Législation communautaire en vigueur Document 392L0069 Chapitres du répertoire où le document peut être trouvé: [ 13.30.18 - Substances dangereuses ] Actes modifiés: 384L0449 (Modification) 367L0548 (Voir) 392L0069 Directive 92/69/CEE de la Commission, du 31 juillet 1992, portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses Journal officiel n° L 383 du 29/12/1992 p. 0113 - 0235 Edition spéciale finnoise ...: Chapitre 6 Tome 6 p. 3 Edition spéciale suédoise ...: Chapitre 6 Tome 6 p. 3 L 383A 29/12/1992 P. 0001 - 0235 Texte: DIRECTIVE 92/69/CEE DE LA COMMISSION du 31 juillet 1992 portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu la directive 67/548/CEE du Conseil, du 27 juin 1967, concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses (1), modifiée en dernier lieu par la directive 92/32/CEE (2), et notamment ses articles 28 et 29, (1) JO n 196 du 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO n L 154 du 5. 6. 1992, p. 1. considérant que l'article 3 paragraphe 1 de la directive 67/548/CEE et l'article 3 de la directive 88/379/CEE du Conseil, du 7 juin 1988, concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives des États membres relatives à la classification, à l'emballage et à l'étiquetage des préparations dangereuses (3), modifiée en dernier lieu par la directive 90/492/CEE de la Commission (4), prévoient que la détermination des propriétés physicochimiques, de la toxicité et de l'écotoxicité des substances et préparations est pratiquée selon les méthodes prévues à l'annexe V de la directive 67/548/CEE; (3) JO n L 187 du 16. 7. 1988, p. 14 (4) JO n L 275 du 5. 10. 1990, p. 35 considérant que le texte de l'annexe V de la directive 67/548/CEE est actuellement publié en deux parties, qui sont respectivement l'annexe de la directive 84/449/CEE de la Commission (5) et l'annexe de la directive 88/302/CEE de la Commission (6); (5) JO n L 251 du 19. 9. 1984, p. 1. (6) JO n L 133 du 30. 5. 1988, p. 1 et JO n L 136 du 2. 6. 1988, p. 20. considérant que, pour tenir compte du progrès technique, il est nécessaire de modifier les méthodes d'essai figurant à l'annexe de la directive 84/449/CEE de la Commission; considérant que, pour tenir compte du progrès technique, il est également nécessaire de modifier la méthode prévue pour l'essai d'inhibition de la croissance des algues figurant actuellement dans l'annexe de la directive 88/302/CEE de la Commission et, à cette occasion, de transférer cette méthode d'essai dans l'annexe de la directive 84/449/CEE; considérant qu'il convient de réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales, conformément à la directive 86/609/CEE du Conseil, du 24 novembre 1986, concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives des États membres relatives à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (7); (7) JO n L 358 du 18. 12. 1986, p. 1. considérant que les dispositions de la présente directive sont conformes à l'avis du comité pour l'adaptation au progrès technique des directives visant à l'élimination des entraves techniques aux échanges dans le secteur des substances et des préparations dangereuses, A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE: Article premier L'annexe de la directive 84/449/CEE est remplacée par l'annexe de la présente directive. Article 2 La méthode pour l'essai d'inhibition de croissance des algues visée à l'annexe de la directive 88/302/CEE est supprimée. Article 3 Les États membres mettent en vigueur les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive au plus tard le 30 octobre 1993. Ils en informent immédiatement la Commission. Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres. Article 4 Les États membres sont destinataires de la présente directive. Fait à Bruxelles, le 31 juillet 1992. Par la Commission Karel VAN MIERT Membre de la Commission Annexe de la directive 92/69/CEE de la Commission, du 31 juillet 1992, portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses (1) TABLES DES MATIÈRES INTRODUCTION PARTIE A: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DES PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES//5 A.1. Température de fusion/de congélation //5 A.2. Température d'ébullition //15 A.3. Densité relative //21 A.4. Pression de vapeur //26 A.5. Tension superficielle //47 A.6. Hydrosolubilité //54 A.8. Coefficient de partage //63 A.9. Point d'éclair //74 A.10. Inflammabilité (solides) //76 A.11. Inflammabilité (gaz) //79 A.12. Inflammabilité (au contact de l'eau) //81 A.13. Propriétés pyrophoriques des solides et des liquides //85 A.14. Danger d'explosion//87 A.15. Température d'inflammabilité spontanée (liquides et gaz)//98 A.16. Température relative d'inflammation spontanée pour les solides//99 A.17. Propriétés comburantes (solides) //102 PARTIE B: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE LA TOXICITÉ //107 Introduction générale //107 B.1. Toxicité aiguë (administration orale) //110 B.1 BIS Toxicité aiguë (administration orale) (méthode de la dose fixe)//113 B.2. Toxicité aiguë (administration par inhalation) //117 B.3. Toxicité aiguë (administration cutanée) //121 B.4. Toxicité aiguë (irritation de la peau) //124 B.5. Toxicité aiguë (irritation des yeux) //127 B.6. Sensibilisation cutanée //131 B.7. Toxicité à doses répétées (28 jours) (administration orale) //136 B.8. Toxicité à doses répétées (28 jours) (administration par inhalation) //140 B.9. Toxicité à doses répétées (28 jours) (administration cutanée) //144 B.10. Mutagénicité: Essai de cytogénétique in vitro sur le mammifère //148 B.11. Mutagénicité: Essai de cytogénétique in vivo sur la moelle osseuse de mammifère - Analyse chromosomique //151 B.12. Mutagénicité: Essai du micronoyau //154 B.13. Mutagénicité: Essai de mutation réverse sur Escherichia Coli //157 B.14. Mutagénicité: Essai de mutation réverse sur Salmonella thyphimurium //160 PARTIE C: MÉTHODE DE DÉTERMINATION DE L'ÉCOTOXICITÉ //163 C.1. Toxicité aiguë vis-à-vis des poissons //163 C.2. Toxicité aiguë vis-à-vis des daphnies //172 C.3. Essai d'inhibition des algues //179 C.4. Biodégradation: détermination de la biodégradabilité «rapide» //187 C.4-A: Disparition du carbone organique dissous (COD) //194 C.4-B: Test de screening OCDE modifié //197 C.4-C: Dégagement de gaz carbonique //202 C.4-D: Respirométrie manométrique //207 C.4-E: Essai en fioles fermées //211 C.4-F: MITI (Ministère de l'Industrie et du Commerce International - Japon) //216 Annexes//221 C.5. Dégradation: demande biochimique en oxygène //226 C.6. Dégradation: demande chimique en oxygène //227 C.7. Dégradation abiotique: hydrolyse en fonction du pH //229 INTRODUCTION La présente annexe expose les méthodes d'essai pour la détermination des propriétés physico-chimiques, toxicologiques et écotoxicologiques énumérées aux annexes VII et VIII de la directive 79/831/CEE. Ces méthodes ont été établies à partir de protocoles expérimentaux reconnus et recommandés par des organismes internationaux compétents [en particulier l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE)]. Lorsque de telles méthodes n'existaient pas, des normes nationales ou des méthodes bénéficiant d'un consensus scientifique ont été retenues. En règle générale, les essais doivent porter sur la substance tel que décrit dans la directive. L'influence que pourraient éventuellement avoir les impuretés sur les résultats des essais ne doit pas être négligée. Lorsque les méthodes de la présente annexe ne sont pas adaptées à l'examen d'une propriété donnée, le déclarant doit justifier la méthode de remplacement qu'il utilise. Les expérimentations et les études sur les animaux devront respecter les réglementations nationales et tenir compte des principes humanitaires ainsi que des développements internationaux dans le domaine de la protection des animaux. Parmi diverses méthodes d'essai équivalentes, il faut donner la préférence à celle qui emploie le moins d'animaux. PARTIE A: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DES PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES A.1. TEMPÉRATURE DE FUSION/DE CONGÉLATION 1. MÉTHODE La plupart des méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans les références (2) et (3). 1.1. INTRODUCTION Les méthodes et les appareils décrits ci-après permettent de déterminer la température de fusion des produits chimiques, quel que soit leur degré de pureté. La sélection de la méthode dépend de la nature de la substance à tester. Par conséquent, le facteur limitant dépend du fait que la substance peut être facilement ou difficilement pulvérisable ou peut ne pas l'être du tout. Pour certaines substances, il est préférable de déterminer la température de congélation ou de solidification. C'est pourquoi les normes de ces déterminations figurent également dans cette méthode. Lorsqu'il est difficile, du fait de certaines propriétés de la substance, de mesurer les paramètres cités ci-dessus, il peut être approprié de rechercher un point d'écoulement. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température de fusion est définie comme étant la température à laquelle se produit la transition de phase de l'état solide à l'état liquide, à la pression atmosphérique. Idéalement, cette température correspond à la température de congélation. Étant donné que la transition de phase de nombreuses substances a lieu dans un certain intervalle de température, celle-ci est souvent décrite comme un intervalle de fusion. Conversion des unités (K en C) t = T 273,15 t: température Celsius en degrés Celsius ( C) T: température thermodynamique en Kelvin (K) 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre les comparaisons avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes. Certaines substances d'étalonnage sont énumérées dans la référence (4). 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La température (intervalle de température) de la phase de transition de l'état solide, à l'état liquide, ou de l'état liquide à l'état solide, est déterminée. En pratique, les températures du début et de la fin de la fusion/congélation sont déterminées au cours du chauffage/refroidissement, à pression atmosphérique, de la substance à étudier. Cinq types de méthodes sont décrites: la méthode en tube capillaire, la méthode par bloc chauffant, la mesure de la température de congélation, les méthodes d'analyse thermique et la détermination du point d'écoulement (mise au point pour les huiles de pétroles).Dans certains cas, il peut être commode de mesurer la température de congélation au lieu de la température de fusion. 1.4.1. Méthode du tube capillaire 1.4.1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide Une petite quantité de substance finement broyée est placée dans un tube capillaire et tassée avec soin. Le tube est chauffé en même temps qu'un thermomètre dans le bain liquide et l'accroissement de température est ajusté à un peu moins d'1 K/mn pendant la fusion réelle. Les températures correspondant au début et à la fin de la fusion sont relevées. 1.4.1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique Le protocole est le même que celui décrit au paragraphe 1.4.1.1, si ce n'est que le tube capillaire et le thermomètre sont placés dans un bloc de métal chauffé et observés à travers des ouvertures aménagées dans ce dernier. 1.4.1.3. Détection photo-électrique L'échantillon contenu dans le tube capillaire est chauffé automatiquement dans un cylindre métallique. Par une ouverture aménagée dans celui-ci, un faisceau de lumière est envoyé à travers la substance à tester vers une cellule photo-électrique soigneusement étalonnée. Au moment de la fusion, les propriétés optiques de la plupart des substances sont modifiées en ce sens que l'opacité fait place à la transparence. De ce fait, l'intensité de la lumière qui atteint la cellule photo-électrique augmente et envoie un signal d'arrêt à l'indicateur digital qui affiche la température d'un thermomètre à résistance de platine placé dans l'enceinte chauffante. Cette méthode n'est pas applicable à certaines substances fortement colorées. 1.4.2. Méthodes avec bloc chauffant 1.4.2.1. Méthode au banc chauffant de Kofler Le banc chauffant de Kofler est composé de deux pièces de métal de conductivité thermique différente, qui sont chauffées électriquement. Il est construit de façon à ce que le gradient de température soit quasi linéaire sur toute sa longueur. La température de ce banc chauffant peut varier de 283 à 573 K grâce à un dispositif de lecture de la température comprenant un curseur avec un index et une réglette graduée, spécialement conçus pour le banc en question. Pour déterminer une température de fusion, une fine couche de substance est directement déposée sur la surface du banc. En quelques secondes, il se forme une ligne fine de séparation entre la phase fluide et la phase solide. La température à la hauteur de cette ligne est lue en plaçant l'index face à cette dernière. 1.4.2.2. Microscope à fusion Différents microscopes à platine chauffante sont utilisés pour déterminer des températures de fusion avec de très petites quantités de substance. La température est généralement mesurée à l'aide d'un thermocouple sensible, mais parfois aussi à l'aide d'un thermomètre à mercure. Le dispositif type de mesure de la température de fusion grâce à un microscope à platine chauffante comporte une enceinte chauffante qui contient une platine métallique sur laquelle est posée une lame de verre destinée à recevoir l'échantillon. Le centre de la platine métallique est percé d'un trou permettant le passage de la lumière provenant du miroir éclairant le microscope. Lors de l'utilisation, l'enceinte est fermée à l'aide d'une plaque de verre pour empêcher la circulation d'air dans la région où se trouve l'échantillon. Le chauffage de l'échantillon est réglé au moyen d'un rhéostat. Pour effectuer des mesures très précises sur des substances optiquement anisotropes, il est possible d'utiliser de la lumière polarisée. 1.4.2.3. Méthode du ménisque Cette méthode s'applique spécialement aux polyamides.La température à laquelle se déplace un ménisque d'huile de silicone, emprisonné entre une surface chauffée et une lamelle couvre-objet placée au-dessus de l'échantillon de polyamide à étudier, est déterminée visuellement. 1.4.3. Méthode de détermination de la température de congélation L'échantillon est introduit dans un tube à essai spécial et placé dans un appareil permettant la détermination de la température de congélation. L'échantillon est agité doucement durant tout le refroidissement et la température est relevée à intervalles déterminés. Dès que quelques relevés indiquent une température constante, cette dernière est considérée comme la température de congélation (après correction de l'erreur relative au thermomètre). Il convient d'éviter un refroidissement trop fort en maintenant un équilibre entre la phase liquide et la phase solide. 1.4.4. Analyse thermique 1.4.4.1. Analyse thermique différentielle (ATD) Cette méthode consiste à enregistrer la différence de température entre la substance et la substance de référence en fonction de la température pendant que la substance et la substance de référence sont soumises à un programme contrôlé de variation de température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, ce changement est indiqué par un mouvement endothermique (fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de l'enregistrement de la température. 1.4.4.2. Analyse calorimétrique différentielle (ACD) Cette technique consiste à soumettre une substance et un produit de référence à un même programme de variation contrôlée de la température et à enregistrer la différence d'énergie absorbée par la substance et par le produit de référence, en fonction de la température. Cette énergie correspond à l'énergie nécessaire pour annuler la différence de température entre la substance et le matériel de référence. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (fusion) ou exothermique (congélation) sur la ligne de base de l'enregistrement du flux de chaleur. 1.4.5. Point d'écoulement Cette méthode, mise au point pour les huiles de pétrole, s'applique aux substances huileuses dont la température de fusion est basse.Après un chauffage préliminaire, l'échantillon est refroidi à une vitesse spécifique et son écoulement est observé à des intervalles de 3 K. La température la plus basse à laquelle on observe un mouvement de la substance est considérée comme le point d'écoulement. