Législation communautaire en vigueur Document 379L1067 Chapitres du répertoire où le document peut être trouvé: [ 13.30.14 - Denrées alimentaires ] [ 03.60.56 - Produits laitiers ] 379L1067 Première directive 79/1067/CEE de la Commission, du 13 novembre 1979, portant fixation des méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle de certains laits de conserve partiellement ou totalement déshydratés destinés à l'alimentation humaine Journal officiel n° L 327 du 24/12/1979 p. 0029 - 0052 Edition spéciale grecque ...: Chapitre 13 Tome 9 p. 56 Edition spéciale espagnole .: Chapitre 13 Tome 10 p. 264 Edition spéciale portugaise : Chapitre 13 Tome 10 p. 264 Edition spéciale finnoise ...: Chapitre 13 Tome 10 p. 150 Edition spéciale suédoise ...: Chapitre 13 Tome 10 p. 150 Modifications: Repris par 294A0103(52) (JO L 001 03.01.1994 p.263) Texte: PREMIÈRE DIRECTIVE DE LA COMMISSION du 13 novembre 1979 portant fixation des méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle de certains laits de conserve partiellement ou totalement déshydratés destinés à l'alimentation humaine (79/1067/CEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu la directive 76/118/CEE du Conseil, du 18 décembre 1975, relative au rapprochement des législations des États membres concernant certains laits de conserve partiellement ou totalement déshydratés destinés à l'alimentation humaine (1), et notamment son article 11, considérant que l'article 11 de la directive 76/118/CEE prévoit que la composition de certains laits de conserve partiellement ou totalement déshydratés doit être contrôlée par des méthodes d'analyse communautaires; considérant qu'il est souhaitable d'adopter une première série de méthodes dont l'étude est terminée; considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis exprimé par le comité permanent des denrées alimentaires; A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE: Article premier Les États membres prennent toutes les mesures utiles pour que les analyses nécessaires au contrôle des critères figurant à l'annexe I soient effectuées conformément aux méthodes décrites à l'annexe II. Article 2 Dans le cas où des méthodes alternatives sont indiquées pour une seule détermination, l'échantillon peut être analysé par l'une quelconque de ces méthodes. Le procès-verbal de l'essai visé à l'annexe II doit mentionner la méthode employée. Article 3 Les États membres mettent en vigueur les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive, dans un délai de dix-huit mois à compter de sa notification. Ils en informent immédiatement la Commission. Article 4 Les États membres sont destinataires de la présente directive. Fait à Bruxelles, le 13 novembre 1979. Par la Commission Étienne DAVIGNON Membre de la Commission (1)JO nº L 24 du 30.1.1976, p. 49. ANNEXE I DOMAINE D'APPLICATION DES PREMIÈRES MÉTHODES D'ANALYSE COMMUNAUTAIRES À APPLIQUER DANS LA DIRECTIVE CONCERNANT CERTAINS LAITS DE CONSERVE PARTIELLEMENT OU TOTALEMENT DÉSHYDRATÉS I. Dispositions générales II. Détermination de la teneur en matière sèche: - lait concentré riche en matière grasse ou lait concentré non sucré riche en matière grasse [par la méthode 1 (annexe II)], - lait concentré ou lait concentré non sucré ou lait entier concentré [par la méthode I (annexe II)], - lait partiellement écrémé concentré ou lait partiellement écrémé concentré non sucré [par la méthode 1 (annexe II)], - lait écrémé concentré ou lait écrémé concentré non sucré [par la méthode 1 (annexe II)], - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré [par la méthode 1 (annexe II)], - lait partiellement écrémé concentré sucré [par la méthode 1 (annexe II)], - lait écrémé concentré sucré [par la méthode 1 (annexe II)]. III. Détermination de la teneur en humidité - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse [par la méthode 2 (annexe II)], - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier [par la méthode 2 (annexe II)], - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé [par la méthode 2 (annexe II)], - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé [par la méthode 2 (annexe II)]. IV. Détermination de la matière grasse - lait concentré riche en matière grasse ou lait concentré non sucré riche en matière grasse [par la méthode 3 (annexe II)], - lait concentré ou lait concentré non sucré ou lait entier concentré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait partiellement écrémé concentré ou lait partiellement écrémé concentré non sucré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait écrémé concentré ou lait écrémé concentré non sucré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait partiellement écrémé concentré sucré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait écrémé concentré sucré [par la méthode 3 (annexe II)], - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse [par la méthode 4 (annexe II)], - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier [par la méthode 4 (annexe II)], - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé [par la méthode 4 (annexe II), - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé [par la méthode 4 (annexe II)]. V. Détermination du saccharose - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré [par la méthode 5 (annexe II)], - lait partiellement écrémé concentré sucré [par la méthode 5 (annexe II)], - lait écrémé concentré sucré [par la méthode 5 (annexe II)]. VI. Détermination de l'acide lactique et des lactates - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse [par la méthode 6 (annexe II)], - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier [par la méthode 6 (annexe II)], - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé [par la méthode 6 (annexe II)], - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé [par la méthode 6 (annexe II)]. VII. Détermination de l'activité de la phospatase - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse [par la méthode 7 ou 8 (annexe II)], - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier [par la méthode 7 ou 8 (annexe II)], - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé [par la méthode 7 ou 8 (annexe II)], - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé [par la méthode 7 ou 8 (annexe II)]. ANNEXE II MÉTHODES D'ANALYSE RELATIVES À LA COMPOSITION DE CERTAINS LAITS DE CONSERVE PARTIELLEMENT OU TOTALEMENT DÉSHYDRATÉS DÉSTINÉS À LA CONSOMMATION HUMAINE DISPOSITIONS GÉNÉRALES 1. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON POUR L'ANALYSE CHIMIQUE 1.1. Lait concentré riche en matière grasse ou lait concentré non sucré riche en matière grasse Lait concentré ou lait concentré non sucré ou lait entier concentré Lait partiellement écrémé concentré ou lait partiellement écrémé concentré non sucré Lait écrémé concentré ou lait écrémé concentré non sucré Agiter la boîte fermée en la retournant. Ouvrir la boîte et transvaser le lait lentement dans un second récipient pouvant être fermé hermétiquement, en mélangeant par transvasements successifs. Veillez à ce que tous les restes de graisse et de lait adhérant aux parois et au fond de la boîte soient mélangés à l'échantillon. Fermer le récipient. Si le contenu n'est pas homogène, tiédir la boîte dans un bain d'eau à 40 ºC. Agiter vigoureusement toutes les 15 minutes. Après 2 heures, sortir le récipient du bain d'eau et laisser refroidir à température ambiante. Enlever le couvercle et mélanger soigneusement le contenu à l'aide d'une cuiller ou d'une spatule (si la graisse est désémulsionnée, il convient de ne pas procéder à l'analyse de l'échantillon). Conserver dans un endroit frais. 1.2. Lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré Lait partiellement écrémé concentré sucré Lait écrémé concentré sucré Boîtes: Chauffer la boîte fermée dans un bain d'eau de 30 à 40 ºC pendant 30 minutes environ. Ouvrir la boîte et mélanger soigneusement le contenu avec une spatule ou une cuiller, en effectuant des mouvements ascendants, descendants et circulaires, afin d'obtenir un mélange intime des couches supérieures et inférieures avec l'ensemble du contenu. Veiller à ce que les restes du lait adhérant aux parois et au fond de la boîte soient incorporés à l'échantillon. Dans la mesure du possible, transvaser le contenu dans un second récipient muni d'une fermeture étanche. Fermer le récipient et le conserver au frais. Tubes: Découper le fond et transvaser le contenu dans un récipient muni d'une fermeture étanche. Découper ensuite le tube dans le sens de la longueur, décoller toutes les matières adhérent aux parois et les mélanger soigneusement au reste du contenu. Conserver le récipient au frais. 