Relever le chiffre situé à leurintersection. Pour obtenir la transmittance, ce chiffre devra être divisé par 10 si l'absorbance a une valeur inférieure à 1, par 100 si elle est comprise entre 1 et 2, par 1 000 si elle est comprise entre 2 et 3. Remarque:Le chiffre porté en haut et à droite de chaque case permet de tenir compte par interpolation du troisième chiffre décimal de la valeur de l'absorbance. Exemple:Absorbance 0,47 1,47 2,47 3,47T % 33,9 % 3,4 % 0,3% 0 %Les transmittances T % seront exprimées à 0,1 % près. FIGURE 1Diagramme de la chromaticité représentant le locus de toutes les couleurs du spectre. FIGURE 2Diagramme de la chromaticité pour les vins rouges francs et les vins rouges tuilés. FIGURE 3Diagramme de la chromaticité pour les vins rouges francs et les vins rouges tuilés. FIGURE 4Diagramme de la chromaticité pour les vins rouges francs et les vins rouges pourpres. FIGURE 5Diagramme de la chromaticité pour les vins rouges francs et les vins rouges pourpres. FIGURE 6Diagramme de la chromaticité pour les vins rouges tuilés et les vins rouges pourpres. 2. CAS DES MOÛTS CONCENTRÉS RECTIFIÉS 2.1. Principe Mesure de l'absorbance, à 425 nm sous 1 cm d'épaisseur, du moût concentré rectifié dont la concentration en sucres a été ramenée à 25 pour 100 (m/m) (25 ° Brix).2.2. Appareils 2.2.1. Spectrophotomètre permettant des mesures entre 300 et 700 nm. 2.2.2. Cuves de verre, de trajet optique égal à 1 cm. 2.2.3. Filtre à membrane de porosité 0,45 mm.2.3.Mode opératoire 2.3.1. Préparation de l'échantillon Utiliser la solution dont le titre en sucres est de 25 pour 100 (m/m) (25 ° Brix) préparée comme il est indiqué au chapitre «pH», en 4.1.2. La filtrer sur un filtre à membrane de porosité 0,45 mm.2.3.2. Détermination de l'absorbance Régler l'absorbance zéro pour la longueur d'onde 425 nm sur une cuve de 1 cm de trajet optique contenant de l'eau distillée. Relever l'absorbance A à cette longueur d'onde, de la solution à 25 pour 100 de sucres (25 ° Brix) obtenue en 2.3.1, placée dans une cuve de 1 cm de trajet optique.2.4. Expression des résultats L'absorbance à 425 nm du moût concentré rectifié en solution à 25 pour 100 (m/m) de sucres (25 ° Brix) est exprimée avec 2 décimales. 41. INDICE DE FOLIN-CIOCALTEU 1. DÉFINITION L'indice de Folin-Ciocalteu est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après.2. PRINCIPE L'ensemble des composés phénoliques du vin est oxydé par le réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier est constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d'acide phosphomolybdique (H3PMo12O40) qui est réduit, lors de l'oxydation des phénols, en mélange d'oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23). La coloration bleue produite possède une absorption maximum aux environs de 750 nm. Elle est proportionnelle au taux de composés phénoliques.3. RÉACTIFS Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté équivalente.3.1. Réactif de Folin-Ciocalteu Ce réactif est disponible dans le commerce prêt à l'emploi. Il peut être préparé de la façon suivante: 100 g de tungstate de sodium (Na2WO4, 2H2O) et 25 g de molybdate de sodium (Na2MoO4, 2H2O) sont dissous dans 700 ml d'eau distillée; ajouter 50 ml d'acide phosphorique à 85 % (r20 = 1,71 g/ml), 100 ml d'acide chlorhydrique concentré (r20 = 1,19 g/ml). Porter à l'ébullition sous reflux durant 10 heures, ajouter ensuite 150 g de sulfate de lithium (Li2SO4, H2O), quelques gouttes de brome et porter à nouveau à l'ébullition durant 15 minutes. Refroidir et compléter à 1 litre avec de l'eau distillée. 