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour déterminer la température de fusion/ intervalle de fusion sont énumérées dans le tableau suivant: TABLEAU: APPLICABILITÉ DES MÉTHODES >EMPLACEMENT TABLE> >EMPLACEMENT TABLE> >EMPLACEMENT TABLE> >EMPLACEMENT TABLE> 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les procédures de presque toutes les méthodes d'essai ont été décrites dans des normes internationales et nationales (voir annexe 1). 1.6.1. Méthodes en tube capillaire Lorsqu'elles sont soumises à une élévation lente de la température, les substances finement pulvérisées montrent habituellement les stades de fusion représentés à la figure 1. Figure 1 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Stade A (début de la fusion): de fines gouttes adhèrent uniformément à la paroi intérieure du tube capillaire. Stade B : un espace apparaît entre l'échantillon et la paroi intérieure, en raison de la rétraction du produit en fusion. Stade C : l'échantillon rétracté commence à s'affaisser et à se liquéfier. Stade D : un ménisque complet se forme à la surface, mais une partie importante de l'échantillon reste à l'état solide. Stade E : (fin de la fusion): il n'y a plus aucune particule solide. Durant la détermination de la température de fusion, il y a lieu de relever la température au début et à la fin de la fusion. 1.6.1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide La figure 2 décrit un type d'appareil de mesure de la température de fusion standardisé (JIS K 0064); l'appareil est en verre et toutes les spécifications sont exprimées en millimètres. Figure 2 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> A: Ballon de mesure B: Bouchon C: Tube d'aération D: Thermomètre E: Thermomètre auxiliaire F: Bain liquide G: Tube capillaire en verre (80 à 100 mm de longueur, 1 mm ± 0,2 mm de diamètre intérieur et 0,2 à 0,3 mm d'épaisseur de paroi) H: Tube latéral Bain liquide: Il convient de choisir un liquide approprié en fonction de la température de fusion à déterminer; on utilisera, par exemple de la paraffine liquide pour des températures de fusion ne dépassant pas 473 K et de l'huile de silicone pour les températures de fusion ne dépassant pas 573 K. Pour les températures de fusion dépassant 523 K, un mélange composé de trois parties d'acide sulfurique et de deux parties de sulfate de potassium (en rapport de masse) peut être utilisé. Il convient de prendre des précautions appropriées pour utiliser un mélange de ce type. Thermomètre: Seuls peuvent être utilisés les thermomètres qui répondent aux exigences des normes suivantes ou de leurs équivalents: ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001. Procédé: La substance sèche est finement broyée dans un mortier et introduite dans un tube capillaire scellé à une extrémité, la hauteur du remplissage étant fixée à environ 3 mm après tassement. Pour obtenir un échantillon uniformément tassé, il faut laisser tomber le tube capillaire d'une hauteur d'environ 700 mm à l'intérieur d'un tube de verre posé verticalement sur un verre de montre. Le tube capillaire rempli est placé dans le bain de telle sorte que la partie centrale du réservoir à mercure du thermomètre soit en contact avec la partie du tube capillaire où se trouve l'échantillon. En général, le tube capillaire est introduit dans l'appareil au moment où le bain est à environ 10 K en dessous de la température de fusion. Le chauffage du bain est réglé pour que l'accroissement de température soit d'environ 3 K par minute. Le liquide doit être agité. À environ 10 K en dessous de la température de fusion attendue, l'accroissement de température est réglé à un maximum de 1 K par minute. Calcul: Le calcul de la température de fusion s'effectue au moyen de la formule suivante: T = TD + 0,00016(TD TE)n où: T = température de fusion corrigée, exprimée en K TD = température lue sur le thermomètre D, exprimée en K TE = température lue sur le thermomètre E, exprimée en K n = nombre de graduations de la colonne de mercure sur la tige émergente du thermomètre D. 1.6.1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique Appareil: L'appareil comprend: - un bloc métallique cylindrique, dont la partie supérieure est creuse et forme une enceinte (voir figure 3), - un bouchon métallique, percé de deux ou plusieurs trous, permettant l'introduction des tubes dans le bloc métallique, - un système de chauffage du bloc métallique, qui peut être constitué d'une résistance électrique dans le bloc, - un rhéostat pour régler la puissance dans le cas d'un chauffage électrique, - quatre fenêtres en verre résistant à la chaleur, percées dans les parois latérales de l'enceinte, en position diamétralement opposée. Un oculaire permettant d'observer le tube capillaire est installé en face d'une de ces fenêtres. Les trois autres fenêtres permettent d'éclairer l'intérieur de l'enceinte à l'aide de lampes, - un tube capillaire, en verre résistant à la chaleur, scellé à une extrémité (voir point 1.6.1.1). Thermomètre: Voir normes mentionnées au point 1.6.1.1. Des instruments de mesure thermoélectriques de précision équivalente sont aussi utilisables. Figure 3 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> 1.6.1.3. Détection photo-électrique Appareil et procédé: L'appareil consiste en une enceinte métallique pourvue d'un système de chauffage automatisé. Trois tubes capillaires sont remplis comme prévu au point 1.6.1.1 et placés dans le four. Plusieurs programmes d'accroissement linéaire de la température permettant d'étalonner l'appareil. L'accroissement de température approprié est électriquement réglé à un taux constant et linéaire présélectionné. Des enregistreurs indiquent la température réelle du four et la température de la substance dans les tubes capillaires. 1.6.2 Méthode de la surface chauffée 1.6.2.1 Banc chauffant de Kofler Voir annexe. 1.6.2.2 Microscope à fusion Voir annexe. 1.6.2.3 Méthode du ménisque (polyamides) Voir annexe. Aux alentours de la température de fusion, l'accroissement de la température doit être inférieur à 1 K/mn. 1.6.3. Méthodes de détermination de la température de congélation. Voir annexe. 1.6.4. Analyses thermiques 1.6.4.1. Analyse thermique différentielle Voir annexe 1.6.4.2. Analyse calorimétrique différentielle Voir annexe. 1.6.5. Détermination du point d'écoulement Voir annexe. 2. DONNÉES La correction du thermomètre s'impose dans certains cas. 3. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - la méthode utilisée, - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire, - une estimation de la précision. La température de fusion indiquée dans le rapport est donnée par la moyenne de deux mesures au moins qui ne dépassent pas les limites de la précision estimée (voir tableau). Si la différence de température entre le début et la fin de la fusion se trouve dans les limites de précision de la méthode, la température relevée au stade final de la fusion est considérée comme la température de fusion; sinon les deux températures sont indiquées. Si la substance se décompose ou se sublime avant que la température de fusion soit atteinte, la température à laquelle cela se produit doit être mentionnée. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être mentionnées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 102, Décision du Conseil C(81) 30 Final. (2) UIPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834. (3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII. (4) UICPA, Mesures physico-chimiques: Catalogue de substances de référence pour les laboratoires nationaux, Chimie pure et appliquée., 1976, vol. 48, 505-515. Annexe Pour plus de détails, on peut consulter par exemple les normes suivantes. 1. Méthodes du tube capillaire 1.1. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bain liquide ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung der Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren. JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products. 1.2. Dispositif de mesure de la température de fusion comportant un bloc métallique DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point» 2. Méthodes du bloc chauffant 2.1. Banc chauffant de Kofler ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommanded practices for testing polymeric powder coatings 2.2. Microscope à fusion DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen. 2.3. Méthode du ménisque (polyamides) ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point» ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resine injection moulding and extrusion materials NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du «point de fusion». Méthode du ménisque. 3. Méthodes de détermination de la température de congélation BS 4633 Method for the determination of crystallizing point BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve) DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeage. DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation) ISO 1392 Method for the determination of the freezing point. 4. Analyse thermique 4.1. Analyse thermique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe 4.2. Analyse calorimétrique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe 5. Détermination du point d'écoulement NBN 52014 Échantillonnage et analyse des produits du pétrole : point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point. A.2. TEMPÉRATURE D'ÉBULLITION 1. MÉTHODES La plupart des méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans les références (2) et (3). 1.1. INTRODUCTION Les méthodes et dispositifs décrits ici peuvent être appliqués aux substances liquides et à température de fusion faible, à condition qu'elles ne subissent pas de réaction chimique en dessous de la température d'ébullition (par exemple auto-oxydation, réarrangement, dégradation, etc.). Les méthodes s'appliquent aux substances liquides pures et impures. L'importance donnée aux méthodes recourant à la détection photo-électrique et à l'analyse thermique est due au fait que ces méthodes permettent de déterminer non seulement la température de fusion mais également la température d'ébullition. De surcroît, les mesures peuvent être effectuées de manière automatique. La «méthode dynamique» a l'avantage de pouvoir être également utilisée pour la détermination de la pression de vapeur et il n'est pas nécessaire de ramener la température d'ébullition aux conditions normales de pression (101,325 kPa), puisque la pression normale peut être maintenue au cours de la mesure à l'aide d'un manostat. Observations: L'influence des impuretés sur la détermination de la température d'ébullition dépend beaucoup de la nature de l'impureté. Si l'échantillon contient des impuretés volatiles, susceptibles d'avoir une incidence sur les résultats, il convient de purifier la substance. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température d'ébullition normale est définie comme la température à laquelle la pression de vapeur d'un liquide s'élève à 101,325 kPa. Si la température d'ébullition n'est pas mesurée à la pression atmosphérique normale, la dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis de la température peut être décrite à l'aide de l'équation de Clausius-Clapeyron: log p = 2,3 RTD Hv + constante où: p = pression de vapeur de la substance exprimée en pascal Ä Hv= chaleur de vaporisation en J mol 1 R = constante molaire des gaz parfaits = 8,314 J mol 1 K 1 T = température thermodynamique exprimée en K La température d'ébullition est établie en tenant compte de la pression ambiante au moment de la mesure. Conversions Pression (unité: kPa) 100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa (l'utilisation du «bar» est toujours permise mais non recommandée); 133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr (l'utilisation des unités «mm Hg» et «Torr» n'est pas permise); 1 atm = atmosphère standard = 101,325 Pa (l'utilisation de l'unité «atm» n'est pas permise). Température (unité: K) t = T 273,15 t: température Celsius, exprimée en degré Celsius ( C) T: température thermodynamique, exprimée en kelvin (K) 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'utiliser des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Ces substances de référence doivent servir en premier lieu à vérifier la fiabilité de la méthode de temps à autre et à permettre la comparaison avec les résultats obtenus à l'aide d'autres méthodes. Certaines substances d'étalonnage figurent dans les méthodes énumérées dans l'annexe. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Cinq méthodes de détermination de la température d'ébullition (intervalle d'ébullition) sont basées sur la mesure de la température d'ébullition, deux autres sont basées sur une analyse thermique. 1.4.1. Méthode de l'ébulliomètre Bien que les ébulliomètres aient été à l'origine mis au point pour la détermination du poids moléculaire par élévation de la température d'ébullition, ils se prêtent également aux mesures exactes de la température d'ébullition. Un appareil très simple est décrit dans la norme ASTM D 1120-72 (voir annexe). Dans cet appareil, le liquide est chauffé jusqu'à ébullition à la pression atmosphérique (conditions d'équilibre). 1.4.2. Méthode dynamique Cette méthode comporte la mesure de la température de recondensation de la vapeur à l'aide d'un thermomètre approprié placé dans le reflux pendant l'ébullition. La pression peut être modifiée dans cette méthode. 1.4.3. Méthode par distillation à la température d'ébullition Cette méthode comporte la distillation du liquide, la mesure de la température de recondensation de la vapeur et la détermination de la quantité de distillat. 1.4.4. Méthode selon Siwoloboff Un échantillon est chauffé dans un tube à essai, qui est immergé dans le liquide contenu dans un bain chauffant. Un capillaire scellé, contenant une bulle d'air dans sa partie inférieure, est plongé dans le tube à essais. 1.4.5. Détection photo-électrique Suivant le principe de Siwoloboff, l'ascension des bulles permet une mesure photo-électrique automatique. 1.4.6. Analyse thermique différentielle Cette technique permet d'enregistrer la différence de température entre la substance et une substance de référence, en fonction de la température, pendant que la substance et la substance de référence sont soumises au même programme de variation contrôlée de la température. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (ébullition) sur la ligne de base de l'enregistrement de la température. 1.4.7. Analyse calorimétrique différentielle Cette technique permet d'enregistrer la différence entre l'énergie absorbée par une substance et par un produit de référence, en fonction de la température, alors qu'ils sont soumis au même programme de variation contrôlée de la température. Cette énergie correspond à l'énergie nécessaire pour annuler la différence de température entre la substance et le matériel de référence. Lorsque l'échantillon subit une transition impliquant un changement d'enthalpie, celui-ci est indiqué par un mouvement endothermique (ébullition) sur la ligne de base de l'enregistrement du flux de chaleur. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité et la précision des différentes méthodes utilisées pour déterminer la température d'ébullition/ intervalle d'ébullition sont indiquées dans le tableau 1. >EMPLACEMENT TABLE> 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les procédures de certaines méthodes d'essai ont été décrites dans des normes internationales et nationales (voir appendice). 1.6.1. Ébulliomètre Voir annexe. 1.6.2. Méthode dynamique Voir méthode d'essai A.4 pour la détermination de la pression de vapeur. La température d'ébullition est enregistrée à une pression de 101,325 kPa. 1.6.3. Méthode de distillation (intervalle d'ébullition) Voir annexe. 