1.3. Lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse Lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier Lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé Lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé Transvaser le lait en poudre dans un récipient propre et sec (à fermeture étanche) ayant une capacité correspondant au double du volume de poudre. Refermer le récipient immédiatement et mélanger intimement le lait en poudre par agitations et renversements successifs. Pendant la préparation de l'échantillon, il faut éviter, dans toute la mesure du possible d'exposer le lait en poudre à l'air atmosphérique, de manière à réduire au minimum l'absorption d'eau. 2. RÉACTIFS 2.1. Eau 2.1.1. Lorsqu'on utilise de l'eau pour les solutions, dilutions ou lavages, il faut employer de l'eau distillée, de l'eau déminéralisée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente. 2.1.2. Lorsque le terme «solution» ou «dilution» est utilisé sans autre indication, il s'agit de solution dans l'eau ou de dilution dans l'eau. 2.2. Produits chimiques Tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique reconnue, sauf spécifications spéciales. 3. APPAREILLAGE 3.1. Liste des appareils Les listes des appareils ne contiennent que les articles à usage spécialisé et que les articles à spécification spéciale. 3.2. Balance analytique Le terme «balance analytique» se rapporte à une balance capable de peser avec une précision de 0,1 mg au moins. 4. EXPRESSION DES RÉSULTATS 4.1. Calcul du pourcentage Sauf spécifications contraires, le résultat sera calculé en pourcentage de la masse de l'échantillon reçu au laboratoire. 4.2. Nombre de chiffres significatifs Les résultats ne contiendront pas un nombre de chiffres significatifs supérieur à celui qui est justifié par la précision de la méthode d'analyse utilisée. 5. PROCÈS-VERBAL DE L'ESSAI Le procès-verbal de l'essai précisera la méthode d'analyse utilisée ainsi que les résultats obtenus. Il mentionnera, en outre, tous les détails de la procédure, non spécifiés dans la méthode d'analyse ou facultatifs, ainsi que les conditions susceptibles d'avoir influencé le résultat obtenu. Le procès-verbal de l'essai fournira toutes les informations nécessaires à l'identification complète de l'échantillon. MÉTHODE 1 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN MATIÈRE SÈCHE (Étuve à 99 ºC) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer la teneur en matière sèche des laits énumérés ci-après: - lait concentré riche en matière grasse ou lait concentré non sucré riche en matière grasse, - lait concentré ou lait concentré non sucré ou lait entier concentré, - lait partiellement écrémé concentré ou lait partiellement écrémé concentré non sucré, - lait écrémé concentré ou lait écrémé concentré non sucré, - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré, - lait partiellement écrémé concentré sucré, - lait écrémé concentré sucré. 2. DÉFINITION Matière sèche du lait concentré : matière sèche déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Une quantité connue de l'échantillon est diluée avec de l'eau, mélangée avec du sable et desséchée à une température de 99 ± 1 ºC. La masse après dessiccation constitue la masse de matière sèche. La matière sèche est exprimée en pourcentage de la masse de l'échantillon. 4. RÉACTIFS Sable de quartz ou sable de mer (taille des grains : 0,18 - 0,5 mm, traité à l'acide chlorhydrique, passé à travers un tamis de 500 microns et retenu par un tamis de 180 microns). Il doit correspondre au test de contrôle décrit ci-après: Chauffer environ 25 g de sable pendant 2 heures dans l'étuve (point 5.3), comme décrit aux points 6.1 à 6.3. Ajouter 5 ml d'eau, chauffer à nouveau dans l'étuve pendant 2 heures, refroidir et peser à nouveau. La différence entre les deux pesées ne doit pas dépasser 0,5 mg. Le cas échéant, traiter le sable pendant 3 jours à l'acide chlorhydrique à 25 % ; mélanger de temps en temps. Laver à l'eau jusqu'à disparition de la réaction acide ou jusqu'à ce que l'eau de lavage soit exempte de chlorure. Sécher à 160 ºC et répéter le test comme ci-avant. 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Capsules métalliques, de préférence en nickel, en aluminium ou en acier inoxydable. Les capsules doivent être munies de couvercles s'adaptant convenablement mais pouvant être otés aisément. Les dimensions convenant le mieux sont : diamètre 60 à 80 mm, profondeur 25 mm environ. 5.3. Étuves à dessiccation à la pression atmosphérique, bien ventilée et contrôlée par thermostat, température réglée à 99 ± 1 ºC. Il importe que la température soit uniforme dans l'ensemble de l'étuve. 5.4. Dessiccateur équipé d'un indicateur hygrométrique, garni de gel de silice récemment activé ou d'un desséchant équivalent. 5.5. Courtes baguettes de verre, dont l'une des extrémités est aplatie et d'une longueur correspondant aux dimensions intérieures des capsules métalliques (point 5.2). 5.6. Bain d'eau bouillante. 6. MODE OPÉRATOIRE 6.1. Placer dans la capsule (point 5.2) environ 25 g de sable (point 4) et une courte baguette de verre (point 5.5). 6.2. Chauffer la capsule, le couvercle et le contenu, le couvercle étant enlevé, pendant 2 heures dans l'étuve (point 5.3). 6.3. Replacer le couvercle sur la capsule et la transférer dans le dessiccateur (point 5.4). Laisser refroidir à la température ambiante et peser à 0,1 mg près (M0). 6.4. Inclinant le couvercle, amasser le sable d'un côte de la capsule. Introduire dans l'espace libre ainsi aménagé, environ 1,5 g de l'échantillon si c'est du lait concentré sucré et 3,0 g si c'est du lait concentré non sucré. Replacer le couvercle et peser à 0,1 mg près (M1). 6.5. Enlever le couvercle, ajouter 5 ml d'eau et, au moyen de la baguette de verre (point 5.5), mélanger les liquides, puis le sable et la partie liquide. Laisser la baguette dans le mélange. 6.6. Placer la capsule sur le bain d'eau bouillante (point 5.6) jusqu'à ce que l'eau soit évaporée (soit 20 minutes en général). Remuer le mélange de temps en temps avec la baguette afin que la masse soit bien aérée et qu'elle ne s'agglutine pas après dessication. Placer la baguette à l'intérieur de la capsule. 6.7. Placer la capsule et le couvercle pendant 1 h 30 environ dans l'étuve. 6.8. Remettre le couvercle, transférer la capsule dans le dessiccateur et l'y laisser refroidir jusqu'à la température ambiante ; peser à 0,1 mg près. 6.9. Découvrir la capsule et la chauffer, ainsi que son couvercle, pendant 1 heure dans l'étuve. 6.10. Répéter l'opération du point 6.8. 6.11. Répéter les opérations décrites aux points 6.9 et 6.8 jusqu'à ce que deux pesées successives ne révèlent pas un écart de plus de 0,5 mg ou que la masse augmente. Employer dans ce dernier cas la pesée avec la masse la plus basse obtenue dans les calculs (point 7.1). Veiller à ce que le poids final noté soit M2g. 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul La teneur en matière sèche, exprimée en pourcentage de la masse d'échantillon, est indiquée par la formule: >PIC FILE= "T0015635"> où: M0 = masse, en grammes, de la capsule, de son couvercle et du sable, après l'opération du point 6.3, M1 = masse, en grammes, du couvercle, de la capsule, du sable et de l'échantillon après l'opération du point 6.4, M2 = masse, en grammes, du couvercle, de la capsule, du sable et de l'échantillon désséché, après l'opération du point 6.11. 7.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles, effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions, ne doit pas excéder 0,2 g de matière sèche pour 100 g de produit. 8. CALCUL DE LA TENEUR EN MATIÈRES SOLIDES TOTALES ET DE LA TENEUR EN MATIÈRES SOLIDES NON GRASSES DANS LE LAIT 8.1. La teneur en matière solide totale des laits concentrés sucrés est donnée par: - la teneur en matière sèche totale [obtenue par la méthode 1 (annexe II)], - la teneur en saccharose [obtenue par la méthode 5 (annexe II)]. 8.2. La teneur en matière solide non grasse des laits concentrés est donnée par: - la teneur en matière sèche totale [obtenue par la méthode 1 (annexe II)], - la teneur en saccharose [obtenue par la méthode 5 (annexe II)], - la teneur en matière grasse [obtenue par la méthode 3 (annexe II)]. 8.3. La teneur en matière solide non grasse des laits concentrés non sucrés est donnée par: - la teneur en matière sèche totale [obtenue par la méthode 1 (annexe II)], - la teneur en matière grasse [obtenue par la méthode 3 (annexe II)]. MÉTHODE 2 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN HUMIDITÉ (Étuve à 102 ºC) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer la perte de masse à la dessiccation des laits énumérés ci-après: - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse, - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier, - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé, - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé. 2. DÉFINITION Teneur en humidité : la perte de masse à la dessiccation déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La masse résiduaire de la portion d'essai est déterminée après dessiccation à la pression atmosphérique dans une étuve à 102 ± 1 ºC jusqu'à obtention d'une masse constante. La perte de masse est calculée en pourcentage de la masse d'échantillon. 