3.2. Carbonate de sodium (Na2CO3) anhydre en solution à 20 % (m/v).4. APPAREILLAGE Matériel courant de laboratoire, et notamment: 4.1. Fioles jaugées de 100 ml. 4.2. Spectrophotomètre permettant de travailler à 750 nm.5. MODE OPÉRATOIRE 5.1. Cas des vins rouges Dans une fiole jaugée de 100 ml (4.1), introduire en respectant l'ordre suivant: 1 ml de vin dilué au 1/5e50 ml d'eau distillée 5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu (3.1)20 ml de solution de carbonate de sodium (3.2) Porter à 100 ml avec de l'eau distillée. Agiter pour homogénéiser. Attendre 30 minutes pour avoir une stabilisation de la réaction. Déterminer l'absorbance à 750 nm sous 1 cm par rapport à un témoin préparé avec de l'eau distillée à la place du vin. Si l'absorbance lue n'est pas voisine de 0,3, il convient de modifier la dilution du vin.5.2. Cas des vins blancs Opérer dans les mêmes conditions, sur 1 ml de vin non dilué.5.3. Cas des moûts concentrés rectifiés 5.3.1. Préparation de l'échantillon Utiliser la solution dont la teneur en sucres est de 25 pour 100 (m/m) (25° Brix) préparée comme il est indiqué au chapitre «pH», en 4.1.2.5.3.2. Mesure Opérer comme il est décrit dans le cas des vins rouges (5.1) sur 5 ml d'échantillon préparé selon 5.3.1 en mesurant l'absorbance par rapport à un témoin préparé avec 5 ml d'une solution de sucre interverti à 25 pour 100 (m/m).6. EXPRESSION DES RÉSULTATS 6.1. Mode de calcul Le résultat est exprimé sous forme d'un indice obtenu en multipliant l'absorbance par 100 dans le cas des vins rouges dilués au 1/5e (ou par le facteur correspondant à la dilution employée) et par 20 dans le cas des vins blancs. Dans le cas des moûts concentrés rectifiés, l'absorbance est multipliée par 16.6.2.Répétabilité La différence entre les résultats de 2 déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste, ne doit pas être supérieure à 1. Une bonne répétabilité des résultats est liée à l'utilisation d'un appareillage (fioles jaugées et cuves du spectrophotomètre) rigoureusement propre. 42. MÉTHODES D'ANALYSE PARTICULIÈRES POUR MOÛTS DE RAISINS CONCENTRÉS RECTIFIÉS a) CATIONS TOTAUX 1. PRINCIPE La prise d'essai est traitée par un échangeur de cations fortement acide. Les cations sont échangés contre H+. Ils sont exprimés par la différence entre l'acidité totale de l'effluent et celle de la prise d'essai.2. APPAREILLAGE 2.1. Colonne de verre de 300 mm environ de longueur et de 10-11 mm de diamètre intérieur, munie d'un robinet. 2.2. pH-mètre gradué au moins en dixièmes d'unités pH. 2.3. Électrodes:- électrode de verre, à conserver dans l'eau distillée,- électrode de référence au calomel-chlorure de potassium saturé, à conserver dans une solution saturée de chlorure de potassium,- ou électrode combinée à conserver dans l'eau distillée.3. RÉACTIFS 3.1. Échangeur de cations fortement acide, en forme H +. Préalablement à son emploi, faire gonfier la résine par immersion dans de l'eau pendant une nuit. 3.2. Solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium. 3.3. Papier indicateur de pH.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon Utiliser la solution obtenue en diluant le moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v) comme il est indiqué au chapitre «Acidité totale» en 5.1.2.4.2. Préparation de la colonne d'échangeur d'ions Introduire dans la colonne environ 10 ml d'échangeur d'ions préalablement gonflé en forme H+; rincer la colonne avec de l'eau distillée jusqu'à élimination de l'acidité que l'on contrôle avec le papier indicateur.4.3. Échange d'ions Faire passer à travers la colonne 100 ml de la solution de moût concentré rectifié, préparée comme indiqué en 4.1, à raison de 1 goutte par seconde. Recueillir l'effluent dans un vase cylindrique. Rincer la colonne avec 50 ml d'eau distillée. Titrer l'acidité de l'effluent (y compris l'eau de rinçage) par la solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH soit égal à 7 à 20 °C. L'addition de liqueur alcaline doit être faite lentement et la solution constamment agitée. Soit n ml le volume de solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium versé.