1.6.4. Méthode selon Siwoloboff L'échantillon est introduit dans un tube à essais ayant environ 5 mm de diamètre et chauffé dans un appareil servant à la détermination de la température de fusion (figure 1). La figure 1 donne un exemple d'appareil normalisé servant à déterminer la température de fusion et la température d'ébullition (JIS K 0064) (l'appareil est en verre et toutes les spécifications sont données en millimètres). Figure 1 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> A: Ballon de mesure B: Bouchon C: Tube d'aération D: Thermomètre E: Thermomètre auxiliaire F: Bain de liquide G: Tube à essais (diamètre extérieur de 5 mm au maximum), contenant un tube capillaire, d'environ 100 mm de longueur, 1 mm de diamètre interne et 0,2 à 0,3 mm d'épaisseur de paroi H: Tube latéral Un tube capillaire (capillaire d'ébullition) scellé à environ 1 cm au-dessus de son extrémité inférieure est plongé dans le tube à essais contenant la substance à étudier. La partie scellée du capillaire doit se trouver en dessous de la surface du liquide. Le tube à essai contenant le capillaire doit être attaché au thermomètre avec un élastique ou fixé au moyen d'un support latéral (voir figure 2). Figure 2 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Méthode selon Siwoloboff Figure 3 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Méthode modifiée Le liquide du bain est choisi en fonction de la température d'ébullition. Pour des températures allant jusqu'à 573 K, on peut utiliser de l'huile de silicone. La paraffine liquide ne convient que pour des températures inférieures à 473 K. Au départ, le chauffage du bain doit être réglé de façon à obtenir un accroissement de température de 3 K/min. Le liquide du bain doit être agité. À environ 10 K en dessous de la température d'ébullition présumée, le chauffage est réduit de telle sorte que l'accroissement de température ne dépasse pas 1 K par minute. À l'approche de la température d'ébullition, des bulles commencent à s'échapper rapidement du capillaire à l'ébullition. La température d'ébullition est déterminée par la température à laquelle, lors d'un refroidissement momentané, le chapelet de bulles s'interrompt et le liquide s'élève soudain dans le capillaire. La température relevée à ce moment précis correspond à la température d'ébullition de la substance. Dans la méthode modifiée (figure 3), la température d'ébullition est déterminée dans un capillaire à température de fusion. L'extrémité de ce dernier est étirée en une fine pointe d'environ 2 centimètres de longueur (a) et une petite quantité de la substance à tester est aspirée à l'intérieur. La pointe est alors scellée en emprisonnant une petite bulle d'air. Lors du chauffage dans l'appareil servant à déterminer la température de fusion (b), la bulle d'air se dilate. La température d'ébullition correspond à la température à laquelle l'échantillon de la substance atteint le niveau de la surface du bain de liquide (c). 1.6.5. Détection photo-électrique Un échantillon de la substance à tester est chauffé dans un tube capillaire placé à l'intérieur d'un bloc métallique chauffant. Un faisceau de lumière est envoyé, par les ouvertures aménagées dans le bloc, à travers la substance vers une cellule photo-électrique étalonnée de façon précise. Durant l'accroissement de la température de l'échantillon, quelques bulles d'air s'échappent du capillaire d'ébullition. Lorsque la température d'ébullition est atteinte, le nombre de bulles augmente très fortement. La modification de l'intensité lumineuse qui s'ensuit est enregistrée par la cellule, qui envoie un signal d'arrêt à l'indicateur de température (thermomètre à résistance de platine placé dans le bloc). Cette méthode est particulièrement utile parce qu'elle permet d'effectuer des déterminations en dessous de la température ambiante jusqu'à 253,15 K ( 20 C) sans aucune modification de l'appareil. L'instrument doit simplement être placé dans un bain réfrigérant. 1.6.6. Analyse thermique 1.6.6.1. Analyse thermique différentielle Voir annexe. 1.6.6.2. Analyse calorimétrique différentielle Voir annexe. 2. DONNÉES Pour de faibles écarts par rapport à la pression normale (maximum ±5 kPa), les températures d'ébullition peuvent être ramenées à Tn par l'équation de Sidney Young: Tn = T + (fT × D p) où: Ä p = (101,325 p) [attention au signe] p = pression barométrique en kPa fT = vitesse de variation de la température d'ébullition avec la pression, en K/kPa T = valeur mesurée de la température d'ébullition, en K Tn = valeur corrigée de la température d'ébullition, en K, à la pression normale. Les facteurs de correction de la température (fT) et les équations de calcul des approximations figurent dans les normes internationales et nationales citées dans le texte (valable pour de nombreuses substances). Par exemple, la méthode DIN 53171 donne les corrections pour les solvants contenus dans les peintures: >EMPLACEMENT TABLE> 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essais contiendra, si possible, les renseignements suivants: - la méthode utilisée, - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire, - une estimation de la précision. La température d'ébullition indiquée dans le procès-verbal est la moyenne d'au moins deux mesures qui se situent à l'intérieur des limites de précision estimées (tableau 1). Les valeurs mesurées des températures d'ébullition ainsi que leurs moyennes doivent être indiquées et la (les) pression(s) auxquelles ont été effectuées les mesures doivent être notées en kPa. La pression doit de préférence être proche de la pression atmosphérique normale. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être fournies, notamment en ce qui concerne les impuretés et l'état physique de la substance. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, ligne directrice n 103, décision du Conseil C(81) 30 final. (2) UICPA, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II. (3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII. Annexe Pour plus de détails techniques, on peut, par exemple, consulter les normes suivantes: 1. Ébulliomètre ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes 2. Méthode de distillation (intervalle d'ébullition) ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation 3. Analyse thermique différentielle et analyse calorimétrique différentielle ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis ASTM E 473-85 Standard definition of terms relating to thermal analysis ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe A.3. DENSITÉ RELATIVE 1. MÉTHODE Les méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont décrits dans la référence (2). 1.1. INTRODUCTION Les méthodes de détermination de la densité relative décrites s'appliquent aux substances solides et liquides, quel que soit leur degré de pureté. Les diverses méthodes à appliquer sont énumérées dans le tableau 1. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La densité relative, D420, des solides ou des liquides est le rapport entre la masse d'un volume de substance à tester, déterminée à 20 C, et la masse du même volume d'eau, déterminée à 4 C. La densité relative est un nombre sans dimension. La masse volumique, ñ, d'une substance est le quotient de la masse, m, par son volume v. En unités SI, la masse volumique, ñ, est exprimée en kg/m3. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE (1) (3) Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Les substances de référence doivent essentiellement servir à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre la comparaison avec les résultats obtenus avec d'autres méthodes. 1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES Quatre types de méthodes sont utilisés. 1.4.1.1 Aréomètre (pour les liquides) On peut obtenir des mesures de densité suffisamment précises et rapides à l'aide d'aréomètres flottants qui permettent de déduire la densité d'un liquide à partir de la profondeur d'immersion repérée sur une échelle graduée. 1.4.1.2 Balance hydrostatique (pour les liquides et les solides) La différence entre le poids d'un échantillon mesuré dans l'air et dans un liquide approprié (par exemple l'eau) peut servir à déterminer sa densité. Dans le cas des solides, la densité mesurée n'est représentative que de l'échantillon utilisé. Pour déterminer la densité d'un liquide, on pèse un corps d'un volume v tout d'abord dans l'air, puis dans le liquide. 1.4.1.3 Méthode du corps immergé (pour les liquides) (4) Dans cette méthode, la densité d'un liquide est déterminée à partir de la différence entre les résultats de la pesée du liquide avant et après immersion d'un corps de volume connu dans le liquide à étudier. 1.4.2. Méthodes pycnométriques Pour les solides ou les liquides, on peut utiliser des pycnomètres de forme variée dont les volumes sont connus. La densité est calculée à partir de la différence de poids entre le pycnomètre plein et le pycnomètre vide, d'une part, et de son volume connu, d'autre part. 1.4.3. Pycnomètre de comparaison à air (pour les solides) La densité d'un solide de forme quelconque peut être mesurée, à la température ambiante, à l'aide d'un pycnomètre de comparaison à gaz. Le volume d'une substance dans l'air ou dans un gaz inerte est mesuré dans une éprouvette graduée de volume variable. Pour le calcul de la densité, une mesure de masse est effectuée après la mesure du volume. 1.4.4. Densimètre oscillant (5) (6) (7) La densité d'un liquide peut être mesurée à l'aide d'un densimètre oscillant. Un oscillateur mécanique, ayant la forme d'un U, vibre à une fréquence de résonance spécifique qui dépend de sa masse. L'introduction d'un échantillon modifie la fréquence de résonance de l'oscillateur. L'appareil doit être étalonné à l'aide de deux substances liquides de densités connues, choisies de préférence de façon à ce que leurs densités couvrent l'intervalle de mesure. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ L'applicabilité des différentes méthodes utilisées pour la détermination de la densité relative est représentée au tableau. 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES Les références des normes citées en exemple, qui peuvent être consultées pour obtenir des détails techniques supplémentaires, sont jointes à l'annexe. Les mesures doivent être réalisées à 20 C, et au moins en double. 2. DONNÉES Voir normes. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal contiendra, si possible, les renseignements suivants: - la méthode utilisée, - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, éventuellement, l'étape de purification préliminaire. La densité relative D420 doit être indiquée selon la définition figurant au point 1.2 en même temps que l'état physique de la substance examinée. Toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être mentionnées, en particulier en ce qui concerne les impuretés et l'état physique de la substance. >EMPLACEMENT TABLE> 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 109, Décision du Conseil C(81) 30 Final. (2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1. (3) IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508. (4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 427-430. (5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302. (6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung - Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726. (7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255. Annexe Pour plus de détails techniques, on peut consulter, par exemple, les normes suivantes. 1. MÉTHODES DE FLOTTABILITÉ 1.1. Aréomètre DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose NF T 20-050 Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la densité des liquides - Méthode aréométrique DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers 1.2. Balance hydrostatique Pour les substances solides ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-049 Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la densité des solides autres que les poudres et les produits alvéolaires - Méthode de la balance hydrostatique ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density Pour les substances liquides ISO 901 ISO 758 DIN 51757 Testing of mineral oil and related materials; determination of density ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 et ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 1.3. Méthode du corps immergé DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method 2. MÉTHODES PYCNOMÉTRIQUES 2.1. Pour les substances liquides ISO 3507 Pycnometers ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 C DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6m2s 1 at 15 C DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6 m2 s 1 at 20 C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 C) DIN 12806 Hubbard pycnoter (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture) DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer DIN 51757 Point 7: testing of mineral oils and related materials; determination of density ASTM D 297 Section 15: Rubber products -chemical analysis ASTM D 2111 (Method C: Halogenated organic compounds) BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method NF T 20-053 Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la densité des solides en poudre et des liquides - Méthode pycnométrique 2.2. Pour les substances solides ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics NF T 20-053 Produits chmiques à usage industriel - Détermination de la densité des solides en poudre et des liquides - Méthode pycnométrique DIN 19683 Determination of the density of soils 3. PYCNOMÈTRE DE COMPARAISON À AIR DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige polymere; Prüfung A.4. PRESSION DE VAPEUR 1. MÉTHODES La plupart des méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Les principes fondamentaux sont énoncés dans les références (2) et (3). 1.1. INTRODUCTION Il est souhaitable de disposer d'informations préliminaires concernant la structure, la température de fusion et la température d'ébullition de la substance avant de procéder à cet essai. Il n'existe aucune méthode de mesure qui soit applicable à toute la gamme des pressions de vapeur. C'est pourquoi plusieurs méthodes sont recommandées pour la mesure des pressions de vapeur allant de EMPLACEMENT TABLE> 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES 1.6.1. Mesure dynamique 1.6.1.1. Appareil L'appareil de mesure comporte un appareil à reflux avec réfrigérant en verre ou en métal (figure 1), un dispositif de mesure de la température et un système de régulation et de mesure de la pression. L'appareil de mesure type représenté sur le schéma est en verre et se compose de cinq parties: Un tube large partiellement à double paroi, comprenant un joint rodé, un réfrigérant, un récipient de refroidissement et un orifice d'admission. Un cylindre de verre relié à une pompe Cottrel, qui est monté sur la section du tube où s'effectue l'ébullition et qui possède une surface rugueuse pour éviter les soubresauts lors de l'ébullition. La température est mesurée à l'aide d'un détecteur approprié (par exemple un thermomètre à résistance ou un thermocouple à enveloppe) immergé dans l'appareil au point de mesure (n 5, figure 1) par un orifice d'admission approprié (par exemple un joint mâle rodé). Cet appareil est relié à un dispositif de régulation et de mesure de la pression. L'ampoule, qui sert de volume tampon, est reliée à l'appareil de mesure par l'intermédiaire d'un tube capillaire. L'appareil à reflux est chauffé à l'aide d'un élément chauffant (par exemple une cartouche chauffante) inséré dans le bas de l'appareil en verre. Le courant nécessaire pour le chauffage est établi et contrôlé au moyen d'un thermocouple. Une pompe à vide permet d'obtenir le vide désiré, entre 102 Pa et 105 Pa environ. Une soupape appropriée est utilisée pour contrôler l'arrivée d'air ou d'azote afin d'établir la pression souhaitée (entre 102 et 105 Pa environ) et d'assurer la ventilation. La pression est mesurée à l'aide d'un manomètre. 