4. APPAREILLAGE 4.1. Balance analytique 4.2. Capsules, de préférence en verre, en nickel, en aluminium ou en acier inoxydable. Les capsules doivent être munies de couvercles s'adaptant convenablement mais pouvant être otés aisément. Les dimensions convenant le mieux sont : diamètre 60 à 80 mm, profondeur 25 mm environ. 4.3. Étuve à la pression atmosphérique, bien ventilée et contrôlée par thermostat, température réglée à 102 ± 1 ºC. Il importe que la température soit uniforme dans l'ensemble de l'étuve. 4.4. Dessiccateur équipé d'un indicateur hygrométrique garni de gel de silice récemment activé ou d'un desséchant équivalent. 5. MODE OPÉRATOIRE 5.1. Enlever le couvercle de la capsule (point 4.2) et placer capsule et couvercle dans l'étuve (point 4.3) pendant 1 heure environ. 5.2. Remettre le couvercle, transférer la capsule dans le dessiccateur (point 4.4) et l'y laisser refroidir jusqu'à la température ambiante ; peser à 0,1 mg près (M0). 5.3. Placer dans la capsule environ 2 g d'échantillon de lait sec, mettre le couvercle sur la capsule et peser rapidement la capsule munie de son couvercle à 0,1 mg près (M1). 5.4. Enlever le couvercle et placer capsule et couvercle pendant 2 heures dans l'étuve. 5.5. Remettre le couvercle, transférer la capsule couverte dans le dessiccateur et l'y laisser refroidir jusqu'à la température ambiante ; peser rapidement à 0,1 mg près. 5.6. Découvrir la capsule et la chauffer, ainsi que son couvercle, pendant 1 heure dans l'étuve. 5.7. Répéter l'opération du point 5.5. 5.8. Répéter les opérations des points 5.6 et 5.5 jusqu'à ce que les pesées successives ne révèlent pas un écart de plus de 0,5 mg ou que la masse augmente. Employer dans ce dernier cas la pesée avec la masse la plus basse obtenue dans les calculs (point 6.1). Veiller à ce que le poids final noté soit M2 g. 6. EXPRESSION DES RÉSULTATS 6.1. Mode de calcul Calculer la perte de masse de l'échantillon à la dessiccation, exprimée en pourcentage de la masse, en utilisant la formule: >PIC FILE= "T0015636"> où: M0 = masse, en grammes, de la capsule et de son couvercle, après l'opération du point 5.2, M1 = masse, en grammes, de la capsule, de son couvercle et de l'échantillon, après l'opération du point 5.3, M2 = masse, en grammes, de la capsule, de son couvercle et de l'échantillon final, après l'opération du point 5.5. 6.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations, effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions, ne doit pas excéder 0,1 g d'eau pour 100 g de produit. MÉTHODE 3 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN MATIÈRE GRASSE (MÉTHODE RÖSE-GOTTLIEB) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer la teneur en matière grasse des laits énumérés ci-après: - lait concentré riche en matière grasse ou lait concentré non sucré riche en matière grasse, - lait concentré ou lait concentré non sucré ou lait entier concentré, - lait partiellement écrémé concentré ou lait partiellement écrémé concentré non sucré, - lait écrémé concentré ou lait écrémé concentré non sucré, - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré, - lait partiellement écrémé concentré sucré, - lait écrémé concentré sucré. 2. DÉFINITION Teneur en matière grasse des laits concentrés : la teneur en matière grasse déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La teneur en matière grasse est déterminée par extraction de la matière grasse d'une solution ammoniaco-alcoolique de l'échantillon à l'aide d'oxyde diéthylique et d'éther de pétrole, évaporation des solvants et pesée du résidu, calcul en pourcentage de la masse de l'échantillon, selon la méthode Röse-Gottlieb. 4. RÉACTIFS Tous les réactifs doivent être conformes aux conditions précisées dans l'essai à blanc (point 6.1). Le cas échéant, les réactifs pourront être distillés à nouveau en présence d'environ 1 g de graisse de beurre pour 100 ml de solvant. 4.1. Solution d'ammoniaque, environ 25 % (m/m) de NH3 (densité à 20 ºC, environ 0,91 g/ml) ou une solution plus concentrée de concentration connue. 4.2. Éthanol, à 96 ± 2 % (v/v) ou, à défaut, de l'éthanol dénaturé avec du méthanol, de l'éthylméthylcétone ou de l'éther de pétrole. 4.3. Oxyde diéthylique, exempt de peroxydes. Note 1 Pour s'assurer que l'oxyde diéthylique est exempt de peroxydes, ajouter à 10 ml d'oxyde conte nus dans une petite éprouvette à bouchon, de verre, préalablement rincée avec un peu d'oxyde, 1 ml d'une solution à 10 % d'iodure de potassium, fraîchement préparée. Agiter et laisser reposer pendant 1 minute. Aucune coloration jaune ne doit apparaître dans l'une ou l'autre des deux couches. Note 2 L'oxyde diéthylique peut être maintenu exempt de peroxydes par l'addition d'une feuille de zinc humide préalablement immergée pendant 1 minute dans une solution acide diluée de sulfate de cuivre puis lavée à l'eau. Pour 1 litre d'oxyde diéthylique, utiliser environ 8 000 mm2 de feuille de zinc coupée en bandes suffisamment longues pour atteindre au moins le milieu du récipient. 4.4. Éther de pétrole, distillant entre 30 et 60 ºC. 4.5. Mélange de solvants, préparé peu de temps avant l'emploi par le mélange de volume égaux d'oxyde diéthylique (point 4.3) et d'éther de pétrole (point 4.4). (On pourra remplacer le mélange de solvants, là où son utilisation est indiquée, par de l'oxyde diéthylique ou par de l'éther de pétrole.) 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Tubes ou flacons d'extraction appropriés, munis de bouchons en verre rodé, ou d'autres fermetures insensibles à l'action des solvants utilisés. 5.3. Flacons à fond plat et à paroi mince, de 150 à 250 ml de capacité. 5.4. Étuve à dessiccation à la pression atmosphérique, bien ventilée, contrôlée par thermostat (température à 102 ± 1 ºC). 5.5. Granules destinés à faciliter l'ébullition, exempts de matière grasse, non poreux, non friables, par exemple perles de verre ou morceaux de carbure de silicium (l'emploi de ces granules est facultatif ; voir à ce sujet le point 6.2.1). 5.6. Siphon correspondant aux tubes d'extraction. 5.7. Centrifugeuse. 6. MODE OPÉRATOIRE 6.1. Essai à blanc En même temps que la détermination de la matière grasse de l'échantillon, effectuer un essai à blanc avec 10 ml d'eau en utilisant le même type d'appareil d'extraction, les mêmes réactifs dans les mêmes proportions et le même mode opératoire que celui décrit ci-avant à l'exclusion du point 6.2.2. Si la valeur de l'essai à blanc dépasse 0,5 mg, il conviendra de vérifier les réactifs et le ou les réactifs impurs devront être purifiés ou remplacés. 6.2. Dosage 6.2.1. Sécher le flacon (point 5.3) (éventuellement après y avoir déposé les matériaux (point 5.5) facilitant une ébullition modérée au cours de l'évaporation des solvants) dans l'étuve (point 5.4) pendant une demi-heure à 1 heure. Laisser refroidir le flacon jusqu'à la température de la salle des balances et peser le flacon une fois refroidi, à 0,1 mg près. 6.2.2. Agiter l'échantillon à 5 g préparé et peser immédiatement à 1 mg près, directement ou par différence, 4 g de lait concentré non sucré ou 2 à 2,5 g de lait concentré sucré dans l'appareil d'extraction (point 5.2). Ajouter de l'eau jusqu'au volume de 10,5 ml et agiter doucement en chauffant légèrement (40 à 50 ºC) jusqu'à dispersion totale du produit. L'échantillon doit être dispersé complètement sinon la détermination sera répétée. 6.2.3. Ajouter 1,5 ml de la solution d'ammoniaque (25 %) (point 4.1) ou un volume correspondant d'une solution plus concentrée et mélanger convenablement. 6.2.4. Ajouter 10 ml d'éthanol (point 4.2) et mélanger les liquides doucement mais complètement dans l'appareil d'extraction maintenu ouvert. 6.2.5. Ajouter 25 ml d'oxyde diéthylique (point 4.3). Refroidir au besoin l'appareil sous l'eau courante. Fermer l'appareil, l'agiter énergiquement et le retourner à plusieurs reprises pendant 1 minute. 6.2.6. Enlever le bouchon avec précaution et ajouter 25 ml d'éther de pétrole (point 4.4), en utilisant les premiers millilitres pour rincer le bouchon et l'intérieur du col de l'appareil et en laissant les liquides de rinçage couler dans l'appareil. Fermer l'appareil en remplaçant le bouchon, agiter et retourner l'appareil à plusieurs reprises pendant 30 secondes. Si l'on ne prévoit pas de centrifugation lors de l'opération décrite au point 6.2.7, ne pas agiter trop énergiquement. 6.2.7. Laisser l'appareil au repos jusqu'à ce que la couche liquide supérieure devienne limpide et se sépare nettement de la phase aqueuse. On peut également effectuer la séparation à l'aide d'une centrifugeuse appropriée (point 5.7). Remarque Si l'on utilise une centrifugeuse dont le moteur n'est pas triphasé, des étincelles peuvent se produire et il faut donc veiller à éviter une explosion ou un incendie par suite de la présence de vapeurs d'éther (en cas de rupture d'un tube, par exemple). 