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS Les cations totaux sont exprimés en milliéquivalents par kilogramme de sucres totaux avec 1 décimale.5.1. Calculs - Acidité de l'effluent exprimée en milliéquivalents par kilogramme de moût concentré rectifié:E = 2,5 · n.- Acidité totale du moût concentré rectifié en milliéquivalents par kilogramme (voir «Acidité totale» en 6.1.2): a.- Cations totaux en milliéquivalents par kilogramme de sucres totaux: P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux.b) CONDUCTIVITÉ 1. PRINCIPE Mesure de la conductivité électrique d'une colonne de liquide, délimitée par deux électrodes de platine maintenues parallèles, constituant l'une des branches d'un point de Wheatstone. La conductivité varie avec la température. Elle est exprimée à 20 °C.2. APPAREIL 2.1. Conductimètre permettant des mesures de conductivité dans un domaine compris entre 1 et 1 000 microsiemens par cm. 2.2. Bain d'eau permettant d'amener la température des échantillons à analyser à environ 20 °C (20 ± 2 °C).3. RÉACTIFS 3.1. Eau déminéralisée de conductivité spécifique inférieure à 2 microsiemens par cm à 20 °C. 3.2. Solution de chlorure de potassium de référence. Dissoudre 0,581 g de chlorure de potassium, KCl, préalablement séché jusqu'à masse constante à la température de 105 °C, dans de l'eau déminéralisée (3.1). Compléter à 1 litre avec de l'eau déminéralisée (3.1). Cette solution a une conductivité de 1 000 microsiemens par cm à 20 °C. Sa durée de conservation est limitée à 3 mois.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Préparation de l'échantillon à analyser Utiliser la solution dont la teneur en sucres totaux est de 25 pour 100 (m/m) (25° Brix) comme il est indiqué au chapitre «Détermination du pH», en 4.1.2.4.2. Détermination de la conductivité Amener l'échantillon à analyser à 20 °C par immersion dans un bain d'eau. Contrôler la température à 0,1 °C près. Rincer deux fois la cellule de mesure du conductimètre avec la solution à examiner. Mesurer la conductivité exprimée en microsiemens par centimètre.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS La conductivité est exprimée en microsiemens par centimètre (Scm 1) à 20 °C, sans décimale, pour la solution à 25 pour 100 (m/m) (25° Brix) du moût concentré rectifié.5.1. Calculs Si l'appareil n'est pas pourvu d'un compensateur de température, corriger la conductivité mesurée au moyen de la table I. Si la température est inférieure à 20 °C, ajouter la correction; si la température est supérieure à 20 °C, soustraire la correction. TABLE I Corrections de conductivité pour températures différentes de 20 °C en microsiemens cm 1 ConductivitéTempératures20,2 19,820,4 19,620,6 19,420,8 19,221,0 19,021,2 18,821,4 18,621,6 18,421,8 18,222,0 (¹) 18,0 (²) 0000 0 0 0 0 0 0 0 50001 1 1 1 1 2 2 2100011 2 2 3 3 3 4 4150112 3 3 4 5 5 6 7200123 3 4 5 6 7 8 9250123 4 6 7 8 91011300134 5 7 8 9111213350135 6 8 911121415400235 7 91112141618450236 8101214161820500247 91113151820225502571012141719222460035811131618212426(¹) Soustraire la correction. (²) Ajouter la correction. c) HYDROXYMÉTHYLFURFURAL 1. PRINCIPE DES MÉTHODES 1.1. Méthode colorimétrique Les aldéhydes dérivés du furanne, dont le principal est l'hydroxyméthylfurfural, réagissent avec l'acide barbiturique et la paratoluidine pour donner un composé rouge qui est dosé par colorimétrie à 550 nm.1.2. Méthode par chromatographie liquide haute performance Séparation sur colonne en phase inversée et détermination à 280 nm.2. MÉTHODE COLORIMÉTRIQUE 2.1. Appareils 2.1.1. Spectrophotomètre permettant des mesures entre 300 et 700 nm. 2.1.2. Cuves de verre, de trajet optique égal à 1 cm.2.2. Réactifs 2.2.1. Acide barbiturique en solution à 0,5 pour 100 (m/v) Dissoudre 500 mg