1.6.1.2. Mesure On mesure la pression de vapeur en déterminant la température d'ébullition de l'échantillon à plusieurs pressions spécifiées comprises entre 103 et 105 Pa environ. La température d'ébullition est atteinte lorsque la température reste constante à une pression donnée. Cette méthode n'est pas applicable aux substances moussantes. La substance est placée dans une colonne propre et sèche. Quand les solides ne sont pas sous forme de poudre, le remplissage peut poser des problèmes. Toutefois, il est parfois possible d'y remédier en chauffant la gaine de refroidissement. Après remplissage, l'appareil est scellé au collet et la substance est dégazée. La plus basse des pressions désirées est alors établie et le système de chauffage est mis en marche en même temps que le détecteur de température est connecté à un enregistreur. L'équilibre est atteint lorsque la température d'ébullition enregistrée est constante pour une pression donnée. Il faut prendre particulièrement soin d'éviter les soubresauts pendant l'ébullition. En outre, il peut se produire une condensation complète sur le réfrigérant. Lors de la détermination de la pression de vapeur de solides dont la température de fusion est basse, il convient de prendre soin d'éviter le bouchage du condenseur. Après enregistrement de ce point d'équilibre, une pression plus élevée est établie. Le processus se poursuit de la même manière jusqu'à ce qu'une pression de 105 Pa soit atteinte (environ 5 à 10 mesures en tout qui seront répétées pour vérification à des pressions décroissantes). 1.6.2. Mesure statique 1.6.2.1. Appareil L'appareil comporte un récipient où placer l'échantillon ainsi qu'un système de chauffage et de refroidissement permettant de contrôler et de mesurer la température de l'échantillon. Il comporte également un dispositif de réglage et de mesure de la pression. Les figures 2a et 2b illustrent les principes fondamentaux de cette méthode. La cellule où est placé l'échantillon (figure 2a) est reliée d'un côté à un robinet à vide poussé et, de l'autre, à un tube en U rempli d'un liquide manométrique approprié. L'autre extrémité du tube en U se termine par une tubulure dont les branches mènent à la pompe à vide, à un récipient à azote ou à la soupape de ventilation et à un manomètre. Le tube en U peut être remplacé par une jauge de pression munie d'un indicateur de pression (figure 2b). Pour amener l'échantillon à la température choisie, le récipient contenant l'échantillon ainsi que le robinet et le tube en U ou la jauge de pression, sont plongés dans un bain maintenu à une température constante de ± 0,2 K. La température est mesurée au niveau de la paroi extérieure du récipient contenant l'échantillon, ou à l'intérieur de celui-ci. Une pompe à vide munie d'un piège réfrigérant en amont est utilisée pour faire le vide dans l'appareil. Dans la méthode 2a, la pression de vapeur de la substance est mesurée indirectement à l'aide d'un indicateur de zéro. Cette méthode tient compte du fait que la densité du fluide dans le tube en U est modifiée par un changement important de la température. Différents liquides, huiles de silicone et phtalates, peuvent être utilisés comme indicateur de zéro dans le tube en U, selon la gamme de pressions et le comportement chimique de la substance. La substance à tester ne doit pas se dissoudre ou réagir d'une manière notable avec le liquide du tube en U. Pour le manomètre, le mercure peut être utilisé pour une gamme de pression d'air normale jusqu'à 102 Pa, alors que les huiles de silicone et les phtalates conviennent en dessous de 102 Pa et jusqu'à 10 Pa. Quant aux manomètres à membrane chauffables, il peuvent même être utilisés pour des pressions inférieures à 10 1 Pa. Il existe d'autres jauges de pression qui peuvent aussi être utilisées en dessous de 102 Pa. 1.6.2.2. Mesure Avant la mesure, toutes les parties de l'appareil schématisé sur la figure 2 sont soigneusement nettoyées et séchées. Pour la méthode 2a, le tube en U est rempli avec le liquide choisi, qui doit être dégazé à une température élevée avant d'effectuer les lectures. La substance à tester est placée dans l'appareil, qui est alors fermé et la température est suffisamment abaissée pour permettre le dégazage. La température doit être assez basse pour que l'air soit aspiré, mais sans toutefois modifier la composition du produit dans le cas de systèmes constitués de plusieurs composants. L'équilibre peut, si nécessaire, être établi plus rapidement par agitation. L'échantillon peut être refroidi plus efficacement, par exemple à l'aide d'azote liquide (attention à la condensation de l'air et du liquide de la pompe) ou d'un mélange d'éthanol et de glace carbonique. Pour les mesures à basse température, il convient d'utiliser un bain thermostaté relié à un cryostat. Pour faire le vide dans l'appareil, l'air est aspiré pendant plusieurs minutes, le robinet qui se trouve au dessus du récipient contenant l'échantillon étant ouvert. Le robinet est ensuite fermé et l'échantillon est amené à la plus basse des températures voulues. L'opération de dégazage doit, si nécessaire, être répétée plusieurs fois. Lorsque l'échantillon est chauffé, la pression de vapeur augmente, ce qui modifie l'équilibre du liquide dans le tube en U. Pour compenser ce changement, on fait entrer de l'azote ou de l'air dans l'appareil en ouvrant le robinet jusqu'à ce que le liquide indicateur de pression soit revenu au zéro. La pression nécessaire peut être lue sur un manomètre de précision à température ambiante. Cette pression correspond à la pression de vapeur de la substance à une température donnée. La méthode 2b est similaire mais la pression de vapeur est lue directement. La dépendance de la pression de vapeur vis-à-vis de la température est déterminée à des intervalles appropriés (environ 5 à 10 mesures en tout à intervalles courts) jusqu'au maximum désiré. Les mesures à basse température doivent être répétées pour vérification. Si les valeurs obtenues en effectuant des mesures répétées ne co¨ uncident pas avec la courbe obtenue pour des températures croissantes, cela peut être dû à l'une des raisons suivantes: 1. L'échantillon contient encore de l'air (par exemple dans le cas de produits d'une viscosité élevée) ou des substances dont la température d'ébullition est basse, qui ont été libérés pendant le chauffage et peuvent être éliminés par aspiration après une étape de sur-réfrigération supplémentaire. 2. La température de refroidissement n'est pas assez basse. Il faut alors utiliser de l'azote liquide comme réfrigérant. S'il s'avère que le problème est dû à l'une de ces deux raisons, il convient de répéter les mesures. 3. La substance subit une réaction chimique dans la gamme de température utilisée (par exemple: décomposition, polymérisation). 1.6.3. Isoténiscope Pour une description complète de cette méthode, se référer à la référence 7. Le principe de l'appareil de mesure est décrit dans la figure 3. À l'instar de la méthode statique décrite au point 1.6.2, la méthode à l'isoténiscope est applicable aux solides et aux liquides. Dans le cas des liquides, la substance elle-même sert de liquide de remplissage dans le manomètre auxiliaire. Une quantité de liquide suffisante pour remplir l'ampoule et la partie courte du manomètre est versée dans l'isoténiscope. L'isoténiscope est ensuite relié à une pompe à vide; une fois le vide fait dans l'appareil, celui-ci est rempli d'azote. L'évacuation et la purge de système sont répétées deux fois afin d'éliminer l'oxygène résiduel. L'isoténiscope rempli est placé en position horizontale de telle sorte que l'échantillon forme une couche fine dans l'ampoule et dans le manomètre (partie en U). La pression du système est réduite à 133 Pa et l'échantillon est chauffé doucement jusqu'au début de l'ébullition afin d'éliminer les gaz dissous fixés. L'isoténiscope est ensuite placé de telle manière que l'échantillon revienne remplir entièrement l'ampoule et la branche courte du manomètre. La pression est maintenue comme pour le dégazage; la pointe de l'ampoule est chauffée à l'aide d'une petite flamme jusqu'à ce que la vapeur provenant de l'échantillon soit suffisante pour déplacer une partie de l'échantillon de la partie supérieure de l'ampoule et de la branche du manomètre vers la partie manomètre de l'isoténiscope, créant ainsi un espace dépourvu d'azote et rempli de vapeur. L'isoténiscope est ensuite placé dans un bain thermostaté, et la pression d'azote est réglée de manière à être la même que celle de l'échantillon. La balance de pressions est indiquée par la partie manomètre de l'isoténiscope. À l'équilibre, la pression de vapeur de l'azote est égale à celle de la substance. Dans le cas des solides, le manomètre est rempli avec l'un des liquides énumérés au point 1.6.2.1, choisi en fonction de la gamme de pression et de température. L'ampoule du côté de la partie la plus longue de l'isoténiscope est remplie avec le liquide dégazé du manomètre. Le solide à examiner est ensuite introduit dans l'ampoule et dégazé à haute température. L'isoténiscope est alors incliné de telle sorte que le liquide du manomètre puisse couler dans le tube en U. La pression de vapeur est mesurée en fonction de la température conformément à la description présentée au point 1.6.2. 1.6.4. Méthode d'effusion: balance de pression de vapeur 1.6.4.1. Appareil Plusieurs modèles d'appareil sont décrits dans la littérature (1). L'appareil représenté à la figure 4 illustre le principe général de la méthode. Il se compose principalement d'une cuve à vide poussé en acier inoxydable ou en verre, d'une pompe avec dispositif de mesure du vide et d'un équipement incorporé permettant de mesurer la pression de vapeur sur une balance. Les équipements suivants sont incorporés à l'appareil: - Un four d'évaporation avec bride et canal d'alimentation rotatif. Il s'agit d'un récipient cylindrique, fabriqué par exemple en cuivre ou en un alliage chimiquement résistant d'une bonne conductivité thermique. Un récipient de verre doublé d'une paroi de cuivre peut également être utilisé. Le four a un diamètre de 3 à 5 cm et une hauteur de 2 à 5 cm, environ; il possède de un à trois orifices d'évaporation de sections différentes. Le chauffage du four est produit, soit par une plaque chauffante située en-dessous, soit par une spirale chauffante qui l'entoure à l'extérieur. Afin d'éviter une dissipation de la chaleur vers le plateau de base, le système de chauffage est fixé sur ce dernier à l'aide d'un métal de faible conductivité thermique (acier au nickel-argent ou au chrome-nickel); par exemple, si le four utilisé est muni de plusieurs orifices, un tuyau d'acier au nickel-argent est attaché à un canal d'alimentation rotatif. Ce dispositif présente l'avantage de permettre l'introduction d'une barre de cuivre ce qui permet d'assurer le refroidissement par l'extérieur à l'aide d'un bain réfrigérant. - Le couvercle du four en cuivre possédant trois orifices de sections différentes, situés à 90 degrés l'un de l'autre, permet de couvrir plusieurs gammes de pression de vapeur au sein de la gamme de mesures globales (orifices d'un diamètre de 0,30 à 4,50 mm environ). Des ouvertures larges sont utilisées pour les pressions de vapeur basses et vice versa. L'orifice choisi ou une position intermédiaire dans le flux de vapeur (orifice du four - bouclier - plateau de la balance) est sélectionné par rotation du four, ce qui permet de diriger le flux moléculaire sur le plateau de la balance au travers de l'orifice du four, ou de l'en dévier. La température de la substance est mesurée à l'aide d'un thermocouple ou d'un thermomètre à résistance placé à un endroit approprié. - Le plateau d'une microbalance ultrasensible est placé sous le bouclier (voir ci-après). Le plateau de la balance a un diamètre de 30 mm environ. L'aluminium, revêtu d'une couche d'or est un matériau approprié. - Le plateau de la balance est entouré par un cylindre en laiton ou une enceinte de réfrigération en cuivre. Certains types de balances disposant d'un orifice pour le fléau de la balance et d'un orifice dans le bouclier permettant le passage du flux moléculaire assurent une condensation complète de la vapeur sur le plateau de la balance. La dissipation de la chaleur vers l'extérieur est assurée par une barre de cuivre connectée à l'enceinte de réfrigération. Cette barre thermiquement isolée au moyen d'un tube d'acier au chrome-nickel, par exemple, traverse le plateau de base. Sous le plateau de base, la barre plonge dans un vase de Dewar contenant de l'azote liquide, ou de l'azote liquide circule au travers de cette barre. L'enceinte de réfrigération est ainsi maintenue à une température d'environ 120 C. Le plateau de la balance n'est refroidi que par rayonnement ce qui suffit pour la gamme de pressions soumises à l'étude (refroidir une heure environ avant le début des mesures). - La balance est placée au-dessus de l'enceinte de réfrigération. On peut citer parmi les balances qui conviennent pour cette méthode la microbalance électronique ultrasensible à deux bras (8) ou la balance ultrasensible à bobine mobile (voir la ligne directrice 104 de l'OCDE, édition 12 mai 1981). - Le plateau de base comporte aussi des connexions électriques pour thermocouples (ou pour thermomètres à résistance) et bobines de chauffage. - Le vide est produit dans le récipient à l'aide d'une pompe à vide partiel ou d'une pompe à vide poussé (le vide requis, correspondant à une pression d'environ 1 à 2 × 10 3 Pa, est obtenu après deux heures de pompage). La pression est contrôlée à l'aide d'un manomètre à ionisation approprié. 1.6.4.2. Mesure Le récipient est rempli avec la substance à tester et le couvercle est fermé. Le bouclier et l'enceinte de réfrigération sont glissés de l'autre côté du four. L'appareil est fermé et les pompes à vide sont branchées. La pression à obtenir avant le commencement de la mesure est d'environ 10 4 Pa. Le refroidissement de l'enceinte de réfrigération commence à 10 2 Pa. Une série d'étalonnage à la plus basse des températures choisies commence dès que le vide nécessaire est atteint. L'orifice approprié dans le couvercle est ouvert et le jet de vapeur qui traverse le bouclier juste au-dessus de l'orifice vient frapper le plateau réfrigéré de la balance. Ce dernier doit être d'une taille suffisante pour garantir que le jet qui traverse le bouclier l'atteint tout entier. L'impulsion du jet de vapeur, exerce une force sur le plateau de la balance et les molécules se condensent au contact de sa surface froide. Cette impulsion et la condensation simultanée produisent un signal sur l'enregistreur. L'évaluation des signaux fournit deux types d'informations: 1. L'appareil décrit ici permet de déterminer la pression de vapeur directement à partir de la force exercée sur le plateau de la balance [il n'est pas nécessaire pour cela de connaître le poids moléculaire (2)]. Des facteurs géométriques, tels que la section de l'orifice du four et l'angle du flux moléculaire, doivent être pris en considération pour l'évaluation des lectures. 2. La masse du condensat peut être mesurée en même temps et on peut en déduire la vitesse d'évaporation. La pression de vapeur peut également être calculée à partir de la vitesse d'évaporation et du poids moléculaire à l'aide de l'équation de Hertz (2). p = G2 p RT × 103M où: G = vitesse d'évaporation (kg s 1 m 2) M = masse molaire (g mol 1) T = température (K) R = constante molaire des gaz parfaits (J mol 1 K 1) p = pression de vapeur (Pa) Lorsque le vide nécessaire est atteint, une série de mesures est entreprise à la plus basse des températures choisies. Pour les mesures suivantes, la température est augmentée par petits intervalles jusqu'au moment où la plus haute valeur choisie est atteinte. L'échantillon est alors refroidi une nouvelle fois et une deuxième courbe de pression de vapeur peut être enregistrée. Si les résultats du second enregistrement ne confirment pas ceux du premier, il est possible que la substance se décompose aux températures choisies pour la détermination. 1.6.5. Méthode d'effusion - par perte de poids 1.6.5.1. Appareil L'appareil utilisé dans la présente méthode comporte principalement les éléments suivants: - une cuve dont la température et la pression peuvent être contrôlées, dans lequel sont placées les cellules à effusion, - une pompe à vide poussé (par exemple une pompe à diffusion ou une pompe turbomoléculaire) accompagnée d'une jauge à vide, - un piège contenant de l'azote liquide ou de la glace carbonique. La figure 5 présente un exemple de cuve à vide en aluminium, munie d'un système de chauffage électrique, contenant quatre cellules à effusion en acier inoxydable. La feuille d'acier inoxydable, d'une épaisseur de 0,3 mm, et percée d'un orifice à effusion d'un diamètre de 0,2 à 1,0 mm est fixée à la cellule à effusion à l'aide d'un couvercle fileté. 