6.2.8. Enlever le bouchon et le rincer, ainsi que l'intérieur du col de l'appareil, avec quelques millilitres du mélange de solvants (point 4.5) laisser les liquides de rinçage couler dans l'appareil. Transvaser avec soin, aussi complètement que possible, la couche supérieure dans le flacon (point 6.2.1) par décantation ou à l'aide d'un siphon (point 5.6). Remarque Si le transvasement n'est pas fait à l'aide d'un siphon, il pourra être nécessaire d'ajouter un peu d'eau pour rehausser l'interface des deux couches afin de faciliter la décantation. 6.2.9. Rincer l'intérieur et l'extérieur du col de l'appareil ou la pointe et la partie inférieure du siphon avec quelques millilitres du mélange de solvants. Laisser les liquides de rinçage de l'extérieur de l'appareil couler dans le flacon et ceux de l'intérieur du col et du siphon dans l'appareil d'extraction. 6.2.10. Procéder à une deuxième extraction en répétant les opérations décrites aux points 6.2.5 à 6.2.9 inclus, mais en utilisant seulement 15 ml d'oxyde diéthylique et 15 ml d'éther de pétrole. 6.2.11. Effectuer une troisième extraction en procédant comme indiqué au point 6.2.10, mais en omettant le rinçage final point (6.2.9). Remarque Dans le cas du lait écrémé concentré non sucré et du lait écrémé concentré sucré, cette troisième extraction n'est pas nécessaire. 6.2.12. Éliminer avec soin par évaporation ou distillation le maximum de solvant (y compris l'éthanol). Si le flacon est de petite capacité, il faudra éliminer un peu de solvant de la manière précitée après chaque extraction. 6.2.13. Quand il ne subsiste plus aucune odeur de solvant, chauffer le flacon, couché, pendant 1 heure, dans l'étuve. 6.2.14. Retirer le flacon de l'étuve, le laisser refroidir jusqu'à la température de la salle des balances et peser à 0,1 mg près. 6.2.15. Répéter les opérations des points 6.2.13 et 6.2.14 en chauffant par périodes de 30 à 60 minutes jusqu'à ce que deux pesées successives ne révèlent pas un écart de plus de 0,5 mg ou que la masse augmente. Employer dans ce dernier cas la pesée la plus basse obtenue dans les calculs (point 7.1). Veiller à ce que le poids final noté soit M1 g. 6.2.16. Ajouter 15 à 25 ml d'éther de pétrole pour vérifier si la matière extraite est entièrement soluble. Chauffer légèrement et agiter le solvant par un mouvement circulaire jusqu'à ce que toute la matière grasse soit en solution. 6.2.16.1. Si la matière extraite est entièrement soluble dans l'éther de pétrole, la masse de matière grasse est la différence entre la pesée du point 6.2.1 et la pesée du point 6.2.15. 6.2.16.2. Si des matières insolubles sont présentes ou toujours en cas de doute extraire complètement la matière grasse contenue dans les flacons par des lavages répétés à l'éther de pétrole chaud, en laissant se déposer la matière non dissoute avant chaque décantation. Rincer trois fois l'extérieur du col du flacon. Chauffer le flacon, couché, pendant 1 heure à l'étuve et le laisser refroidir comme indiqué plus haut (point 6.2.1) jusqu'à la température de la salle des balances ; peser à 0,1 mg près. La masse de la matière grasse est la différence entre la pesée du point 6.2.15 et cette pesée finale. 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul La masse exprimée en grammes, de la matière grasse extraite est donnée par la formule: (M1 - M2) - (B1 - B2) et la teneur en matière grasse de l'échantillon, exprimée en pourcentage, par la formule: >PIC FILE= "T0015637"> où: M1 = masse, en grammes, du flacon M contenant la matière grasse après l'opération du point 6.2.15, M2 = masse, en grammes, du flacon M après l'opération du point 6.2.1 ou, dans le cas où des matières insolubles sont présentes ou en cas de doute après l'opération du point 6.2.16.2, B1 = masse, en grammes, du flacon B de l'essai à blanc après l'opération du point 6.2.15, B2 = masse, en grammes, du flacon B, après l'opération du point 6.2.1 ou, dans le cas où des matières insolubles sont présentes ou en cas de doute après l'opération du point 6.2.16.2, S = masse, en grammes, de la prise d'essai utilisée. 7.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions ne doit pas excéder 0,05 g de matière grasse pour 100 g de produit. MÉTHODE 4 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN MATIÈRE GRASSE (MÉTHODE DE RÖSE-GOTTLIEB) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer la teneur en matière grasse des laits énumérés ci-après: - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse, - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier, - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé, - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé. 2. DÉFINITION La teneur en matière grasse des laits en poudre est la teneur en matière grasse déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La teneur en matière grasse est déterminée par extraction de la matière grasse d'une solution ammoniaco-alcoolique de l'échantillon à l'aide d'oxyde diéthylique et d'éther de pétrole, évaporation des solvants, pesée du résidu et calcul en pourcentage de la masse de l'échantillon, selon le principe de la méthode de Röse-Gottlieb. 4. RÉACTIFS Tous les réactifs doivent être conformes aux conditions précisées dans l'essai à blanc (point 6.1). Le cas échéant, les réactifs pourront être distillés à nouveau en présence d'environ 1 g de graisse de beurre pour 100 ml de solvant. 4.1. Solution d'ammoniaque, environ 25 % (m/m) de NH3 (densité à 20 ºC, environ 0,91 g/ml) ou solution plus concentrée de concentration connue. 4.2. Éthanol, à 96 ± 2 % (v/v) ou, à défaut, de l'éthanol dénaturé avec du méthanol, de l'éthylméthylcétone ou de l'éther de pétrole. 4.3. Oxyde diéthylique exempt de peroxydes. Note 1 Pour s'assurer que l'oxyde diéthylique est exempt de peroxydes ajouter à 10 ml d'oxyde diéthylique contenus dans une petite éprouvette à bouchon de verre, préalablement rincée avec un peu d'oxyde diéthylique, 1 ml d'une solution à 10 % d'iodure de potassium récemment préparée. Agiter et laisser reposer pendant 1 minute. Aucune coloration jaune ne doit apparaître dans l'une ou l'autre des deux couches. Note 2 L'oxyde diéthylique peut être maintenu exempt de peroxydes par addition d'une feuille de zinc humide préalablement immergée pendant 1 minute dans une solution acide diluée de sulfate de cuivre puis lavée à l'eau. Pour un litre d'oxyde diéthylique, utiliser environ 8 000 mm2 de feuille de zinc coupée en bandes suffisamment longues pour atteindre au moins le milieu du récipient. 4.4. Éther de pétrole distillant entre 30 et 60 ºC. 4.5. Mélange de solvants préparé peu de temps avant emploi par le mélange de volumes égaux d'oxyde diéthylique (point 4.3) et d'éther de pétrole (point 4.4). (On pourra remplacer le mélange de solvants, là où son utilisation est prescrite, par de l'oxyde diéthylique ou par de l'éther de pétrole.) 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Tubes ou flacons d'extraction appropriés, pourvus de bouchons en verre rodé, ou d'autres fermetures insensibles à l'action des solvants utilisés. 5.3. Flacons à fond plat, et à paroi mince, de 150 à 250 ml de capacité. 5.4. Étuve à dessiccation à la pression atmosphérique bien ventilée et et contrôlée par thermostat (température à 102 ± 1 ºC). 5.5. Granules destinés à faciliter l'ébullition, exempts de matière grasse, non poreux, non friables, par exemple perles de verre ou morceaux de carbure de silicium (l'emploi de ces granules est facultatif, voir à ce sujet le point 6.2.1). 5.6. Bain d'eau de 60 à 70 ºC. 5.7. Siphon correspondant aux tubes d'extraction. 5.8. Centrifugeuse. 6. MODE OPÉRATOIRE 6.1. Essai à blanc En même temps que la détermination de la teneur en matière grasse de l'échantillon, effectuer un essai à blanc avec 10 ml d'eau en utilisant le même type d'appareil d'extraction, les mêmes réactifs dans les mêmes proportions et le même mode opératoire que celui décrit ci-après, à l'exclusion du point 6.2.2. Si la valeur de l'essai à blanc dépasse 0,5 mg, il conviendra de vérifier les réactifs et le ou les réactifs impurs devront être purifiés ou remplacés. 6.2. Dosage 6.2.1. Sécher le flacon (point 5.3) [éventuellement après y avoir déposé des matériaux (point 5.5) facilitant une ébullition modérée au cours de l'évaporation des solvants] dans l'étuve (point 5.4) pendant une demi-heure à 1 heure. Laisser refroidir le flacon jusqu'à la température de la salle des balances et peser le flacon une fois refroidi à 0,1 mg près. 6.2.2. Dans l'appareil d'extraction (point 5.2) peser à 1 mg près, soit directement, soit par différence, environ 1 g de lait entier en poudre ou environ 1,5 g de lait partiellement écrémé en poudre ou de lait écrémé en poudre. Ajouter 10 ml d'eau et agiter jusqu'à la dispersion totale de la poudre de lait (il peut être nécessaire de chauffer pour certains échantillons.). 6.2.3. Ajouter 1,5 ml de solution d'ammoniaque (25 %) (point 4.1) ou un volume correspondant d'une solution plus concentrée et chauffer au bain d'eau (point 5.6) pendant 15 minutes de 60 à 70 ºC, en agitant de temps en temps. Refroidir ensuite, par exemple à l'eau courante. 