d'acide barbiturique, C4O3N2H4, dans de l'eau distillée en chauffant légèrement sur bain d'eau à 100 °C; porter à 100 ml avec de l'eau distillée. La solution se conserve environ 1 semaine.2.2.2. Paratoluidine en solution à 10 pour 100 (m/v) 10 g de paratoluidine, C6H4(CH3) NH2 sont placés dans une fiole jaugée de 100 ml; ajouter 50 ml d'isopropanol, CH3CH(OH)CH3 et 10 ml d'acide acétique glacial, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml); compléter à 100 ml avec de l'isopropanol. Cette solution doit être renouvelée tous les jours.2.2.3. Éthanal (CH3CHO) en solution aqueuse à 1 pour 100 (m/v) À préparer extemporanément.2.2.4. Hydroxyméthylfurfural, C6O3H6 en solution aqueuse à 1 g/l Préparer par dilutions successives des solutions titrant 5 - 10 - 20 - 30 et 40 mg/l. La solution à 1 g/l et ses dilutions doivent être fraîchement préparées.2.3. Mode opératoire 2.3.1.Préparation de l'échantillon Utiliser la solution obtenue en diluant le moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v) comme il est indiqué au chapitre «Acidité totale» en 5.1.2. Opérer le dosage sur 2 ml de cette solution.2.3.2. Dosage colorimétrique Dans 2 flacons a et b de 25 ml bouchés à l'émeri, placer 2 ml d'échantillon préparé comme il est indiqué en 2.3.1. Placer dans chaque flacon 5 ml de solution de paratoluidine (2.2.2); mélanger. Ajouter dans le flacon b(Témoin) 1 ml d'eau distillée, et dans le flacon a (Mesure) 1 ml de solution d'acide barbiturique (2.2.1). Agiter pour homogénéiser. Transvaser le contenu des flacons dans les cuves de 1 cm de trajet optique du spectrophotomètre. Le zéro de l'échelle des absorbances étant réglé sur le contenu du flacon b pour la longueur d'onde 550 nm, suivre la variation de l'absorbance du contenu du flacon a; relever sa valeur maximale A qui est atteinte entre 2 et 5 minutes. Les échantillons dont la teneur en hydroxyméthylfurfural est supérieure à 30 mg/l doivent être dilués avant l'analyse.2.3.3. Établissement de la courbe d'étalonnage Dans 2 flacons a et b de 25 ml, placer 2 ml de chacune des solutions d'hydroxyméthylfurfural à 5 - 10 - 20 - 30 et 40 mg/l (2.2.4) et les traiter comme il a été décrit en 2.3.2. La représentation graphique des absorbances en fonction des teneurs en milligrammes par litre en hydroxyméthylfurfural des solutions-étalons est une droite passant par l'origine.2.4. Expression des résultats La teneur en hydroxyméthylfurfural des moûts concentrés rectifiés est exprimée en milligrammes par kilogramme de sucres totaux.2.4.1. Mode de calcul La teneur C mg/l en hydroxyméthylfurfural de l'échantillon à analyser est obtenue en reportant sur la courbe d'étalonnage l'absorbance A déterminée sur cet échantillon. Teneur en hydroxyméthylfurfural en milligrammes par kilogramme de sucres totaux:P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux du moût concentré rectifié. 3. MÉTHODE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE 3.1.Appareils 3.1.1. Chromatographie en phase liquide haute performance équipée: - d'un injecteur à boucle de 5 ou 10 µl,- d'un détecteur, spectrophotomètre permettant des mesures à 280 nm,- d'une colonne de silice greffée octadécyl (par exemple: Bondapak C18 - Corasil, Waters Ass.),- d'un enregistreur, éventuellement d'un intégrateur.Débit de la phase mobile: 1,5 ml/minute.3.1.2. Dispositif de filtration sur membrane (0,45 µm) 3.2. Réactifs 3.2.1. Eau bidistillée. 3.2.2. Méthanol, CH3OH distillé ou de qualité HPLC. 3.2.4. Acide acétique, CH3COOH (r 20 = 1,05 g/ml). 3.2.4. Phase mobile: eau-méthanol (3.2.2) acide acétique (3.2.3) prélablement filtrés sur membrane (0,45 µm), (40 - 9 - 1 v/v). Cette phase mobile doit être préparée chaque jour et dégazée avant utilisation. 