1.6.5.2. Mesure La substance de référence et la substance à tester sont versées dans la cellule à effusion. Le diaphragme métallique percé d'un orifice est fixé à l'aide du couvercle fileté et la cellule est pesée avec une précision de 0,1 mg. La cellule est placée dans l'appareil thermostaté où la pression est alors réglée à une valeur correspondant au dixième de la pression attendue. On laisse entrer de l'air dans l'appareil à des intervalles de temps définis entre 5 et 30 heures, et la perte de masse de la cellule à effusion est déterminée grâce à une nouvelle pesée. Pour s'assurer que les résultats ne sont pas perturbés par la présence d'impuretés volatiles, la cellule est pesée à intervalles réguliers, ce qui permet de vérifier que le taux d'évaporation est constant, au moins pendant deux intervalles de temps. La pression de vapeur p dans la cellule d'effusion est calculée au moyen de l'équation suivante: p =m KAtE2pRTM où: p = pression de vapeur (Pa) m = masse de la substance qui quitte la cellule pendant le temps t (kg) t = temps (s) A = surface de l'orifice (m2) K = facteur de correction R = constante molaire des gaz parfaits (J mol 1 K 1) T = température (K) M = masse moléculaire (kg mol 1) Le facteur de correction K dépend du rapport de la longueur sur le rayon de l'orifice cylindrique: rapport:0,10,20,61,02,0 K:0,9520,9090,7710,6720,514 On peut écrire l'équation suivante: p = EmtTM où = E1KA2pR représente la constante de la cellule à effusion. Cette constante E peut être déterminée à l'aide de substances de référence (2,9), en appliquant l'équation suivante: E =p(r)tmM(r)T où: p(r) = pression de vapeur de la substance de référence (Pa) M(r) = masse moléculaire de la substance de référence (kg mol 1) 1.6.6. Méthode de saturation des gaz 1.6.6.1. Appareil L'appareil utilisé dans la présente méthode comporte un certain nombre d'éléments qui sont schématisés sur la figure 6 a et décrits ci-après (1). Gaz inerte: Le gaz porteur ne doit pas réagir avec la substance à tester. L'azote convient dans la plupart des cas mais d'autres gaz peuvent parfois être employés (10). Le gaz choisi doit être sec (voir figure 6 a, numéro 4: Sonde d'humidité relative). Contrôle du flux gazeux: Un système adéquat de contrôle des gaz est indispensable pour assurer un flux constant et suffisant à travers la colonne de saturation. Collecteurs de vapeur: Leur choix dépend des caractéristiques de l'échantillon, ainsi que de la méthode d'analyse utilisée. La vapeur doit être recueillie quantitativement et sous une forme qui permet l'analyse ultérieure. Pour certaines substances, on utilisera des collecteurs contenant des liquides tels que l'hexane ou l'éthylène glycol. Pour d'autres, on recourra à des adsorbants solides. Au lieu de recueillir la vapeur pour l'analyser ultérieurement, il est possible d'utiliser des techniques analytiques directes, comme la chromatographie, pour déterminer la quantité de matériel transporté par un volume connu de gaz porteur. De surcroît, la perte de masse de l'échantillon peut être mesurée. Enceinte calorifugée: Pour les mesures à différentes températures, il peut être nécessaire de prévoir une enceinte calorifugée. Colonne de saturation: La substance à tester en solution est déposée sur un support inerte qui est ensuite tassé dans la colonne de saturation. Les dimensions de celle-ci et la vitesse d'écoulement doivent être choisies de façon à assurer la saturation complète du gaz porteur. La colonne doit être thermostatée. Pour les déterminations s'effectuant à des températures supérieures à la température ambiante, l'espace entre la colonne et les collecteurs doit être chauffé pour empêcher la condensation de la substance. Afin de diminuer la diffusion de la matière, un tube capillaire peut être placé après la colonne de saturation (figure 6 b). 1.6.6.2. Mesure Préparation de la colonne de saturation: Après mise en solution dans un solvant très volatil, une partie de la substance d'essai est ajoutée à une quantité donnée du matériau de support. La quantité de substance ajoutée à une quantité adaptée du support doit être suffisante pour maintenir la saturation pendant toute la durée de l'essai. Le solvant est complètement évaporé à l'air ou dans un évaporateur rotatif et le matériau bien homogénéisé est introduit dans la colonne. Une fois l'échantillon thermostaté, un courant d'azote sec est envoyé à travers l'appareil. Mesure: Les collecteurs ou le détecteur direct sont reliés aux tubes de sortie de la colonne et le temps est enregistré. Le débit est vérifié au début de l'expérience et à intervalles réguliers en cours d'expérience, grâce à un débitmètre à bulles (ou encore, en continu, à l'aide d'un débitmètre massique). Il faut mesurer la pression à la sortie de la colonne de saturation soit: a) en intercalant une jauge à pression entre le saturateur et les pièges (cette méthode peut se révéler peu satisfaisante en raison de l'accroissement du volume mort et de la surface d'adsorption) ou b) en déterminant la perte de charge du système de pièges utilisé, en fonction du débit dans une expérience séparée (cette méthode peut se révéler peu satisfaisante pour les collecteurs à liquide). Le temps qu'il faut pour recueillir la quantité de substance nécessaire aux différentes méthodes d'analyse est déterminé au cours d'essais préliminaires ou par estimation. Au lieu de recueillir la substance pour l'analyser ultérieurement, il est possible d'avoir recours à des techniques analytiques quantitatives directes (comme la chromatographie). Avant de calculer la pression de vapeur à une température donnée, il y a lieu d'effectuer des essais préliminaires pour déterminer le débit maximal qui saturera complètement le gaz porteur avec la vapeur de la substance. Il faut pour cela que le gaz porteur passe dans le saturateur suffisamment lentement pour qu'aucune vitesse inférieure ne fournisse de pression de vapeur calculée plus importante. Le choix de la méthode d'analyse sera fonction de la nature de la substance à tester (par exemple chromatographie en phase gazeuse ou gravimétrie). La quantité de substance transportée par un volume connu de gaz porteur est déterminée. 1.6.6.3. Calcul de la pression de vapeur La pression de vapeur est calculée à partir de la densité de vapeur (M/V) au moyen de l'équation suivante: p =WV×RTM où: p = pression de vapeur (Pa) W = masse de la substance évaporée (g) V = volume de gaz saturé (m3) R = constante molaire des gaz parfaits (J mol 1 K 1) T = température (K) M = masse molaire de la substance à tester (g mol 1) Les volumes mesurés doivent être corrigés pour tenir compte des différences de pression et de température entre le débitmètre et le saturateur thermostaté. Si le débitmètre est placé en aval du collecteur de vapeur, des corrections peuvent être nécessaires pour tenir compte de l'évaporation éventuelle des produits contenus dans les collecteurs (1). 1.6.7. Méthode du rotor (8, 11, 13) 1.6.7.1. Appareil La présente méthode peut être réalisée à l'aide d'une jauge à viscosité à rotor représentée à la figure 8. Le montage expérimental est schématisé à la figure 7. L'appareil de mesure type comporte une tête de mesure à rotor placée dans une enceinte thermostatée (réglée avec une précision de 0,1 C). Le récipient qui contient l'échantillon est placé dans une enceinte thermostatée (réglée avec une précision de 0,01 C); tous les autres éléments du montage sont maintenus à une température supérieure afin d'éviter la condensation. Un dispositif de pompe à vide poussé est connecté au système au moyen de vannes appropriées. La tête de mesure à rotor est constituée d'une bille d'acier (d'un diamètre de 4 à 5 mm) placée dans un tube. La bille est mise en suspension et stabilisée dans un champs magnétique généralement au moyen d'aimants permanents et de bobines de contrôle. La bille est mise en mouvement par les champs rotatifs produits par les bobines. La vitesse de rotation de la bille est mesurée grâce aux bobines de lecture qui déterminent sa faible, mais toujours présente, magnétisation latérale. 1.6.7.2. Mesure Lorsque la bille a atteint une vitesse de rotation donnée v(o), (généralement de 400 révolutions par seconde environ), on coupe l'alimentation et la décélération, due à la friction par le gaz, commence. La chute de la vitesse de rotation est mesurée en fonction du temps. La friction due à la suspension magnétique étant négligeable par rapport à la friction du gaz, la pression du gaz est donnée par l'équation suivante: p =pcrrs10t×lnv(t)v(o) où: c = vitesse moyenne des molécules de gaz r = rayon de la bille ñ = densité massique de la bille ó = coefficient de transfert tangentiel du moment (ó = 1 si la bille a une surface sphérique idéale) t = temps v(t) = vitesse de rotation après un temps t v(o) = vitesse de rotation initiale Cette équation peut également s'écrire de la manière suivante: p =pcrr10s×tn tn-1 tn × tn-1 où tn, et tn 1, sont les temps requis pour effectuer un nombre donné N de révolutions. Ces intervalles de temps tn et tn 1 se succèdent et tn > tn 1. La vitesse moyenne de la molécule de gaz c est donnée par l'équation suivante: c =(8 RTp M)12 où: T = température R = constante molaire des gaz parfaits M = masse molaire 2. DONNÉES Quelle que soit la méthode choisie, la pression de vapeur doit être déterminée à deux niveaux de température au moins. Trois niveaux ou plus sont préférables, entre 0 C et 50 C, pour vérifier la linéarité de la courbe de la pression de vapeur. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - la méthode utilisée, - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, s'il y a lieu, l'étape de purification préliminaire, - au moins deux valeurs pour la pression de vapeur et la température, de préférence comprise entre 0 et 50 C, - toutes les données brutes, - une courbe de log p en fonction de 1/T, - une estimation de la pression de vapeur à 20 C ou 25 C. En cas de modification (changement d'état, décomposition): - nature de la modification, - température à laquelle la modification survient à la pression atmosphérique, - pression de vapeur à 10 C et 20 C en dessous et au-dessus de la température de transition (sauf en cas de passage de l'état solide à l'état gazeux). Toutes les informations et remarques pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 104, décision du Conseil C(81) 30 Final. (2) Ambrose, D. in B. Le Neindre; B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II. (3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Chapter IX, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I. (4) Knudsen, M. Ann Phys. Lpz., 1909, vol. 29,1979; 1911, vol. 34, 593. (5) NF T 20-048 AFNOR (septembe 1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10 1 à 105 Pa. Méthode statique. (6) NF T 20-047 AFNOR (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la pression de vapeur des solides et des liquides dans le domaine 10 3 à 1 Pa. Méthode de la balance de pression de vapeur. (7) ASTM D 2879-86 Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (8) G. Messer, P. Röhl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac Sci.Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440. (9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173. (10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435. (11) G. Comsa, J.K. Fremerey anb B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642. (12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148. (13) J.K. Fremerey. J. Vac Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715. Annexe 1 Méthode d'estimation INTRODUCTION Des valeurs calculées de la pression de vapeur peuvent être utilisées pour: - choisir la méthode expérimentale, - fournir une estimation ou une valeur limite au cas où la méthode expérimentale ne peut pas être appliquée pour des raisons techniques (notamment lorsque la pression de vapeur est très faible), - contribuer à déceler les cas où il est justifié de ne pas effectuer de mesures expérimentales car la pression de vapeur serait DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode dynamique 1 = Thermocouple 2 = Volume tampon 3 = Jauge de pression 4 = Vide 5 = Point de mesure 6 = Élément chauffant (environ 150 W) Figure 2a >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, selon la méthode statique (en utilisant un manomètre à tube en U) 1 = Substance à tester 6 = Bain thermostaté 2 = Vapeur 7 = Dispositif de mesure 3 = Robinet à vide poussé de la température 4 = Tube en U (manomètre) 8 = Vers la pompe à vide 5 = Manomètre (auxiliaire) 9 = Ventilation Figure 2b >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode statique (en utilisant un indicateur de pression) 1 = Substance à tester 5 = Indicateur de pression 2 = Vapeur 6 = Bain thermostaté 3 = Robinet à vide poussé 7 = Dispositif de mesure de la température 4 = Jauge de pression Figure 3 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Isoténiscope (voir référence 2) 1 = Vers les systèmes de contrôle et de mesure de la pression 2 = Tube de 8 mm de diamètre extérieur 3 = Azote sec 4 = Vapeur de l'échantillon 5 = Petite pointe 6 = Échantillon liquide Figure 4 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Appareil de détermination de la courbe de pression de vapeur, suivant la méthode de la balance de pression de vapeur 1 = Substance à étudier 7 = Bouclier 2 = Vapeur avec jet de vapeur 8 = Barre pour l'enceinte de réfrigération 3 = Four d'évaporation avec canal d'alimentation rotatif 9 = Plateau de balance 3 a = Couvercle du four avec orifice 10 = Microbalance 4 = Système de chauffage du four (réfrigération) 11 = Vers l'enregistreur (réfrigération) 5 = Système de mesure de la température de l'échantillon 12 = Vers la pompe à vide poussé (réfrigération) 6 = Enceinte de réfrigération 12 = Vers la pompe à vide poussé Figure 5 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Modèle d'appareil pour l'évaporation à basse pression grâce à la méthode d'effusion, avec une cellule d'effusion d'un volume de 8 cm3 1 = Vers la pompe à vide 2 = Puits pour le thermomètre à résistance de platine ou pour les systèmes de mesure et de contrôle de la température (2) 3 = Couvercle du récipient à vide 4 = Anneau 5 = Enceinte à vide en aluminium 6 = Système d'accès aux cellules à effusion 7 = Couvercle fileté 8 = Ecrou à ailettes (6) 9 = Boulon (6) 10 = Cellules à effusion en acier inoxydable 11 = Cartouches de chauffage (6) Figure 6a >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Exemple de système de débit permettant de déterminer la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz 1 = Régulateur de débit 2 = Échangeur de chaleur 3 = Vannes à pointeau 4 = Sondes d'humidité relative 5 = Colonnes de saturation 6 = Joints PTFE 7 = Débitmètre 8 = Collecteur (absorbant) 9 = Collecteur (huile) 10 = Fritté pour barbotage des gaz Figure 6b >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Modèle de système de détermination de la pression de vapeur par la méthode de saturation des gaz avec un capillaire placé après la chambre de saturation 1 = Débitmètre 6 = Chambre de saturation des gaz 2 = Manomètre 7 = Tube capillaire 3 = Enceinte thermostatée 8 = Récipient de barbotage 4 = Système de contrôle de la température du gaz porteur 9 = Débitmètre 5 = Thermomètre (pt 100) 10 = Collecteur froid Figure 7 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Exemple de dispositif expérimental pour la méthode du rotor Appareil de mesure de la pression de vapeur A. Tête de détection à rotorB. Cellule contenant l'échantillon C. Thermostat D. Ligne vers la pompe à vide (pompe turbo) E. Système de thermostatisation de la température de l'air Figure 8 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Modèle de tête de mesure à rotor 1 = Bille 2 = Extension tubulaire de 6 sous vide 3 = Aimants permanents (2) 4 = Bobines (2) de stabilisation verticale 5 = Bobines conductrices (4) 6 = Bride de connexion. A. 5. TENSION SUPERFICIELLE 1. MÉTHODE Les méthodes décrites se basent sur les lignes directrices de l'OCDE (1). Leurs principes fondamentaux sont décrits dans la référence (2). 