6.2.4. Ajouter 10 ml d'éthanol (point 4.2) et mélanger les liquides doucement mais complètement dans l'appareil maintenu ouvert. 6.2.5. Ajouter 25 ml d'oxyde diéthylique (point 4.3). Refroidir au besoin sous l'eau courante. Fermer l'appareil, l'agiter énergiquement à plusieurs reprises pendant 1 minute. 6.2.6. Enlever le bouchon avec précaution et ajouter 25 ml d'éther de pétrole (point 4.4) en utilisant les premiers millilitres pour rincer le bouchon et l'intérieur du col de l'appareil et en laissant les liquides de rinçage couler dans l'appareil. Remettre le bouchon en place, agiter et renverser l'appareil à plusieurs reprises 30 secondes. Si l'on ne prévoit pas de centrifugation lors de l'opération décrite au point 6.2.7, ne pas agiter trop énergiquement. 6.2.7. Laisser l'appareil au repos jusqu'à ce que la couche liquide supérieure devienne limpide et se sépare nettement de la phase aqueuse. On peut également effectuer la séparation à l'aide d'une centrifugeuse appropriée (point 5.8). Remarque Si l'on utilise une centrifugeuse dont le moteur n'est pas triphasé, des étincelles peuvent se produire et il faut donc veiller à éviter une explosion ou un incendie par suite de la présence de vapeurs d'éther (en cas de rupture d'un tube, par exemple). 6.2.8. Enlever le bouchon et le rincer ainsi que l'intérieur du col de l'appareil avec quelques millilitres de mélange de solvants (points 4.5) ; laisser les liquides de rinçage couler dans l'appareil. Transvaser avec soin aussi complètement que possible la couche supérieure dans le flacon (point 6.2.1) par décantation ou à l'aide d'un siphon (point 5.7). Remarque Si le transvasement n'est pas fait à l'aide d'un siphon, il pourra être nécessaire d'ajouter un peu d'eau pour rehausser l'interface des deux couches afin de faciliter la décantation. 6.2.9. Rincer l'extérieur et l'intérieur du col de l'appareil ou la pointe et la partie inférieure du siphon avec quelques millilitres du mélange de solvants. Laisser les liquides de rinçage de l'extérieur de l'appareil couler dans le flacon et ceux de l'intérieur du col et du siphon dans l'appareil d'extraction. 6.2.10. Procéder à une deuxième extraction en répétant les opérations décrites aux points 6.2.5 à 6.2.9 inclus, mais en utilisant seulement 15 ml d'oxyde diéthylique et 15 ml d'éther de pétrole. 6.2.11. Effectuer une troisième extraction en procédant comme indiqué au point 6.2.10 mais en omettant le rinçage final (point 6.2.9). Remarque S'il s'agit de poudre de lait écrémé, la troisième extraction n'est pas nécessaire. 6.2.12. Éliminer avec soin, par évaporation ou distillation, le maximum de solvant (y compris l'éthanol). Si le flacon est de petite capacité, il faudra éliminer un peu de solvant de la manière précitée après chaque extraction. 6.2.13. Quand il ne subsiste plus aucune odeur de solvant, chauffer le flacon, couché, pendant 1 heure dans l'étuve. 6.2.14. Retirer le flacon de l'étuve et le laisser refroidir jusqu'à la température de la salle des balances comme indiqué plus haut (point 6.2.1) et peser à 0,1 mg près. 6.2.15. Répéter les opérations des points 6.2.13 et 6.2.14, en chauffant par période de 30 à 60 minutes jusqu'à ce que la différence en masse de deux pesées successives soit inférieure à 0,5 mg ou jusqu'à ce que la masse augmente. S'il y a augmentation de masse, utiliser dans le calcul (point 7.1) la masse la plus faible. M1 est la masse obtenue en g. 6.2.16. Ajouter 15 à 25 ml d'éther de pétrole pour vérifier que la matière extraite est entièrement soluble. Chauffer légèrement et agiter le solvant par un mouvement circulaire jusqu'à ce que toute la matière grasse soit en solution. 6.2.16.1. Si la matière extraite est entièrement soluble dans l'éther de pétrole, la masse de la matière grasse est la différence entre la pesée du point 6.2.1 et la pesée du point 6.2.15. 6.2.16.2. Si de la matière insoluble est présente et toujours en cas de doute extraire complètement la matière grasse contenue dans le flacon par des lavages répétés à l'éther de pétrole chaud, en laissant se déposer la matière non dissoute avant chaque décantation. Rincer à trois reprises l'extérieur du col du flacon. Chauffer le flacon, couché, pendant 1 h à l'étuve et le laisser refroidir jusqu'à la température de la salle des balances comme indiqué plus haut (point 6.2.1) et peser à 0,1 mg près. La masse de la matière grasse est la différence entre la pesée du point 6.2.15 et la pesée finale. 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul La masse, exprimée en grammes, de la matière grasse extraite est donnée par la formule: (M1 - M2) - (B1 - B2) et la teneur en matière grasse de l'échantillon, exprimée en pourcentage, par la formule: >PIC FILE= "T0015638"> où: M1 = masse, en grammes du flacon M, avec la matière grasse après l'opération du point 6.2.15, M2 = masse, en grammes, du flacon M, après l'opération du point 6.2.1 ou, dans le cas où des matières insolubles sont présentes ou en cas de doute, après l'opération du point 6.2.16.2, B1 = masse, en grammes, du flacon B de l'essai à blanc après l'opération du point 6.2.15, B2 = masse, en grammes, du flacon B après l'opération du point 6.2.1. ou, dans le cas où des matières insolubles sont présentes ou en cas de doute, après l'opération du point 6.2.16.2, S = masse, en grammes, de la prise d'essai utilisée. 7.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon, dans les mêmes conditions, ne doit pas excéder 0,2 g de matière grasse pour 100 g de produit à l'exception du lait écrémé en poudre pour lequel la différence ne doit pas excéder 0,1 g de matière grasse pour 100 g de produit. MÉTHODE 5 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN SACCHAROSE (MÉTHODE POLARIMÉTRIQUE) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer la teneur en saccharose des laits énumérés ci-après: - lait concentré sucré ou lait entier concentré sucré, - lait partiellement écrémé concentré sucré, - lait écrémé concentré sucré. Les échantillons ne doivent pas contenir de sucre interverti. 2. DÉFINITION La teneur en saccharose des laits concentrés sucrés est la teneur en saccharose déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La méthode est basée sur le principe de l'inversion de Clerget : un traitement doux par un acide hydrolyse complètement le saccharose. Le lactose et les autres sucres ne sont pratiquement pas hydrolysés. La teneur en saccharose est déduite du changement du pouvoir rotatoire de la solution. Un filtrat limpide de l'échantillon, sans mutarotation due au lactose, est préparé par traitement de la solution par l'ammoniaque, neutralisation et clarification par additions successives de solutions d'acétate de zinc et de hexaferrocyanure de potassium. Sur une partie du filtrat, le saccharose est hydrolysé dans des conditions précises. En partant des pouvoirs rotatoires du filtrat avant et après inversion, on calcule la teneur en saccharose à l'aide de formules. 4. RÉACTIFS 4.1. Solution d'acétate de zinc, M : dissoudre 21,9 g d'acétate de zinc cristallisé Zn (C2H3O2)2 72H2O et 3 ml d'acide acétique glacial dans de l'eau et compléter à 100 ml. 4.2. Solution de hexaferrocyanure (II) de potassium, 0,25 M : dissoudre 10,6 g de hexaferrocyanure (II) de potassium K4 [Fe(CN)6] 73H2O dans de l'eau et compléter à 100 ml. 4.3. Solution d'acide chlorhydrique 6,35 ± 0,20 M (20 à 22 %) ou 5,0 ± 0,2 M (16 à 18 %). 4.4. Solution diluée d'ammoniaque 2,0 ± 0,2 M (3,5 %). 4.5. Solution diluée d'acide acétique 2,0 ± 0,2 M (12 %). 4.6. Indicateur bleu de bromothymol, solution à 1 % (m/v) dans l'éthanol. 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique, sensibilité 10 mg. 5.2. Tube de polarimètre de 2 dm de longueur, calibré exactement. 5.3. Polarimètre ou saccharimètre: a) Polarimètre à lumière de sodium ou à lumière verte de mercure (lampe à vapeur de mercure avec prisme ou écran Wratten spécial nº 77 A), permettant une lecture d'une précision au moins égale à 0,05 degré d'angle. b) Saccharimètre à échelle internationale, utilisant de la lumière blanche passant au travers d'un filtre de 15 mm de solution à 6 % de bichromate de potassium ou bien de la lumière de sodium et permettant une lecture d'une précision au moins égale à 0,1 degré de l'échelle saccharimétrique internationale. 5.4. Bain d'eau réglé à 60 ± 1 ºC. 6. MODE OPÉRATOIRE 6.1. Contrôle de la méthode Dans le but de normaliser la méthode, les réactifs et les appareils, on procédera à un contrôle de la méthode comme décrite ci-après par double analyse d'un mélange de 100 g de lait et 18 g de saccharose pur ou de 110 g de lait écrémé et de 18 g de saccharose pur correspondant à 40 g de lait concentré contenant 45 % de saccharose. Calculer la teneur en saccharose à l'aide des formules indiquées au point 7 en utilisant la formule 1, pour M, F et P, la quantité de lait pesée et les teneurs en matière grasse et en protéines de ce lait et, dans la formule 2, pour M, le chiffre de 40 g. La moyenne des valeurs trouvées ne doit pas différer de cette valeur (45 %) de plus de 0,2 %. 