3.2.5. Solution de référence d'hydroxyméthylfurfural à 25 mg/l (m/v). Placer, dans une fiole jaugée de 100 ml, 25 mg exactement pesés d'hydroxyméthylfurfural, C6H3O6 et compléter au volume avec du méthanol (3.2.2). Diluer cette solution au 1/10e avec du méthanol (3.2.2) et la filtrer sur membrane (0,45 µm). Cette solution, placée au réfrigérateur en flacon de verre brun, hermétiquement fermé, se conserve 2 à 3 mois.3.3. Mode opératoire 3.3.1. Préparation de l'échantillon Utiliser la solution obtenue en diluant le moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v) comme il est indiqué au chapitre «Acidité totale» en 5.1.2 et la filtrer sur membrane (0,45 µm).3.3.2. Détermination chromatographique Injecter dans le chromatographe 5 (ou 10) µl de l'échantillon préparé comme indiqué en 3.3.1 et 5 (ou 10) µl de solution de référence d'hydroxyméthylfurfural (3.2.5). Enregistrer le chromatogramme. Le temps de rétention de l'hydroxyméthylfurfural est voisin de 6 7 minutes.3.4. Expression des résultats La teneur en hydroxyméthylfurfural des moûts concentrés rectifiés est exprimée en milligrammes par kilogramme de sucres totaux.3.4.1. Mode de calcul Soit C mg/l, la teneur en hydroxyméthylfurfural de lasolution de moût concentré rectifié à 40 pour 100 (m/v). Teneur en hydroxyméthylfurfural en milligrammes par kilogramme de sucres totaux:P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux du moût concentré rectifié.d) MÉTAUX LOURDS 1. PRINCIPES I. Méthode rapide d'évaluation des métaux lourds Les métaux lourds sont mis en évidence dans le moût concentré rectifié convenablement dilué par la coloration que donne la formation de sulfures. Ils sont évalués comparativement à une solution-étalon de plomb correspondant à la teneur maximale admissible.II. Détermination de la teneur en plomb par spectrophotométrie d'absorption atomique Le chélate que donne le plomb avec le pyrrolidinedithiocarbamate d'ammonium est extrait par la méthylisobutylcétone dont on mesure l'absorbance à 283,3 nm. La teneur en plomb est déterminée par la méthode des surcharges.2. MÉTHODE RAPIDE D'ÉVALUATION DES MÉTAUX LOURDS 2.1. Réactifs 2.1.1. Acide chlorhydrique dilué à 70 pour 100 (m/v) Prélever 70 g d'acide chlorhydrique (HCl), (r 20 = 1,16 1,19 g/ml) et compléter à 100 ml avec de l'eau.2.1.2. Acide chlorhydrique dilué à 20 pour 100 (m/v) Prélever 20 g d'acide chlorhydrique (HCl), (r 20 = 1,16 1,19 g/ml) et compléter à 100 ml avec de l'eau.2.1.3. Ammoniaque diluée Prélever 14 g d'ammoniaque (NH3), (r 20 = 0,931 0,934 g/ml) et compléter à 100 ml avec de l'eau.2.1.4. Solution tampon pH 3,5 Dissoudre 25 g d'acétate d'ammonium (CH3COONH4), dans 25 ml d'eau et ajouter 38 ml d'acide chlorhydrique dilué (2.1.1). Ajuster le pH si nécessaire avec de l'acide chlorhydrique dilué (2.1.2) ou de l'ammoniaque diluée (2.1.3) et compléter à 100 ml avec de l'eau.2.1.5. Solution de thioacétamide, (C2H5NS), à 4 pour 100 (m/v) 2.1.6. Solution de glycérol (C3H8O3), à 85 pour 100 (m/v)(n 20 °CD= 1,449 1,455).2.1.7. Réactif au thioacétamide À 0,2 ml de solution de thioacétamide (2.1.5), ajouter 1 ml d'un mélange de 5 ml d'eau, 15 ml d'hydroxyde de sodium en solution 1 M et 20 ml de glycérol (2.1.6). Chauffer au bain d'eau à 100° C pendant 20 secondes. Préparer extemporanément.2.1.8. Solution de plomb à 0,002 g/l Préparer une solution à 1 g/l de plomb en dissolvant dans de l'eau 0,400 g de nitrate de plomb, Pb (NO3)2 et compléter à 250 ml avec de l'eau. Diluer cette solution au moment de l'emploi à 2 pour 1 000 (v/v) avec de l'eau pour obtenir la solution à 0,002 g/l.2.2. Mode opératoire Dissoudre une prise d'essai de 10 g de moût concentré rectifié dans 10 ml d'eau. Ajouter 2 ml de solution tampon pH 3,5 (2.1.4); mélanger. Ajouter 1,2 ml de réactif au thioacétamide (2.1.7). Mélanger inmédiatement. Préparer le témoin dans les mêmes conditions en utilisant 10 ml de solution à 0,002 g/l de plomb (2.1.8). Après 2 minutes, la coloration brune éventuelle de la solution de moût concentré rectifié ne doit pas être plus intense que celle du témoin.2.3. Calculs L'essai témoin, dans les conditions opératoires, correspond à une teneur maximale admissible de métaux lourds exprimés en plomb de 2 mg/kg de moût concentré rectifié.3. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN PLOMB PAR SPECTROPHOTOMÉTRIE D'ABSORPTION ATOMIQUE 3.1. Appareils 3.1.1. Spectrophotomètre d'absorption atomique équipé d'un brûler alimenté par de l'air et de l'acétylène. 3.1.2. Lampe à cathode creuse au plomb.3.2. Réactifs 3.2.1. Acide acétique dilué. Prélever 12 g d'acide acétique glacial (r 20 = 1,05 g/ml) et compléter à 100 ml avec de l'eau. 3.2.2. Solution de pyrrolidinedithiocarbamate d'ammonium C5H12N2S2, à 1 pour 100 (m/v). 3.2.3. Méthylisobutylcétone, (CH3)2 CHCH2COCH3. 3.2.4. Solution de plomb à 0,010 g/l de plomb. Diluer à 1 pour 100 (v/v) la solution de plomb à 1 g/l (2.1.8).3.3. Mode opératoire 3.3.1. Solution à examiner Dissoudre 10 g de moût concentré rectifié dans un mélange à volumes égaux d'acide acétique dilué (3.2.1) et d'eau et compléter à 100 ml avec ce mélange. Ajouter 2 ml de solution de pyrrolidinedithiocarbamate d'ammonium (3.2.2) et 10 ml de méthylisobutylcétone (3.2.3). Agiter à l'abri d'une lumière vive pendant 30 secondes. Laisser séparer les deux couches. Utiliser la couche méthylisobutylcétone.3.3.2. Solutions de référence Préparer 3 solutions de référence contenant en plus des 10 g de moût concentré rectifié, respectivement 1 2 et 3 ml de la solution de plomb à 0,010 g/l (3.2.4). Les traiter comme la solution à examiner.3.3.3. Témoin Préparer un témoin en procédant dans les mêmes conditions qu'en 3.3.1 pour la solution à examiner mais sans addition de moût concentré rectifié.3.3.4. Détermination Sélectionner la longeur d'onde 283,3 nm. Pulvériser dans la flamme la méthylisobutylcétone provenant de l'essai témoin et régler l'absorbance zéro. En opérant sur leurs solvants d'extraction respectifs, déterminer les absorbances correspondant à la solution à examiner et aux solutions de référence.3.4. Expression des résultats Exprimer la teneur en plomb en milligrammes par kilogramme du moût concentré rectifié avec 1 décimale.3.4.1. Calculs Tracer la courbe représentant la variation des absorbances en fonction de la concentration du plomb ajouté dans les solutions de référence, la concentration zéro correspondant à la solution à examiner. Extrapoler la droite joignant les points jusqu'à ce qu'elle rencontre l'axe des concentrations du côté négatif. La distance de ce point à l'origine représente la concentration en plomb de la solution à examiner.e) DOSAGE CHIMIQUE DE L'ÉTHANOL Cette méthode de dosage est utilisée pour la détermination du titre alcoométrique de liquides faiblement alcooliques tels que les moûts, les moûts concentrés, les moûts concentrés rectifiés.1. PRINCIPE Distillation simple du liquide. Oxydation de l'éthanol du distillat par le dichromate de potassium. Titrage de l'excès dichromate par une solution de fer II.2. APPAREIL 2.1. Utiliser l'appareil de distillation décrit en 3.2 au chapitre «Titre alcoométrique».3. RÉACTIFS 3.1. Solution de dichromate de potassium Dissoudre 33,600 g de dichromate de potassium (K2Cr2O7), dans une quantité suffisante d'eau pour faire 1 litre à 20° C. Un millilitre de cette solution oxyde 7,8924 mg d'alcool.3.2. Solution de sulfate de fer II et d'ammonium Dissoudre 135 g de sulfate de fer II et d'ammonium, Fe SO4, (NH4)2SO4, 6 H2O dans une quantité d'eau suffisante pour faire 1 litre et ajouter 20 ml d'acide sulfurique concentré (H2SO4), (r 20 = 1,84 g/ml). Cette solution correspond sensiblement à son demi-volume de solution de dichromate lorsqu'elle vient d'être préparée. Elle s'oxyde lentement par la