1.1. INTRODUCTION Les méthodes décrites s'appliquent à la mesure de la tension superficielle des solutions aqueuses. Avant d'effectuer ces essais, il sera bon d'avoir des informations préliminaires sur l'hydrosolubilité, la structure, les propriétés de la substance en matière d'hydrolyse et la concentration critique pour la formation de micelles. Les méthodes suivantes s'appliquent à la plupart des substances chimiques quel que soit leur degré de pureté. La mesure de la tension superficielle par la méthode du tensiomètre à anneau est limitée aux solutions aqueuses ayant une viscosité dynamique inférieure à 200 mPa s environ. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'enthalpie libre de surface par unité de surface constitue la tension superficielle. La tension surperficielle s'exprime en: N/m (en unités SI) ou mN/M (en sous-unités SI)1 N/m = 103 dynes/cm1 mN/m = 1 dyne/cm dans le système cgs qui n'est plus utilisé. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉFENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. Des substances de référence couvrant une vaste gamme de tensions superficielles sont données dans les références (1) et (3). 1.4. PRINCIPE DES MÉTHODES Les méthodes sont basées sur la mesure de la force maximale qu'il faut exercer verticalement sur un étrier ou un anneau en contact avec la surface du liquide étudié, placé dans un récipient approprié, afin de le séparer de cette surface, ou sur une plaque, dont un des bords est en contact avec la surface, afin d'assurer l'arrachement du film formé. Les substances hydrosolubles à une concentration supérieure à 1 mg/ml sont testées en solution aqueuse à une seule concentration. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Ces méthodes fournissent une plus grande précision que ce qui est probablement requis pour le contrôle de la protection de l'environnement. 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES La substance est dissoute dans de l'eau distillée à une concentration correspondant à 90 % de la saturation de l'hydrosolubilité de cette substance; si cette concentration excède 1 g/l, l'essai est effectué avec une concentration de 1 g/l. Les substances dont l'hydrosolubilité est inférieure à 1 mg/l n'ont pas besoin d'être testées. 1.6.1. Méthode de la plaque Voir ISO 304 et NF T 73-060 (Substances tensioactives - détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides). 1.6.2. Méthode de l'étrier Voir ISO 304 et NF T 73-060 (Substances tensioactives - détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides). 1.6.3. Méthode de l'anneau Voir ISO 304 et NF T 73-060 (Substances tensioactives - détermination de la tension superficielle par arrachement de films liquides). 1.6.4. Méthode de l'anneau harmonisée OCDE 1.6.4.1. Appareil Des tensiomètres commerciaux se prêtent à cette mesure. Ils comportent les éléments suivants: - un porte-échantillon mobile, - un dynamomètre, - un corps de mesure (anneau), - un récipient de mesure. 1.6.4.1.1. Porte-échantillon mobile Le porte-échantillon mobile sert de support au récipient de mesure thermostaté, qui contient le liquide à étudier. Il est monté sur le même socle que le dynamomètre. 1.6.4.1.2. Dynamomètre Le dynamomètre (voir figure) est placé au-dessus du porte-échantillon. L'erreur dans la mesure de la force ne doit pas dépasser ± 10 6 N, ce qui équivaut à une erreur limite de ± 0,1 mg dans une mesure de masse. Dans la plupart des cas, l'échelle de mesures des tensiomètres vendus dans le commerce est étalonnée en mN/m, si bien que l'on peut lire directement la tension superficielle en mN/m avec une précision de 0,1 mN/m. 1.6.4.1.3. Corps de mesure (anneau) L'anneau est habituellement constitué par un fil de platine ou de platine-iridium ayant une épaisseur de 0,4 millimètres environ et une circonférence moyenne de 60 millimètres. Cet anneau est suspendu horizontalement à l'étrier de montage qui est relié par une tige métallique au dynamomètre (voir figure). Figure >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Corps de mesure (toutes les dimensions sont exprimées en millimètres) 1.6.4.1.4. Récipient de mesure Le récipient de mesure qui contient la solution à tester doit être un récipient en verre thermostaté. Il doit être conçu de telle sorte que, au cours de la mesure, la température du liquide et de la phase gazeuse au-dessus de la surface reste constante et qu'il n'y ait pas d'évaporation. Des récipients cylindriques en verre d'un diamètre intérieur d'au moins 45 millimètres répondent à ces exigences. 1.6.4.2. Préparation de l'appareil 1.6.4.2.1. Nettoyage La verrerie doit être nettoyée avec soin. Le cas échéant, elle sera lavée au mélange sulfochromique chaud puis à l'acide phosphorique sirupeux (83 à 98 % en poids de H3PO4), rincée abondamment à l'eau courante et ensuite à l'eau bidistillée jusqu'au moment où l'on obtient une réaction neutre, et, enfin, séchée ou bien rincée avec une partie du liquide à mesurer. L'anneau sera tout d'abord rincé abondamment à l'eau pour éliminer toutes les traces de substances hydrosolubles, plongé quelques secondes dans le mélange sulfochromique, rincé à l'eau bidistillée jusqu'à ce que l'on obtienne une réaction neutre, et, enfin, rapidement séché au-dessus d'une flamme de méthanol. Note: Les traces de substances qui ne sont pas dissoutes ou détruites par l'acide chromosulfurique ou l'acide phosphorique, telles que les silicones, doivent être éliminées à l'aide d'un solvant organique approprié. 1.6.4.2.2. Étalonnage de l'appareil La validation de l'appareil consiste à vérifier le point zéro et à le régler de telle sorte que l'indication donnée par l'appareil permette une détermination fiable en mN/m. Montage: L'appareil sera mis à niveau, par exemple à l'aide d'un niveau à bulle placé sur le socle du tensiomètre, en ajustant des vis de réglage. Réglage du point zéro: Après montage de l'anneau sur l'appareil et avant son immersion dans le liquide, l'indicateur du tensiomètre doit être réglé à zéro; on vérifiera le parallélisme de l'anneau en utilisant la surface du liquide comme miroir. Étalonnage: L'étalonnahe de l'appareil peut être effectué par l'une des deux méthodes suivantes: a) à l'aide d'une masse: ce procédé utilise des cavaliers de masse connue (entre 0,1 et 1,0 g), qui sont placés successivement sur l'anneau. Le facteur d'étalonnage Öa, par lequel il y a lieu de multiplier toutes les lectures de l'instrument, sera déterminé au moyen de l'équation (1): fa = srsa(1) où: sr = mg2b (mN/m) m = masse du cavalier (g) g = accélération de la pesanteur (981 cm s 2 au niveau de la mer) b = circonférence moyenne de l'anneau (cm) óa = lecture du tensiomètre après placement du cavalier sur l'anneau (mN/m); b) à l'aide d'eau: ce procédé utilise de l'eau pure dont la tension superficielle, par exemple à 23 C, est égale à 72,3 mN/m. Il est plus rapide que l'étalonnage à l'aide de cavaliers, mais il comporte toujours le risque que la tension superficielle de l'eau soit modifiée par des traces de substance tensioactive. Le facteur d'étalonnage Öb, par lequel il faut multiplier toutes les lectures de l'appareil, sera déterminé à l'aide de l'équation ci-après (2): fb = sosg(2) où: óo = valeur donnée dans la littérature pour la tension superficielle de l'eau (mN/m) óg = valeur mesurée de la tension superficielle de l'eau (mN/m) à cette même température. 1.6.4.3. Préparation des échantillons Les solutions aqueuses de la substance à tester seront préparées compte tenu des concentrations requises. Il est impératif que la dissolution de la substance soit complète. La solution ainsi préparée doit être maintenue à une température constante (± 0,5 C). Étant donné que la tension superficielle d'une solution placée dans le récipient de mesure se modifie après un certain temps, il faut effectuer plusieurs mesures à des moments différents et tracer une courbe donnant la tension superficielle en fonction du temps. Lorsqu'il n'y a plus de modification, on a atteint un état d'équilibre. La poussière ou les vapeurs d'autres substances faussent la mesure. Le travail doit donc s'effectuer sous une cloche de protection. 1.6.5. Conditions de l'essai Les mesures doivent être effectuées à une température de 20 C environ, sans variation supérieure à ± 0,5 C. 1.6.6. Déroulement de l'essai Les solutions à mesurer seront transférées dans le récipient de mesure soigneusement nettoyé, en prenant soin d'éviter la formation de mousse; ensuite, le récipient de mesure sera placé sur le porte-échantillon qui sera élevé jusqu'à ce que l'anneau soit immergé en dessous de la surface de la solution. Le porte-échantillon est alors abaissé graduellement et uniformément (à une vitesse d'environ 0,5 cm/mn) pour retirer l'anneau de la surface du liquide et ce, jusqu'à ce que la force maximale soit atteinte. La couche du liquide accroché à l'anneau ne doit pas s'en détacher. Une fois les mesures achevées, l'anneau sera immergé à nouveau sous la surface et les mesures répétées jusqu'à ce que l'on parvienne à une tension superficielle constante. À chaque détermination, le temps écoulé depuis le transfert de la solution dans le récipient de mesure sera enregistré. Des lectures seront effectuées à la valeur maximale de la force nécessaire pour retirer l'anneau de la surface du liquide. 2. DONNÉES Pour calculer la tension superficielle, on multipliera tout d'abord la valeur lue sur l'appareil en mN/m par le facteur d'étalonnage Öa ou Öb (selon la méthode d'étalonnage utilisée). On obtiendra alors une valeur qui n'est qu'une approximation et doit ensuite être corrigée. Harkins et Jordan (4) ont établi de manière empirique des facteurs de correction pour les valeurs de tension superficielle obtenues par la méthode de l'anneau, facteurs qui dépendent des dimensions de l'anneau, de la densité du liquide et de sa tension superficielle. Étant donné le travail qu'exige la détermination du facteur de correction propre à chaque mesure à partir des tables de Harkins & Jordan, l'utilisation d'une méthode simplifiée de lecture directe de la tension superficielle corrigée à partir du tableau ci-après est autorisée pour les solutions aqueuses. (On recourera à l'interpolation pour les lectures qui se situent entre deux valeurs du tableau). >EMPLACEMENT TABLE> Ce tableau a été établi sur la base de la correction de Harkins-Jordan et correspond à celle de la norme DIN (DIN 53914) concernant l'eau et les solutions aqueuses (densité ñ = 1 g/cm3), et pour un anneau vendu dans le commerce dont les dimensions sont R = 9,55 mm (rayon moyen de l'anneau) et r = 0,185 mm (rayon du fil constituant l'anneau). Le tableau donne les valeurs corrigées des mesures de tension superficielle effectuées après un étalonnage au moyen de cavaliers ou d'eau pure. Une autre solution consiste à calculer la tension superficielle, sans étalonnage préalable, selon la formule suivante: s = 4 p Rf × F où: F = la force mesurée sur le dynamomètre au point de rupture du film R = la rayon de l'anneau f = le facteur de correction (1) 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - méthode utilisée, - le type d'eau ou de solution utilisé, - les spécifications précises de la substance étudiée (identité et impuretés), - le résultat des mesures: tension superficielle (lue) en indiquant à la fois les différentes lectures et leur moyenne arithmétique, ainsi que la valeur moyenne corrigée (compte-tenu du facteur dû au matériel et du tableau de correction), - la concentration de la solution, - la température de l'essai, - l'âge de la solution utilisée, en particulier le temps écoulé entre la préparation de la solution et sa mesure, - l'évolution de la tension superficielle en fonction du temps à partir du moment où la solution a été transférée dans le récipient de mesure, - toutes les informations et observations pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, notamment les impuretés et l'état physique de la substance. 3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Étant donné que la tension superficielle de l'eau est de 72,75 mN/m à 20 C, les substances dont la tension superficielle est inférieure à 60 mN/m, dans les conditions propres à cette méthode, doivent être considérées comme des produits tensioactifs. 4. RÉFÉFENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice 115, décision du Conseil C(81) 30 Final. (2) R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Chapter XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I. (3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511. (4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751. A.6. HYDROSOLUBILITÉ 1. MÉTHODE Les méthodes décrites sont basées sur les lignes directrices de l'OCDE (1). 1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations sur la formule développée, la pression de vapeur, la constante de dissociation et l'hydrolyse (en fonction du pH) de la substance pour réaliser cet essai. Une seule méthode ne suffit pas à couvrir toute la gamme des solubilités dans l'eau. Les deux méthodes d'essai décrites ci-après permettent de couvrir toute la gamme des solubilités, mais elles ne sont pas applicables aux substances volatiles: - la première, ci-après dénommée «méthode par élution sur colonne», s'applique aux substances essentiellement pures à faible solubilité ( 10 2 g/l) et stables dans l'eau. L'hydrosolubilité de la substance étudiée peut être considérablement affectée par la présence d'impuretés. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'hydrosolubilité d'une substance est la concentration massique de saturation de la substance dans l'eau à une température donnée. Elle s'exprime en unités de masse par volume de solution. L'unité SI est le kg/m3 (g/l peut également être utilisé). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La quantité approximative d'échantillon et le temps nécessaire pour obtenir la concentration massique de saturation doivent être déterminés par un essai préliminaire simple. 1.4.1. Méthode par élution sur colonne Cette méthode repose sur l'élution d'une substance à étudier avec de l'eau à partir d'une microcolonne remplie avec un support inerte, tel que des billes de verre ou du sable, chargé avec un excès de substance à étudier. L'hydrosolubilité est déterminée lorsque la concentration massique de l'éluant est constante. Elle est indiquée par un plateau de concentration en fonction du temps. 1.4.2. Méthode du flacon La substance (les solides doivent être pulvérisés) est dissoute dans l'eau à une température quelque peu supérieure à la température d'essai. Lorsque la saturation est atteinte, le mélange est refroidi, maintenu à la température d'essai et agité jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint. Une autre possibilité consiste à effectuer la mesure directement à la température d'essai, si un échantillonnage approprié assure que l'équilibre de saturation est atteint. Après quoi, la concentration massique de la substance dans la solution aqueuse, qui ne doit contenir aucune particule non dissoute, est déterminée suivant une méthode analytique appropriée. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ 1.5.1. Répétabilité La méthode par élution sur colonne permet d'obtenir une répétabilité 3 %/ C), on utilisera également deux autres températures, supérieure et inférieure d'au moins 10 C à la température initiale choisie. Dans ce cas, la température doit être ajustée à ± 0,1 C. La température choisie sera maintenue constante dans toutes les parties de l'appareillage où elle peut avoir une influence. 1.6.2. Essai préliminaire Dans une éprouvette graduée et bouchée de 10 ml, ajouter à 0,1 g environ d'échantillon (les substances solides doivent être réduites en poudre) des volumes croissants d'eau distillée à température ambiante, suivant la progression indiquée dans le tableau suivant: >EMPLACEMENT TABLE> Après chaque addition de la quantité d'eau indiquée, agiter vigoureusement le mélange pendant dix minutes, puis vérifier visuellement s'il contient des parties d'échantillon non dissoutes. Si, après addition de 10 ml d'eau, l'échantillon, ou des parties de celui-ci, n'est pas dissous, répéter l'expérience dans une éprouvette de 100 ml avec de plus grands volumes d'eau. Si la solubilité est faible, le temps nécessaire pour dissoudre la substance peut être considérablement plus long (24 heures au moins sont à prévoir). La solubilité approximative est indiquée dans le tableau sous le volume d'eau ajoutée dans lequel s'effectue la dissolution complète de l'échantillon. Si la substance reste, selon toute apparence, insoluble, il faut augmenter le temps au-delà de 24 heures (96 heures au maximum), ou procéder à une nouvelle dilution afin de déterminer s'il y a lieu d'utiliser la méthode par élution sur colonne ou la méthode par solubilité en flacon. 