6.2. Dosage 6.2.1. Dans un bécher de 100 ml en verre, peser exactement à 10 mg près, 40 g environ de l'échantillon convenablement mélangé. Ajouter 50 ml d'eau chaude (80 à 90 ºC) et mélanger soigneusement. 6.2.2. Transvaser quantitativement le mélange dans un ballon jaugé de 200 ml, rincer le bécher avec des quantités successives d'eau à 60 ºC, jusqu'à ce que le volume total soit de 120 à 150 ml. Mélanger et refroidir à température ambiante. 6.2.3. Ajouter 5 ml de la solution d'ammoniaque diluée (point 4.4). Mélanger de nouveau et laisser reposer pendant 15 minutes. 6.2.4. Neutraliser l'ammoniaque en ajoutant une quantité équivalente de la solution diluée d'acide acétique (point 4.5). Déterminer au préalable la quantité exacte de ml par titrage de la solution d'ammoniaque diluée en employant le bleu de bromothymol comme indicateur (point 4.6). Mélanger. 6.2.5. Ajouter, en mélangeant doucement par rotation du ballon incliné, 12,5 ml de solution d'acétate de zinc (point 4.1). 6.2.6. De la même manière que pour la solution d'acétate, ajouter 12,5 ml de solution de hexaferrocyanure (II) de potassium (point 4.2). 6.2.7. Porter le contenu du ballon à 20 ºC et ajouter de l'eau (à 20 ºC) jusqu'au trait de jauge de 200 ml. Remarque Jusqu'à ce stade, toutes additions d'eau ou de réactifs seront effectuées de manière à éviter la formation de bulles d'air et, pour cette même raison, tous les mélanges seront effectués par rotation du ballon plutôt que par agitation violente. Si on constate la présence de bulles d'air avant la mise au trait (200 ml), on peut les éliminer en reliant le ballon à une pompe à vide et en lui imprimant un mouvement de rotation. 6.2.8. Boucher le ballon avec un bouchon sec et mélanger intimement en secouant énergiquement. 6.2.9. Laisser reposer pendant quelques minutes, filtrer ensuite sur papier filtre sec. Jeter les 25 premiers ml du filtrat. 6.2.10. Polarisation directe : déterminer la rotation optique du filtrat à 20 ± 1 ºC. 6.2.11. Inversion : pipetter, dans un ballon jaugé de 50 ml, 40 ml du filtrat obtenu de la façon indiquée ci-avant. Ajouter 6,0 ml d'acide chlorhydrique 6,35 M ou 7,6 ml d'acide chlorhydrique 5,00 M (point 4.3). Placer le ballon dans un bain d'eau à 60 ºC pendant 15 minutes, le ballon étant immergé jusqu'à la naissance du col. Mélanger par rotation pendant les 5 premières minutes au cours desquelles le contenu devra avoir atteint la température du bain. Refroidir à 20 ºC et porter au volume avec de l'eau à 20 ºC ; mélanger et laisser reposer une heure à cette température. 6.2.12. Polarisation après inversion Déterminer le pouvoir rotatoire de la solution intervertie à 20 ± 0,2 ºC (lorsque la température T du liquide dans le tube de polarisation diffère du plus de 0,2 ºC pendant la mesure, la correction de température indiquée au point 7.2 doit être appliquée). 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul Calculer la teneur en saccharose à l'aide des formules suivantes: >PIC FILE= "T0015639"> S = teneur en saccharose, M = masse de l'échantillon pesé exprimée en g, F = pourcentage de matière grasse de l'échantillon, P = pourcentage de protéines (N × 6,38) de l'échantillon, V = volume en ml auquel l'échantillon est dilué avant filtration, v = correction exprimée en ml pour le volume du précipité formé pendant la clarification, D = lecture polarimétrique directe (polarisation avant inversion), I = lecture polarimétrique après inversion, L = longueur en dm du tube du polarimètre, Q = facteur d'inversion dont les valeurs sont indiquées ci-après. Remarques a) En pesant exactement 40 g de lait concentré et en utilisant un polarimètre à lumière de sodium, à échelle en degrés d'angle et un tube de polarimètre de 2 dm de longueur à 20,0 ± 0,1 ºC, la teneur en saccharose des laits concentrés normaux (C = 9) peut être calculée à l'aide de la formule suivante: S = (D - 1,25I)(2,833 - 0,00612F - 0,00878P) b) Si la mesure de la polarisation après inversion est effectuée à une température autre que 20 ºC, les chiffres obtenus devront être multipliés par: [1 + 0,0037(T - 20)] 7.2. Valeurs du facteur d'inversion Q Les formules suivantes donnent des valeurs précises de Q pour diverses sources de lumière avec des corrections, le cas échéant, pour la concentration et la température: Lumière du sodium et polarimètre à échelle en degrés d'angle : Q = 0,8825 + 0,0006(C - 9) - 0,0033(T - 20). Lumière verte du mercure et polarimètre à échelle en degrés d'angle : Q = 1,0392 + 0,0007(C - 9) - 0,0039(T - 20). Lumière blanche avec écran au bichromate et saccharimètre avec échelle saccharimétrique internationale : Q = 2,549 + 0,0017(C - 9) - 0,0095(T - 20). Dans les formules précédentes: C = pourcentage des sucres totaux dans la solution intervertie, d'après la lecture polarimétrique. T = température de la solution intervertie lors de la lecture au polarimètre. Remarque 1 Le pourcentage des sucres totaux C dans la solution intervertie peut être calculé à partir de la lecture directe et de la variation après inversion selon la méthode habituelle, en utilisant les valeurs usuelles de rotation spécifique du saccharose, du lactose et du sucre interverti. La correction 0,0006(C - 9) etc. n'est exacte que lorsque C est égal à environ 9 ; pour du lait concentré normal cette correction peut être négligée, C étant alors voisin de 9. Remarque 2 Les écarts de température de 1 ºC par rapport à 20 ºC n'influencent que faiblement la lecture directe. Par contre, des écarts de plus de 0,2 ºC lors de la lecture après inversion nécessitent une correction. La correction - 0,0033(T - 20), etc. n'est exacte que pour des températures comprises entre 18 et 22 ºC. 7.3. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions ne doit pas excéder 0,3 g de saccharose pour 100 g de lait concentré. MÉTHODE 6 : DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE LACTIQUE ET EN LACTATES 1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet d'obtenir la teneur en acide lactique et en lactates des laits énumérés ci-après: - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse, - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier, - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé, - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé. 2. DÉFINITION Teneur en acide lactique et en lactates des laits en poudre : la teneur en acide lactique et en lactates déterminée par la méthode spécifiée. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La matière grasse, les protéines et le lactose sont éliminés simultanément d'une solution d'échantillon par addition de sulfate de cuivre et d'hydroxide de calcium, puis par filtration. L'acide lactique et les lactates du filtrat sont transformés en acétaldéhyde par l'acide sulfurique concentré en présence de sulfate de cuivre (II). La teneur en acide lactique est déterminée par colorimétrie en utilisant du p-hydroxydiphényle. La teneur en acide lactique et en lactates est exprimée en mg d'acide lactique par 100 g de matières solides non lipidiques. 4. RÉACTIFS 4.1. Solution de sulfate de cuivre (II) : dissoudre 250 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4 75H2O) dans de l'eau et diluer à 1 000 ml. 4.2. Suspension d'hydroxyde de calcium. 4.2.1. Broyer 300 g d'hydroxyde de calcium [Ca(OH)2] dans un mortier avec de l'eau, en utilisant au total 900 ml. La suspension devrait être fraîchement préparée avant d'être utilisée. 4.2.2. Broyer 300 g d'hydroxyde de calcium [Ca(OH)2] dans un mortier avec de l'eau, en utilisant au total 1 400 ml. La suspension devrait être fraîchement préparée avant d'être utilisée. 4.3. Solution d'acide sulfurique - sulfate de cuivre (II) : ajouter à 300 ml d'acide sulfurique 95,5 = 97,0 % (m/m) de H2SO4, 0,5 ml de la solution de sulfate de cuivre (II) (point 4.1). 4.4. Solution de p-hydroxydiphényle (C6H5C6H4OH) : dissoudre en agitant et en chauffant légèrement 0,75 g de p-hydroxydiphényle dans 5 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium renfermant 5 g de NaOH par 100 ml. Diluer jusqu'à 50 ml avec de l'eau dans une fiole jaugée. Conserver la solution dans un flacon en verre brun, à l'abri de la lumière et au frais. Ne pas utiliser la solution si la couleur change ou s'il se produit un trouble. La durée de conservation maximale est de 72 heures. 4.5. Solution étalon d'acide lactique : dissoudre peu avant l'emploi 0,1067 g de lactate de lithium (CH3CHOHCOOLi) dans de l'eau et diluer à 1 000 ml dans une fiole jaugée. Un ml de cette solution correspond à 0,1 mg d'acide lactique. 4.6. Lait reconstitué étalon : analyser au préalable plusieurs échantillons de lait en poudre de haute qualité. Pour la préparation de la courbe de calibrage, prendre l'échantillon dont la teneur en acide lactique est la plus faible, pas plus de 30 mg d'acide lactique par 100 g de matières solides non lipidiques. Suivre le mode opératoire décrit au point 6.2.1 et en 6.2.2 ci-après. 