suite.3.3. Solution de permanganate de potassium Dissoudre 1,088 g de permanganate de potassium, KMnO4, dans une quantité suffisante d'eau pour faire 1 litre.3.4. Acide sulfurique dilué 1/2 (v/v) À 500 ml d'eau, ajouter peu à peu et en agitant 500 ml d'acide sulfurique (H2SO4) (r 20 = 1,84 g/ml).3.5. Réactif à l'ortho-phénanthroline ferreuse Dissoudre 0,695 g de sulfate ferreux, FeSO4, 7 H2O, dans 100 ml d'eau, ajouter 1,485 g de monohydrate d'ortho-phénanthroline C12H8N2, H2O. Chauffer pour favoriser la dissolution. Cette solution, de couleur rouge vif, se conserve très bien.4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Distillation Placer dans le ballon de distillation 100 g du moût concentré rectifié et 100 ml d'eau. Recueillir le distillat dans un ballon jaugé de 100 ml et porter au trait de jauge avec de l'eau.4.2. Oxydation Dans un flacon bouché à l'émeri de 300 ml dont le goulot est terminé par une partie évasée, ce qui permet de rincer le goulot sans pertes, placer 20 ml de solution titrée de dichromate de potassium (3.1), 20 ml d'acide sulfurique dilué 1/2 (v/v) (3.4) et agiter. Ajouter 20 ml de distillat. Boucher le flacon, agiter et attendre 30 minutes au moins, en agitant de temps en temps (flacon «dosage»). Procéder au titrage de la solution de sulfate de fer II et d'ammonium (3.2) par rapport à la solution de dichromate de potassium en plaçant dans un flacon identique les mêmes quantités de réactifs mais en remplaçant les 20 ml de distillat par 20 ml d'eau distillée (flacon «témoin»).4.3. Titrage Ajouter 4 gouttes de réactif à l'ortho-phénanthroline (3.5) au contenu du flacon «dosage». Titrer l'excès de dichromate en y versant la solution de sulfate de fer II (3.2) et d'ammonium. Arrêter l'addition de solution ferreuse lorsque le milieu passe du bleu-vert au marron. Pour préciser le virage, revenir du marron au bleu-vert avec la solution de permanganate (3.3) de potassium. Retrancher le dixième du volume employé de cette solution, du volume de solution de sulfate de fer II versé. Soit n cette différence. Procéder de même avec le flacon «témoin». Soit n2 la différence.5. EXPRESSION DES RÉSULTATS L'éthanol est exprimée en grammes par kilogramme de sucres totaux avec 1 décimale.5.1. Mode de calcul n2 ml de solution ferreuse réduisent 20 ml de solution de dichromate qui oxydent 157,85 mg d'éthanol pur. Un millilitre de solution de fer II a même pouvoir réducteur que:n' - n ml de solution de fer II ont même pouvoir réducteur que:Èthanol en g/kg de moût concentré rectifié:Èthanol en g/kg de sucres totaux:avec P = teneur pour 100 (m/m) en sucres totaux.f) MESO-INOSITOL, SCYLLO-INOSITOL ET SACCHAROSE 1. PRINCIPE Chromatographie en phase gazeuse de dérivés silanisés.2. RÉACTIFS 2.1. Étalon interne: xylitol (solution aqueuse d'environ 10 g/l additionnée d'une pointe de spatule de sodium azide) 2.2. Bistriméthylsilyltrifluoroacétamide - BSTFA - (C8H18F3NOSi2) 2.3. Triméthylchlorosilane (C3H9ClSi) 2.4. Pyridine p.a. (C5H5N) 2.5. Méso-inositol (C6H12O6)3. APPAREILLAGE 3.1. Chromatographe en phase gazeuse équipé de: 3.2. Colonne capillaire (par exemple, silice fondue, OV 1, épaisseur du film 0,15 µ, longueur 25 m, diamètre intérieur 0,3 mm). Conditions opératoires: gaz vecteur: hydrogène et hélium- débit du gaz vecteur: 2 ml/minute environ,- température de l'injecteur et du détecteur: 300° C,- programmation de température: 1 minute à 160° C, 4° C/minute jusqu'à 260° C, isotherme à 260° C pendant 15 minutes,- rapport de dissociation: 1 à 20 environ. 3.3. Intégrateur. 3.4. Seringue micrométrique 10 µl. 3.5. Micropipettes de 50, 100 et 200 µl. 3.6. Flacons de 2 ml avec un bouchon de téflon. 