1.6.3. Méthode par élution sur colonne 1.6.3.1. Support, solvant et éluant Dans la méthode par élution sur colonne, le matériel support doit être inerte. On peut employer des billes de verre et du sable. Pour appliquer la substance à tester au support, il faut utiliser un solvant volatile approprié de qualité analytique. L'eau bidistillée dans un appareil de verre ou de quartz peut être utilisée comme éluant. Remarque: Ne pas utiliser l'eau provenant directement d'un échangeur d'ions organique. 1.6.3.2. Charge du support Peser et transférer 600 mg environ de matériel support dans un ballon à fond rond de 50 ml. Peser une quantité appropriée de substance à étudier et la dissoudre dans le solvant choisi. Une quantité déterminée de cette solution est ajoutée au support. Le solvant doit être complètement évaporé, par exemple dans un évaporateur rotatif, afin d'assurer la saturation en eau du support qui, sinon, ne se ferait pas en raison de l'effet de répartition à la surface. La charge du support peut poser des problèmes (résultats erronés) si la substance à étudier est déposée sous forme d'huile ou d'une phase cristalline différente. Le problème devrait être examiné expérimentalement et décrit en détail dans le procès-verbal. Laisser tremper le support chargé pendant au moins 2 heures dans environ 5 ml d'eau, puis transférer la solution dans la microcolonne. Une autre possibilité consiste à verser le support chargé sec dans une microcolonne préalablement remplie d'eau et à équilibrer pendant 2 heures environ. Mode opératoire: L'élution de la substance à partir du support peut s'effectuer selon deux systèmes différents: - pompe de recirculation (voir figure 1), - réservoir d'eau (voir figure 4). 1.6.3.3. Méthode de colonne d'élution avec pompe de recirculation Appareil Le schéma d'un système couramment utilisé est indiqué sur la figure 1. La figure 2 montre une microcolonne appropriée, bien que toute autre dimension soit acceptable, à condition de satisfaire aux critères de reproductibilité et de sensibilité. La colonne doit avoir un volume tampon correspondant à cinq fois au moins le volume d'eau contenu dans le lit de la colonne et pouvoir contenir au moins cinq échantillons. On peut cependant réduire la dimension si l'on utilise un appoint de solvant pour remplacer les cinq volumes précités, éliminés avec les impuretés. La colonne doit être reliée à une pompe de recirculation, capable de donner un débit approximatif de 25 ml/heure environ, au moyen de raccords en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et/ou en verre. La colonne et la pompe, lorsqu'elles sont couplées, doivent pouvoir permettre l'échantillonnage de l'effluent et l'équilibrage à pression atmosphérique du réservoir. Le matériau dans la colonne est soutenu par un petit tampon de laine de verre (5 mm), qui sert également à filtrer les particules. La pompe de recirculation peut être, par exemple, une pompe péristaltique ou une pompe à membrane (veiller à ce que la matière du tube ne cause aucune contamination et/ou adsorption). Mesure: La circulation dans la colonne est amorcée. Le débit recommandé est d'environ 25 ml/h (ce qui correspond à dix volumes de lit par heure pour la colonne décrite ici). Les cinq premiers volumes (minimum) sont écartés afin d'éliminer les impuretés solubles dans l'eau. Après quoi, faire fonctionner la pompe de recirculation jusqu'à atteindre l'état d'équilibre défini par cinq échantillons successifs dont les concentrations ne diffèrent pas de façon aléatoire de plus de ± 30 %. Ces échantillons doivent être séparés l'un de l'autre par un intervalle de temps correspondant au passage d'un volume d'éluant équivalent à dix fois au moins le volume du lit de la colonne. 1.6.3.4. Méthode par élution sur colonne avec réservoir tampon Appareillage (voir figures 3 et 4) Réservoir: le raccordement au réservoir est assuré par un joint de verre rodé, lui-même raccordé à un tube en polytétrafluoroéthylène. Débit recommandé: environ 25 ml/h. Les fractions successives de l'éluant seront recueillies et analysées suivant la méthode choisie. Mesure: Les fractions provenant du milieu de l'intervalle d'élution où les concentrations sont constantes (± 30 %) dans au moins cinq fractions consécutives seront utilisées pour déterminer l'hydrosolubilité. Dans les deux cas (pompe de recirculation ou réservoir d'eau) on répétera l'opération en réduisant le débit de moitié. Si les résultats des deux opérations concordent, l'essai est satisfaisant; si l'on constate une solubilité apparemment plus élevée au débit inférieur, on réduira une nouvelle fois celui-ci de moitié jusqu'à ce que deux opérations successives donnent la même solubilité. Dans les deux cas (pompe de recirculation ou réservoir d'eau), rechercher dans les fractions la présence éventuelle de matière collo¨ udale par détection de l'effet Tyndall (diffusion de la lumière). La présence de telles particules fausse les résultats et l'essai doit être répété en améliorant l'action de filtration de la colonne. Noter le pH de chaque échantillon. Effectuer une deuxième opération à la même température. 1.6.4. Méthode par solubilité en flacon 1.6.4.1. Appareil Cette méthode requiert le matériel suivant: - verrerie et instrumentation normale de laboratoire, - dispositif approprié pour agiter les solutions à des températures constantes contrôlées, - si nécessaire en présence d'émulsions, centrifugeuse (de préférence thermostatée), - équipement pour la détermination analytique. 1.6.4.2. Mesure Évaluer, à partir de l'essai préliminaire, la quantité de produit nécessaire pour saturer le volume d'eau choisi. Celui-ci dépend de la méthode analytique et de l'intervalle de solubilité. Peser environ cinq fois la quantité de matière déterminée ci-avant et l'introduire dans trois récipients en verre pourvus d'un bouchon, également en verre (par exemple, flacons ou tubes à centrifuge). Ajouter le volume d'eau choisi dans chaque récipient, que l'on bouchera hermétiquement. Agiter ces récipients bouchés à 30 C (utiliser un dispositif agitateur ou mélangeur susceptible d'opérer à température constante, par exemple, un agitateur magnétique en bain-marie contrôlé par thermostat). Après une journée, retirer l'un des récipients et rééquilibrer pendant 24 heures à température d'essai; agiter de temps à autre. Le contenu du récipient est ensuite centrifugé à température d'essai et la concentration du composé dans la phase aqueuse limpide est déterminée selon une méthode analytique appropriée. Les deux autres ballons sont traités de la même façon après un premier équilibrage à 30 C pendant deux et trois jours respectivement. Si les concentrations des deux derniers récipients au moins concordent avec la reproductibilité requise, l'essai est satisfaisant. Répéter l'ensemble de l'essai en utilisant des temps d'équilibrage plus longs si les résultats des récipients 1, 2 et 3 accusent une tendance à la progression. La mesure peut également être effectuée sans préincubation à 30 C. Pour estimer la vitesse à laquelle s'établit l'équilibre de saturation, prélever des échantillons jusqu'à ce que le temps d'agitation n'ait plus d'effet sur la concentration de la solution à étudier. Le pH de chaque échantillon doit être noté. 1.6.5. Analyse Une méthode d'analyse spécifique de la substance est préférable pour ces déterminations, de petites quantités d'impuretés solubles pouvant entraîner des erreurs sensibles dans la solubilité mesurée. Exemples de méthodes: chromatographie en phase gazeuse ou liquide, méthodes titrimétriques, méthodes photométriques, méthodes voltamétriques. 2. DONNÉES 2.1. MÉTHODE PAR ÉLUTION SUR COLONNE La valeur moyenne déterminée sur au moins cinq échantillons consécutifs prélevés durant le plateau de saturation doit être calculée pour chaque opération, de même que la déviation standard. Les résultats doivent être exprimés en unités de masse par volume de solution. La comparaison des moyennes calculées sur deux essais effectués avec des débits différents doit donner une répétabilité inférieure à 30 %. 2.2. MÉTHODE DU FLACON Les résultats individuels doivent être indiqués pour chacun des trois flacons; on fera la moyenne, exprimée en unités de masse par volume de solution, des résultats considérés comme constants (répétabilité inférieure à 15 %). Cette opération peut exiger de convertir des unités de masse en unités de volume, en utilisant la densité lorsque la solubilité est très élevée (> 100 grammes par litre). 3. RÉSULTATS 3.1. MÉTHODE PAR ÉLUTION SUR COLONNE Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - résultats de l'essai préliminaire, - spécification précise de la substance (identité et impuretés), - concentrations individuelles, débits et pH de chaque échantillon, - moyenne et déviation standard d'au moins cinq échantillons provenant du plateau de saturation pour chaque opération, - moyenne de deux opérations acceptables consécutives, - température de l'eau pendant le processus de saturation, - méthode d'analyse utilisée, - nature du matériel employé comme support, - charge du support, - solvant utilisé, - signe d'instabilité chimique éventuelle de la substance pendant l'essai et la méthode utilisée, - toute information pertinente pour l'interprétation des résultats, notamment les impuretés et l'état physique de la substance. 3.2. MÉTHODE DU FLACON Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - résultats de l'essai préliminaire, - spécification précise de la substance (identité et impuretés), - résultats analytiques individuels et moyenne lorsque plus d'une valeur est déterminée pour un même flacon, - pH de chaque échantillon, - moyenne des valeurs pour les différents flacons en concordance, - température d'essai, - méthode analytique utilisée, - signe d'instabilité chimique éventuelle de la substance pendant l'essai et la méthode utilisée, - toute donnée pertinente pour l'interprétation des résultats, notamment les impuretés et l'état physique de la substance. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 105, Décision du Conseil C(81) 30 final. (2) NF T 20-045 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la solubilité dans l'eau des solides et liquides à faible solubilité - Méthode de l'élution sur colonne. (3) NF T 20-046 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la solubilité dans l'eau des solides et liquides à faible solubilité - Méthode du flacon. Annexe Figure 1 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Méthode par élution sur colonne avec pompe de recirculation Figure 2 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Microcolonne type (dimensions en millimètres) Figure 3 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Microcolonne type (dimensions en millimètres) Figure 4 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Colonne d'élution avec réservoir d'eau 1 = Réservoir d'eau (par exemple un ballon d'une contenance de 2,5 litres) 2 = Colonne (voir figure 3) 3 = Collecteur de fractions 4 = Thermostat 5 = Tuyau en téflon 6 = Bouchon rodé en verre 7 = Conduite d'eau (entre le thermostat et la colonne, diamètre intérieur de 8 millimètres approximativement) A.8. COEFFICIENT DE PARTAGE 1. MÉTHODE La méthode par «agitation en flacon» décrite est basée sur les lignes directrices de l'OCDE (1). 1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la formule développée, la constante de dissociation, l'hydrosolubilité, l'hydrolyse, la solubilité dans le n-Octanol et la tension superficielle de la substance pour exécuter cet essai. Les mesures concernant les substances ionisables ne doivent être réalisées qu'avec leur forme non ionisée (acide libre ou base libre) obtenue à l'aide d'un tampon approprié dont le pH est inférieur (acide libre) ou supérieur (base libre) au pK, au moins d'une unité pH. La présente méthode d'essai comporte deux techniques distinctes: la méthode par agitation en flacon et la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). La première est applicable lorsque la valeur de log Pow (voir définition ci-après) tombe dans l'intervalle compris entre 2 et 4, et la seconde dans l'intervalle compris entre 0 et 6. Avant d'effectuer l'une de ces techniques expérimentales, il y a lieu de procéder à une estimation préliminaire du coefficient de partage. La méthode par agitation en flacon ne s'applique qu'aux substances essentiellement pures, solubles dans l'eau et dans le n-Octanol. Elle n'est pas applicable aux substances tensioactives (pour lesquelles il convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée sur les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol). La méthode de HPLC ne s'applique pas aux acides et aux bases forts, aux complexes métalliques, aux substances tensioactives et aux substances qui réagissent avec l'éluant. Pour ces produits, il convient de fournir une valeur calculée ou une estimation fondée sur les solubilités individuelles dans l'eau et le n-Octanol. La méthode de HPLC est moins sensible à la présence d'impuretés dans le composé à tester que la méthode par agitation en flacon. Les impuretés peuvent toutefois, dans certains cas, compliquer l'interprétation des résultats en rendant incertaine l'identification des pics. Pour des mélanges qui donnent des pics non résolus, il faut noter la limite inférieure et la limite supérieure de log P. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le coefficient de partage (P) est défini comme étant le rapport des concentrations à l'équilibre (ci) d'une substance dissoute dans un système biphasique consistant en deux solvants quasiment non miscibles. Dans le cas du n-Octanol et de l'eau: Pow = cn-Octanolceau Le coefficient de partage (P) est donc le quotient de deux concentrations; il est généralement indiqué sous la forme de son logarithme, base 10 (log P). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Méthode par agitation en flacon Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles doivent servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. Méthode de HPLC Pour établir une corrélation entre les données mesurées par HPLC et le coefficient de partage d'un composé, il faut établir une courbe d'étalonnage de log P par rapport aux données chromatographiques, à l'aide de six points de référence au moins. Le choix des substances de référence appropriées est laissé à l'utilisateur. Au moins un des composés de référence doit, si possible, avoir un Pow supérieur, et un autre un Pow inférieur à celui de la substance à étudier. Pour des valeurs de log P inférieures à 4, l'étalonnage peut reposer sur les données obtenues avec la méthode par agitation en flacon. Pour des valeurs de log P supérieures à 4, l'étalonnage peut être effectué à partir de valeurs validées citées dans la littérature, si celles-ci concordent avec des valeurs calculées. Il est préférable, pour une plus grande précision, de choisir des composés de référence dont la structure est apparentée à celle de la substance à étudier. Des listes de valeurs de log P ont été établies pour un grand nombre de produits chimiques (2)(3). Si l'on ne dispose pas de données relatives au coefficient de partage de composés de structures voisines, il faut utiliser un étalonnage plus général, établi avec d'autres composés de référence. L'annexe II présente une liste de substances de référence recommandées et la valeur de leur Pow. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE 1.4.1. Méthode par agitation en flacon Pour déterminer un coefficient de partage, il faut parvenir à un équilibre entre l'ensemble des éléments constitutifs du système s'influençant mutuellement et déterminer les concentrations des substances dissoutes dans les deux phases. Une étude bibliographique sur ce sujet fait apparaître que plusieurs techniques différentes permettent de résoudre ce problème, à savoir le mélange complet de deux phases suivi de leur séparation dans le but de déterminer la concentration à l'équilibre de la substance étudiée. 