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Spectrophotomètre permettant la lecture à une longueur d'onde de 570 nm. 5.3. Bain d'eau à 30 ± 2 ºC. 5.4. Mortier et pilon. 5.5. Papier filtre (Schleicher et Schull 595, Whatman 1 ou similaire). 5.6. Tubes à essai pyrex ou similaires (dimensions 25 × 150 mm). Note Toute la verrerie doit être parfaitement propre et utilisée pour cette seule détermination. Avant lavage, rincer la verrerie contenant le précipité avec de l'acide chlorhydrique concentré. 6. MODE OPÉRATOIRE 6.1. Essai à blanc Effectuer un essai à blanc en versant 30 ml d'eau dans un tube gradué de 50 ml et en traitant ce flacon comme il est décrit aux points 6.2.4 à 6.2.11 inclus. Si les résultats de l'essai à blanc par rapport à l'eau dépassent l'équivalent de 20 mg d'acide lactique par 100 g de matières solides non lipidiques, les réactifs doivent être contrôlés et le (ou les) réactif(s) impur(s) doit(vent) être remplacé(s). Traiter l'essai à blanc simultanément avec les échantillons. 6.2. Dosage Note : Éviter la contamination par des impuretés, notamment par la salive et la transpiration. 6.2.1. Déterminer la teneur en matières solides non lipidiques (a) de l'échantillon en déduisant de 100 la teneur en matière grasse (selon la méthode 4) et la teneur en humidité (selon la méthode 2). >PIC FILE= "T0015640"> 6.2.3. Pipetter 5 ml de la solution obtenue dans un tube gradué de 50 ml et diluer avec de l'eau jusqu'à 30 ml. 6.2.4. Ajouter lentement et en agitant, 5 ml de la solution de sulfate de cuivre (point 4.1) et laisser reposer 10 minutes. 6.2.5. Ajouter lentement et en agitant 5 ml de la suspension d'hydroxyde de calcium (point 4.2.1) ou 10 ml de la suspension d'hydroxyde (point 4.2.2). 6.2.6. Diluer à 50 ml avec de l'eau, agiter vigoureusement, laisser reposer 10 minutes et filtrer. Rejeter les premières gouttes du filtrat. 6.2.7. Pipetter 1 ml du filtrat dans un tube à essai (point 5.6). 6.2.8. Ajouter au contenu du tube, au moyen d'une burette ou d'une pipette graduée, 6 ml de la solution d'acide sulfurique et de sulfate de cuivre (point 4.3). Mélanger. 6.2.9. Chauffer dans le bain d'eau bouillante pendant 5 minutes. Refroidir à la température ambiante sous eau courante. 6.2.10. Ajouter 2 gouttes de réactif au p-hydroxydiphényle (point 4.4) et agiter vigoureusement pour répartir uniformément le réactif dans tout le liquide. Plonger le tube dans le bain d'eau à 30 ± 2 ºC et l'y maintenir pendant 15 minutes ; agiter de temps en temps. 6.2.11. Plonger le tube dans le bain d'eau bouillante pendant 90 secondes. Refroidir à la température ambiante sous eau courante. 6.2.12. Mesurer la densité optique par rapport à l'essai à blanc (point 6.1) dans les trois heures, à la longueur d'onde indiquée au point 5.2. 6.2.13. Si la densité dépasse celle du plus haut point de la courbe d'étalonnage, répéter l'essai en utilisant une dilution convenable du filtrat obtenu au point 6.2.6. 6.3. Établissement de la courbe d'étalonnage 6.3.1. Pipetter 5 ml du lait reconstitué (point 4.6) dans cinq cylindres gradués de 50 ml. Pipetter dans ces tubes 0, 1, 2, 3 et 4 ml de la solution étalon (point 4.5), de façon à obtenir une gamme d'étalonnage correspondant à 0, 20, 40, 60 et 80 mg d'acide lactique ajouté par 100 g de matières solides non lipidiques de poudre de lait. 6.3.2. Diluer avec de l'eau jusqu'à environ 30 ml et traiter comme il est décrit aux points 6.2.4 à 6.2.11 inclus. 6.3.3. Mesurer les densités optiques des éléments de la gamme d'étalonnage (point 6.3.1) par rapport à l'essai à blanc (point 6.1) à la longueur d'onde indiquée au point 5.2. Porter ces densités optiques sur un diagramme en fonction des quantités d'acide lactique mentionnées au point 6.3.1, soit 0 mg, 20 mg, 40 mg, 60 mg, 80 mg, par 100 g de matières solides non lipidiques. Tracer la droite la plus satisfaisante passant par les points et préparer la courbe d'étalonnage en déplaçant cette ligne parallèlement à elle-même de façon à la faire passer par l'origine. 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul Convertir la densité optique mesurée selon le point 6.2.12 ou 6.2.13 en mg d'acide lactique par 100 g de matières solides non lipidiques de l'échantillon en se référant à la courbe d'étalonnage. Multiplier ce résultat par le facteur de dilution au cas où le filtrat à été dilué selon le point 6.2.13. 7.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste et dans les mêmes conditions sur le même échantillon ne doit pas dépasser 8 mg d'acide lactique par 100 g de matières solides non lipidiques pour des teneurs atteignant 80 mg. Pour des valeurs plus élevées, cette différence ne doit dépasser 10 % de la valeur la plus basse. MÉTHODE 7 : DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ DE LA PHOSPHATASE (MÉTHODE DE SANDERS ET SAGER, MODIFIÉE) 1. DOMAINE D'APPLICATION Cette méthode permet de déterminer l'activité de la phosphatase dans les laits énumérés ci-après: - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse, - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier, - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé, - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé. 2. DÉFINITION L'activité de la phosphatase du lait en poudre est mesurée par la quantité de la phosphatase alcaline active présente. Elle est exprimé par la quantité de phénol libéré en ¶g par ml de lait reconstitué, déterminée par le procédé décrit ci-après. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'activité de la phosphatase du lait en poudre est déterminée par le pouvoir de la phosphatase de libérer le phénol du phénylphosphate disodique. La quantité de phénol libéré dans les conditions prescrites est déterminée par une mesure spectrophotométrique de la coloration développée grâce au réactif de Gibbs. 4. RÉACTIFS 4.1. Solution A Tampon de borate et d'hydroxyde de baryum : pH 10,6 ± 0,1 à 20 ºC. Dissoudre : 25,0 g d'hydroxyde de baryum [Ba(OH)2 78H2O] dans de l'eau et diluer jusqu'à 500 ml. Dissoudre : 11,0 g d'acide borique (H3BO3) dans de l'eau et diluer jusqu'à 500 ml. Chauffer les deux solutions à une température de 50 ºC et mélanger. Agiter et refroidir le mélange à la température ambiante. Ajuster le pH à 10,6 ± 0,1 avec la solution d'hydroxyde de baryum et filtrer. Conserver la solution dans un récipient bien bouché. Avant utilisation, diluer le tampon avec la même quantité d'eau. 4.2. Solution B Tampon pour le développement de la couleur. Dissoudre 6 g de métaborate de sodium (NaBO2) (ou 12,6 g de NaBO2 74H2O) et 20 g de chlorure de sodium (NaCl) dans de l'eau et diluer jusqu'à 1 000 ml. 4.3. Solution C Substrat tamponné. 4.3.1. Dissoudre 0,5 g de phénylphosphate disodique (Na2C6H5PO4 72H2O) dans 4,5 ml de solution B (point 4.2). Ajouter deux gouttes de solution E (point 4.5) et laisser reposer pendant 30 minutes. Extraire la couleur formée avec 2,5 ml d'alcool butylique (point 4.10). Si nécessaire répéter l'extraction de la couleur. Après séparation, jeter l'alcool butylique. Cette solution peut être conservée pendant quelques jours dans un réfrigérateur. Développer et extraire la couleur encore une fois avant l'emploi. 4.3.2. Pipetter 1 ml de cette solution dans un ballon jaugé de 100 ml et ajouter de la solution A jusqu'au repère. Préparer le substrat tamponné immédiatement avant l'emploi. 4.4. Solution D Précipitant. Dissoudre 3,0 g de sulfate de zinc (ZnSO4 77H2O) et 0,6 g de sulfate de cuivre II (CuSO4 75H2O) dans de l'eau et porter à 100 ml. 4.5. Solution E Réactif de Gibbs. Dissoudre 0,040 g de dibromo-2,6 quinone chloro-1,4 imide (O 7C6H2Br2 7NCl) dans 10 ml d'éthanol à 96 %. Conserver la solution dans un flacon en verre foncé dans un réfrigérateur. Jeter ce réactif quand il a changé de couleur. 4.6. Tampon de dilution de la coloration Diluer 10 ml de la solution tampon B pour le développement de la couleur (point 4.2) avec de l'eau et compléter à 100 ml. 4.7. Solution de sulfate de cuivre Dissoudre 0,05 g de sulfate de cuivre (II) (CuSO4 75H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml. 4.8. Solution étalon de phénol Dissoudre 0,200 ± 0,001 g de phénol pur dans de l'eau et porter à 100 ml dans un ballon jaugé. Cette solution peut être conservée pendant quelques mois dans un réfrigérateur. Diluer 10 ml de cette solution à 100 ml avec de l'eau. Cette solution diluée contient 200 ¶g de phénol par ml et peut être utilisée pour préparer des solutions plus diluées. 4.9. Eau distillée, bouillie. 4.10. Alcool n-butylique. 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Bain d'eau maintenu par thermostat à 37 ± 1 ºC. 5.3. Spectrophotomètre permettant la lecture à une longueur d'onde de 610 nm. 5.4. Papier filtre (Schleicher et Schull 597, Whatman 42 ou similaires). 5.5. Bain d'eau bouillante. 5.6. Feuille d'aluminium. 6. MODE OPÉRATOIRE Précautions à prendre 1. Éviter l'exposition directe à la lumière solaire. 2. Nettoyer parfaitement toute la verrerie, les bouchons et matériels de transvasement. Il est recommandé de les rincer et de les faire bouillir à l'eau ou de les traiter à la vapeur. 