3.7. Étuve.4. MODE OPÉRATOIRE Additionner environ 5 g de MCR, pesés exactement dans un matras de 50 ml, de 1 ml de solution-étalon de xylitol (2.1) et mettre à niveau avec de l'eau. Après homogénéisation de l'échantillon, prélever 100 µl de solution à introduire dans un flacon et sécher dans un léger courant d'air, après adjonction éventuelle de 100 µl d'éthanol absolu pour faciliter l'évaporation. Dissoudre soigneusement le résidu dans 100 µl de pyridine (2.4), ajouter 100 µl de bistriméthylsilytrifluoroacétamide (2.2) et 10 µl de triméthylchlorosilane (2.3), fermer le flacon avec le bouchon de téflon et placer en étuve à 60° C pendant une heure. Prélever 0,5 µl de liquide clair en injectant, «aiguille vide et chaude», selon le rapport de dissociation susmentionné.5. CALCUL DES COEFFICIENTS DE RÉPONSE 5.1. Préparer une solution contenant:60 g/l de glucose, 60 g/l de fructose, 1 g/l de méso-inositol et 1 g/l de saccharose.Peser 5 g de cette solution et procéder conformément au point 4. À partir du chromatogramme obtenu, calculer les coefficients de réponse du méso-inositol et du saccharose par rapport au xylitol.Pour le scyllo-inositol, qui n'est pas disponible dans le commerce et dont le temps de rétention est compris entre le dernier pic des formes anomériques du glucose et celui du méso-inositol (voir figure jointe), utiliser le même coefficient de réponse que celui du méso-inositol.6. EXPRESSION DES RÉSULTATS 6.1. Le méso-inositol et le scyllo-inositol sont exprimés en milligrammes par kilogramme de sucres totaux. Le saccharose est exprimé en grammes par kilogramme de moût. Figure: Chromatogramme en phase gazeuse du méso-inositol, du scyllo-inositol et du saccharose. (1)Tout pycnomètre de caractéristiques équivalentes peut être employé. (2)Un exemple numérique est donné au point 6 du présent chapitre. (3)Un exemple numérique est donné au point 6 du présent chapitre. (4)La teneur en sucres est exprimée en sucres intervertis. (5)La teneur en sucres est exprimée en sucres intervertis. (6)Exemple: pour un titre massique de 12 %: p = 0,12. (7)Avant de faire ce calcul, la densité relative (ou la masse volumique) du vin mesurée comme il est indiqué plus haut doit être corrigée de l'action de l'acidité volatile suivant la formule: dv = d2020 0,0000086 a ou pv = r20 0,0000086 a a étant la quantité d'acidité volatile en milliéquivalents par litre. (8)Ces valeurs sont données dans l'attente de la constitution d'une banque de données communautaire. (9)Ces valeurs sont données dans l'attente de la constitution d'une banque de données communautaire. (10)Une des appellations commerciales est «norite». (11)105 pascal (Pa) = 1 bar. (12)1 pascal (Pa) = 1 N/m² = 10 5 bar. (13)On ne tient pas compte des autres gaz présents (O2, N2, etc.), en trop faibles quantités pour avoir une influence sur la surpression. (14)Certains vins, tels que des vins de liqueur, etc., donnent un distillat qui n'est pas limpide malgré la filtration; il faut alors placer ce distillat concentré dans un ballon à distiller de 200 ml, le porter à 30 ml avec de l'eau et le distiller encore alcalin en rejetant le premier distillat de volume égal à 15 ml environ. Refroidir le contenu du ballon, l'acidifier par 5 ml environ d'acide sulfurique dilué et reprendre la distillation en recueillant le distillat sur 5 ml de solution M d'hydroxyde de sodium. Distiller 5 ml environ de liquide. Il est alors limpide. (15)Cette addition est facultative, certaines personnes observent mieux l'apparition du trouble dans une solution rose que dans une solution incolore. (16)n2 est égal à 0,05 ou 0,1 ml, si le volume d'eau employé est inférieur à 10 ml. Pour avoir un virage sensible, il faut que ce volume soit aussi petit que possible, éviter donc toute cause de dilution, dans la mesure du possible, au cours de l'opération principale. (17)Cette distance doit être comptée dans le sens OC. Fin du document Document livré le: 11/03/1999

consulter cette page sur europa.eu.int