3. Éviter l'emploi de matières plastiques (bouchons par exemple) qui pourraient contenir du phénol. 4. La salive contenant de la phosphatase, éviter soigneusement toute trace de salive. 6.1. Préparation de l'échantillon 6.1.1. Dissoudre 10 g de l'échantillon, pesés à 0,1 g près, dans 90 ml d'eau. La température de dissolution de la poudre ne doit jamais dépasser 35 ºC. 6.2. Détermination 6.2.1. Introduire dans chacun des deux tubes à essai 1 ml de lait reconstitué préparé comme indiqué au point 6.1.1. 6.2.2. Chauffer l'un des tubes dans de l'eau bouillante pendant 2 minutes. Couvrir le tube et le bain d'eau (point 5.5) ou, par exemple, un bécher, avec une feuille d'aluminium (point 5.6), pour que le tube soit chauffé en entier. Refroidir dans de l'eau froide à température ambiante. Ce tube servira pour l'essai à blanc. À partir de ce point, traiter les deux tubes de façon identique. 6.2.3. Ajouter 10 ml de la solution C (point 4.3.2). Mélanger et placer les tubes dans le bain d'eau à 37 ºC (point 5.2). 6.2.4. Incuber pendant 60 minutes dans le bain d'eau en agitant de temps en temps. 6.2.5. Porter aussitôt les tubes au bain d'eau bouillant et chauffer pendant 2 minutes, refroidir à la température ambiante, dans de l'eau froide. 6.2.6. Ajouter 1 ml de la solution D (point 4.4), mélanger et filtrer sur un papier filtre sec ; jeter les premiers filtrats jusqu'à obtention d'un liquide limpide. 6.2.7. Introduire 5 ml de chaque filtrat dans des tubes à essai, ajouter 5 ml de solution B (point 4.2) et 0,1 ml de solution E (point 4.5). Mélanger. 6.2.8. Laisser la couleur se préciser à température ambiante et à l'abri de la lumière solaire pendant 30 minutes. 6.2.9. Mesurer la densité optique de la solution de l'échantillon par rapport à l'essai à blanc à la longueur d'onde indiquée au point 5.3. 6.2.10. Répéter la détermination si la densité optique de la solution dépasse celle de l'étalon à 20 ¶g de phénol préparé suivant le point 7. Si cette limite est dépassée, diluer un volume convenable du lait reconstitué, d'après le point 6.1.1, avec un volume approprié de ce lait soigneusement bouilli, comme indiqué au point 6.2.2, pour inactiver la phosphatase présente. 7. PRÉPARATION DE LA COURBE ÉTALON 7.1. Pipetter dans quatre ballons de 100 ml, 1, 3, 5 et 10 ml de la solution étalon diluée d'après le point 4.8 et compléter jusqu'au repère avec de l'eau ; ces dilutions contiennent respectivement 2, 6, 10 et 20 ¶g de phénol par ml. 7.2. Pipetter 1 ml de chaque solution témoin (point 7.1) dans des tubes à essai afin d'obtenir une série d'échantillons contenant 0 (valeur zéro) 2, 6, 10 et 20 ¶g de phénol. Le blanc est obtenu par pipetage de 1 ml d'eau. 7.3. Pipetter successivement dans chaque tube à essai 1 ml de la solution de sulfate de cuivre (point 4.7), 5 ml de solution tampon colorée (point 4.6), 3 ml d'eau et 0,1 ml de la solution E (point 4.5) ; mélanger. 7.4. Laisser reposer les tubes à essai à température ambiante et à l'abri de la lumière solaire directe pendant 30 minutes. 7.5. Mesurer la densité optique du contenu des tubes par rapport à la valeur zéro, à la longueur d'onde indiquée au point 5.3. 7.6. Établir la courbe étalon en relevant les valeurs des densités optiques en fonction des quantités de phénol en ¶g telles qu'elles sont indiquées au point 7.2. 8. EXPRESSION DES RÉSULTATS 8.1. Mode de calcul 8.1.1. Convertir le chiffre obtenu au point 6.2.9 en ¶g de phénol, en se référant à la courbe étalon. 8.1.2. Calculer l'activité de la phosphatase exprimée en ¶g de phénol par ml de lait reconstitué selon la formule suivante: activité de la phosphatase = 2,4 × P où P = quantité de phénol en ¶g d'après le point 8.1.1. 8.1.3. S'il a été nécessaire de diluer comme indiqué au point 6.2.10, multiplier le résultat obtenu au point 8.1.2 par le facteur de dilution. 8.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions ne doit pas excéder 2 ¶g de phénol libéré par ml de lait reconstitué. MÉTHODE 8 : DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ DE LA PHOSPHATASE (MÉTHODE ASCHAFFENBURG ET MULLEN) 1. DOMAINE D'APPLICATION La présente méthode permet de déterminer l'activité de la phosphatase dans les laits énumérés ci-après: - lait en poudre riche en matière grasse ou poudre de lait riche en matière grasse, - lait en poudre, lait entier en poudre, poudre de lait ou poudre de lait entier, - lait partiellement écrémé en poudre ou poudre de lait partiellement écrémé, - lait écrémé en poudre ou poudre de lait écrémé. 2. DÉFINITION L'activité de la phophatase du lait déshydraté est mesurée par la quantité de phosphatase alcaline active présente dans le produit. Elle est exprimée en quantité de p-nitrophénol libéré en ¶g par ml de lait reconstitué, déterminée par le procédé décrit ci-après. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'échantillon de lait reconstitué est dilué dans un substrat tamponné (pH 10,2) et incubé pendant 2 heures à une température de 37 ºC. Toute quantité de phosphatase alcaline présente dans l'échantillon libérera, dans ces conditions, du p-nitrophénol provenant du p-nitrophénylphosphate disodique. Le p-nitrophénol libéré est mesuré par comparaison directe avec des verres de couleur étalons dans un colorimètre simple à lumière réfléchie. 4. RÉACTIFS 4.1. Tampon de carbonate de sodium et de bicarbonate de sodium. Dissoudre 3,5 g de carbonate de sodium anhydre et 1,5 g de bicarbonate de sodium dans de l'eau et diluer à 1 000 ml dans un ballon jaugé. 4.2. Substrat tamponné. Dissoudre 1,5 g de p-nitrophénylphosphate disodique dans la solution tampon de carbonate de sodium et de bicarbonate de sodium (point 4.1) et diluer à 1 000 ml dans un ballon jaugé. >PIC FILE= "T0015863"> 4.3. Précipitants. 4.3.1. Sulfate de zinc. Dissoudre 30,0 g de sulfate de zinc (ZnSO4) dans de l'eau et porter à 100 ml dans un ballon jaugé. 4.3.2. Hexacyanoferrate (II) de potassium en solution. Dissoudre 17,2 g de hexacyanoferrate (II) de potassium trihydraté (K4Fe(CN)6 73H2O) dans de l'eau et porter à 100 ml dans un ballon jaugé. 5. APPAREILLAGE 5.1. Balance analytique. 5.2. Bain d'eau à 37º ± 1 ºC, contrôlé par thermostat. 5.3. Comparateur colorimétrique, avec disque spécial contenant des verres de couleur étalons calibrés en ¶g de p-nitrophénol par ml de lait et deux cellules de 25 mm chacune. 6. MODE OPÉRATOIRE Précautions à observer 1. Après l'emploi, vider les tubes, les rincer à l'eau, les laver à l'eau chaude additionnée d'un détergent alcalin, rincer soigneusement ensuite à l'eau du robinet chaude et claire. Les rincer à l'eau, pour terminer ; sécher avant l'emploi. Les pipettes doivent être rincées à fond à l'eau du robinet claire et froide immédiatement après l'emploi ; les rincer à l'eau et les sécher avant l'emploi. 2. Les bouchons des tubes à essai doivent être rincés soigneusement à l'eau du robinet chaude immédiatement après emploi ; les faire bouillir ensuite dans l'eau pendant 2 minutes. >PIC FILE= "T0015864"> 4. Utiliser une pipette par échantillon et éviter la contamination par la salive. 5. Éviter à tout moment l'exposition directe à la lumière du soleil. 6.1. Préparation de l'échantillon Dissoudre 10 g de poudre dans 90 ml d'eau. La température de dissolution de la poudre ne doit pas dépasser 35 ºC. 6.2. Détermination 6.2.1. Pipetter 15 ml du substrat tamponné (point 4.2) dans un tube à essai propre et sec, puis 2 ml de l'échantillon de lait reconstitué (point 6.1) à tester. Fermer le tube à l'aide d'un bouchon, mélanger en renversant le tube et placer dans un bain d'eau à 37 ºC (point 5.2). 6.2.2. Placer simultanément dans le bain d'eau un tube de contrôle contenant 15 ml de substrat tamponné et 2 ml d'échantillon de lait reconstitué bouilli du même type que celui du test. 6.2.3. Enlever les deux tubes du bain d'eau au bout de 2 heures, ajouter 0,5 ml de précipitant au sulfate de zinc (point 4.3.1), remettre le bouchon, agiter vigoureusement et laisser reposer pendant 3 minutes. Ajouter 0,5 ml de précipitant à l'hexaferrocyanure (II) de potassium (point 4.3.2) ; mélanger intimement et filtrer sur papier plissé (point 5.4) ; recueillir le filtrat limpide dans le tube à essai propre. 6.2.4. Transvaser le filtrat dans une cellule de 25 mm et comparer par rapport au filtrat de l'échantillon de contrôle bouilli dans le colorimètre en utilisant le disque spécial (point 5.3). 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS 7.1. Mode de calcul La lecture directe obtenue suivant le point 6.2.4 est exprimée en ¶g de p-nitrophénol par ml d'échantillon ou par ml d'échantillon de lait reconstitué. 7.2. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou rapidement l'une après l'autre par le même analyste sur le même échantillon et dans les mêmes conditions ne doit pas excéder 2 ¶g de p-nitrophénol libéré par ml de lait reconstitué. Fin du document Document livré le: 11/03/1999

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