1.4.2. Méthode de HPLC La HPLC est effectuée sur des colonnes analytiques remplies d'une phase solide contenant de longues chaînes d'hydrocarbures (par exemple C8, C18) liées chimiquement à de la silice, vendue dans le commerce. Les produits chimiques déposés sur une telle colonne se déplacent sur toute sa longueur à des vitesses différentes en raison de leur différence de taux de partage entre la phase mobile et la phase fixe hydrocarbonée. Les mélanges de produits chimiques sont élués par ordre d'hydrophobicité: les produits hydrosolubles sont élués les premiers et les produits liposolubles, les derniers, proportionnellement à leur coefficient de partage entre l'eau et les hydrocarbures. Ainsi peut on établir une relation entre le temps de rétention sur une telle colonne (à phase inversée) et le coefficient de partage n- Octanol/eau. Le coefficient de partage est déduit du facteur de capacité k, défini par l'expression suivante: k = tR t0t0 où tR = temps de rétention de la substance à étudier et to = temps moyen nécessaire à une molécule de solvant pour traverser la colonne (temps mort). Il n'est pas nécessaire de disposer d'une méthode analytique quantitative; il suffit de déterminer les temps d'élution. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ 1.5.1. Répétabilité Méthode par agitation en flacon Pour garantir la précision du coefficient de partage, on doit procéder à des déterminations en double, dans trois conditions d'essai différentes, la quantité de substance spécifiée ainsi que le rapport des volumes de solvant pouvant être modifiés. Les valeurs déterminées de ce coefficient, exprimées sous la forme de leurs logarithmes communs, doivent se situer dans un intervalle de ± 0,3 unité log. Méthode de HPLC Afin d'augmenter la fiabilité des mesures, on procédera à des déterminations en double. Les valeurs de log P issues de mesures individuelles doivent se situer dans un intervalle de ± 0,1 unité log. 1.5.2. Sensibilité Méthode par agitation en flacon L'intervalle de mesure de la méthode est déterminé par la limite de détection du procédé analytique. Celle-ci doit permettre de déterminer les valeurs de log Pow dans l'intervalle de 2 à 4 (cet intervalle peut occasionnellement, lorsque les conditions le permettent, être étendu à des valeurs de log Pow allant jusqu'à 5) lorsque la concentration du soluté n'excède pas 0,01 mol par litre dans l'une ou l'autre phase. Méthode de HPLC La méthode de HPLC permet d'estimer des coefficients de partage dans une gamme de valeurs de log Pow comprises entre 0 et 6. Normalement, le coefficient de partage d'un composé peut être estimé avec une précision de ± 1 unité log de la valeur obtenue avec la méthode par agitation en flacon. On peut trouver des exemples de corrélations dans la littérature (4)(5)(6)(7)(8). Une plus grande précision peut généralement être obtenue lorsque la courbe de corrélation est établie avec des composés de référence de structure voisine (9). 1.5.3. Spécificité Méthode par agitation en flacon La loi de partage de Nernst ne s'applique qu'à température, pression et pH constants pour les solutions diluées. Rigoureusement, elle ne s'applique qu'à une substance dispersée entre deux solvants purs. Les résultats peuvent être affectés par l'apparition simultanée, dans l'une ou dans les deux phases, de plusieurs solutés différents. La dissociation ou l'association de molécules dissoutes se traduit par des déviations par rapport à la loi de partage citée. Ces déviations s'expliquent par le fait que le coefficient de partage dépend dès lors de la concentration de la solution. En raison des équilibres multiples en présence, cette méthode d'essai ne doit pas être appliquée sans correction aux composés ionisables. Dans ce cas, il faut envisager de remplacer l'eau par des solutions tampons dont le pH doit être distant d'au moins une unité pH du pKa de la substance; il faut tenir compte de l'importance de ce pH pour l'environnement. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Estimation préliminaire du coefficient de partage La valeur du coefficient de partage est estimée de préférence à l'aide d'une méthode de calcul (voir annexe 1), ou bien, s'il y a lieu, à partir du rapport des valeurs de solubilité de la substance à étudier dans des solvants purs (10). 1.6.2. Méthode par agitation en flacon 1.6.2.1. Préparation n-Octanol: la détermination du coefficient de partage doit être effectuée en recourant à un réactif de qualité analytique. Eau: utiliser de l'eau distillée ou bidistillée dans un appareil de verre ou de quartz. Pour les composés ionisables, remplacer, si c'est justifié, l'eau par des solutions tampons. Note: Ne pas utiliser l'eau provenant directement d'un échangeur d'ions. 1.6.2.1.1. Présaturation des solvants Avant de déterminer un coefficient de partage, les phases du système de solvants sont saturées réciproquement par agitation à température d'essai. Pour ce faire, il est pratique d'agiter pendant vingt-quatre heures, dans un agitateur mécanique, deux grands flacons contenant du n-Octanol pur de qualité analytique ou de l'eau, avec une quantité suffisante de l'autre solvant, puis de les laisser reposer jusqu'à ce que les phases se séparent et que l'on parvienne à un état de saturation. 1.6.2.1.2. Préparation de l'essai Le volume liquide doit remplir presque complètement le récipient d'essai afin d'éviter toute perte de matière due à la volatilisation. Le rapport de volume et les quantités de substance à utiliser sont fixés comme suit: - estimation préliminaire du coefficient de partage (voir ci-avant), - quantité minimale de substance à tester requise par le procédé analytique utilisé, - limite de concentration maximale dans chaque phase de 0,01 mol par litre. Trois essais sont effectués. Pour le premier, on utilise le rapport n-Octanol/eau calculé, pour le second, ce rapport est réduit de moitié et pour le troisième, il est doublé (par exemple 1:1, 1:2, 2:1). 1.6.2.1.3. Substance à étudier Une solution de réserve est préparée dans du n-Octanol présaturé d'eau. La concentration de cette solution mère doit être déterminée avec précision avant de l'utiliser pour déterminer le coefficient de partage. Cette solution doit être stockée dans des conditions qui garantissent sa stabilité. 1.6.2.2. Conditions de l'essai La température d'essai doit être maintenue constante (± 1 C) et se situer dans l'intervalle compris entre 20 C et 25 C. 1.6.2.3. Mesure 1.6.2.3.1. Établissement de l'équilibre de partage Pour chaque série de conditions d'essai, préparer en double des récipients d'essai contenant les quantités requises, mesurées avec précision, des deux solvants ainsi que la quantité nécessaire de solution de réserve. Mesurer le volume des phases de n-Octanol. Placer les récipients d'essai dans un agitateur approprié ou les agiter à la main. Lorsqu'on utilise un tube à centrifuger, une méthode recommandée consiste à retourner rapidement le tube à 180 autour de son axe transversal de telle sorte que l'air éventuellement retenu traverse les deux phases. L'expérience a montré que cinquante rotations de ce type suffisent généralement pour établir l'équilibre de partage. Pour plus de certitude, il est recommandé d'effectuer cent rotations en cinq minutes. 1.6.2.3.2. Séparation des phases On peut, si nécessaire, centrifuger le mélange pour séparer les phases. Cette opération est effectuée à l'aide d'une centrifugeuse de laboratoire maintenue à température ambiante, ou, si l'on utilise une centrifugeuse sans contrôle de température, les tubes à centrifuger doivent être gardés à température d'essai pendant au moins une heure avant l'essai. 1.6.2.4. Analyse Pour déterminer le coefficient de partage, il est nécessaire de déterminer la concentration de la substance à étudier dans les deux phases. Pour ce faire, prélever une portion de chacune des deux phases de chaque tube pour chaque série de conditions d'essai et les analyser suivant le procédé choisi. La quantité totale de substance présente dans les deux phases doit être calculée et comparée avec la quantité de substance initialement introduite. La phase aqueuse doit être échantillonnée selon un procédé réduisant au minimum le risque d'inclusion de traces de n-Octanol : on peut utiliser à cet effet une seringue en verre à aiguille interchangeable. Tout d'abord remplir partiellement la seringue d'air, lequel est ensuite expulsé doucement, tout en insérant l'aiguille dans la couche de n-Octanol. Prélever un volume adéquat de phase aqueuse. Retirer rapidement la seringue de la solution et enlever l'aiguille. Le contenu de la seringue pourra alors être utilisé comme échantillon aqueux. La concentration doit être déterminée dans les deux phases distinctes de préférence par un procédé spécifique à la substance. Exemples de méthodes analytiques susceptibles de convenir: - méthodes photométriques, - chromatographie en phase gazeuse, - chromatographie en phase liquide haute performance. 1.6.3. Méthode HPLC 1.6.3.1. Préparation Appareil Il est nécessaire de disposer d'un chromatographe à phase liquide, muni d'une pompe à débit régulier et d'un dispositif de détection approprié. Il est recommandé d'utiliser une valve à injection portant des boucles à injection. La présence de groupes polaires dans la phase stationnaire peut entraver considérablement le fonctionnement de la colonne d'HPLC. C'est pourquoi les phases stationnaires doivent contenir un minimum de groupes polaires (11). On peut utiliser des phases inverses à microparticules ou des colonnes prêtes à l'emploi vendues dans le commerce. Une colonne de sécurité peut être placée entre le système d'injection et la colonne analytique. Phase mobile Le solvant d'élution est préparé avec du méthanol et de l'eau de qualité HPLC et dégazé avant utilisation. Il convient d'employer une élution isocratique et d'utiliser un rapport méthanol/eau contenant un minimum de 25 % d'eau. Normalement, un mélange méthanol-eau 3:1 (v/v) convient pour éluer des composés de log P 6 en moins d'une heure, à un débit de 1 milliltre/minute. Pour les composés dont le log P est élevé, il peut être nécessaire de réduire le temps d'élution et celui des composés de référence en diminuant la polarité de la phase mobile ou la longueur de la colonne. Les substances très peu solubles dans le n-Octanol ont tendance à donner des valeurs de log Pow anormalement basses avec la méthode HPLC; les pics formés par ces composés font parfois partie du front du solvant. Ce phénomène est probablement dû au fait que le processus de partage est trop lent pour atteindre l'équilibre dans un laps de temps normal pour une séparation par HPLC. Pour parvenir à une valeur fiable, il peut être utile de diminuer le débit ou le rapport méthanol/eau. Les substances à tester et les composés de référence doivent être solubles, dans la phase mobile, à des concentrations suffisantes pour permettre leur détection. On ne peut employer d'additifs avec le mélange méthanol-eau que dans des cas exceptionnels, car ils modifient les propriétés de la colonne. Les chromatogrammes avec additifs doivent obligatoirement être effectués avec une autre colonne du même type. Si le mélange méthanol-eau n'est pas approprié, on peut utiliser d'autres mélanges solvant organique-eau, par exemple éthanol-eau ou acétonitrile-eau. Le pH de l'éluant est d'une importance capitale pour les composés ionisables. Il doit se situer dans l'intervalle de pH auquel fonctionne la colonne, qui est habituellement compris entre 2 et 8. Il est recommandé de tamponner. Il faut prendre soin d'éviter la précipitation saline et la détérioration de la colonne qui se produisent avec certains mélanges phase organique/tampon. Il n'est pas recommandé d'effectuer des mesures de HPLC avec des phases stationnaires à base de silice à un pH supérieur à 8 parce qu'une phase mobile alcaline peut altérer rapidement le fonctionnement de la colonne. Solutés Les composés de référence doivent être le¹ plus purs possibles. Les composés utilisés à des fins d'essai ou d'étalonnage sont, si possible, dissous dans la phase mobile. Conditions de l'essai La température ne doit pas varier de plus de ± 2 K pendant les mesures. 1.6.3.2. Mesure Calcul du temps mort to Le temps mort to peut être déterminé en utilisant soit une série d'homologues (par exemple n-alkyl-méthyl-cétones) soit des composés organiques non retenus (par exemple thiourée ou formamide). Pour calculer le temps mort (to) à l'aide d'une série homologue, il faut injecter un jeu d'au moins 7 membres d'une série homologue et déterminer leurs temps de rétention respectifs. Les temps de rétention bruts tr(nc + 1) sont tracés en fonction de tr(nc). L'intersection a et la pente b de l'équation de régression: tr(nc + 1) = a + b tr(nc) sont déterminés (nc = nombre d'atomes de carbone). Le temps mort est défini par l'équation suivante: t0 = a / (1b) Courbe d'étalonnage L'étape suivante consiste à construire une courbe de corrélation entre log k et log P pour des composés de référence appropriés. En pratique, il s'agit d'injecter simultanément un jeu de cinq à dix composés de référence standard dont le log P est proche de la gamme prévue et de déterminer les temps de rétention, de préférence sur un intégrateur enregistreur lié au système de détection. Les logarithmes des facteurs de capacité, log k, correspondants sont calculés et tracés en fonction du log P déterminé avec la méthode par agitation en flacon. L'étalonnage est effectué à intervalles réguliers, au moins une fois par jour, afin de pouvoir tenir compte de changements éventuels du fonctionnement de la colonne. Détermination du facteur de capacité de la substance à tester Injecter la substance à tester dans une quantité aussi petite que possible de phase mobile. Déterminer (en double) le temps de rétention qui permet de calculer le facteur de capacité k. Le coefficient de partage de la substance à tester peut être déduit par interpolation à partir de la courbe de corrélation des produits de référence. Une extrapolation s'impose pour les coefficients de partage très faibles ou très élevés. Il faut alors accorder une attention particulière aux limites de confiance de la courbe de régression. 2. DONNÉES Méthode par agitation en flacon La fiabilité des valeurs de P ainsi déterminées peut être vérifiée en procédant à une comparaison de la moyenne des déterminations effectuées en double avec la moyenne générale. 3. RESULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés) et, s'il y a lieu, l'étape de purification préliminaire, - si les méthodes ne sont pas applicables (par exemple substance tensioactive), il convient de fournir une valeur calculée ou estimée à partir des solubilités individuelles dans l'eau ou le n-Octanol, - toutes les informations et remarques pertinentes pour l'interprétation des résultats doivent être signalées, en particulier les impuretés et l'état physique de la substance. Pour la méthode par agitation en flacon: - les résultats de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu, - la température à laquelle est effectuée la détermination, - les données relatives aux procédés analytiques utilisés pour déterminer les concentrations, - le temps et la vitesse de centrifugation, s'il y a lieu, - les concentrations mesurées dans les deux phases pour chaque détermination (cela signifie qu'un total de douze concentrations doit être consigné), - le poids de la substance à étudier, le volume de chaque phase utilisée dans chaque récipient à essai et la quantité totale calculée de substance à étudier présente dans chaque phase une fois l'équilibre atteint, - les valeurs calculées du coefficient de partage (P) et la moyenne doivent être mentionnées pour chaque série de conditions d'essai ainsi que la moyenne de l'ensemble des déterminations. Toute indication de dépendance du coefficient de partage vis-à-vis de la concentration doit être mentionnée, - la déviation standard des valeurs individuelles de P par rapport à leur moyenne, - la moyenne P de l'ensemble des déterminations exprimée par son logarithme (base 10), - la valeur théorique calculée de Pow, si elle a été déterminée, ou si la valeur mesurée est >104, - le pH de l'eau utilisée et de la phase aqueuse pendant l'expérience, - si l'eau est remplacée par un tampon, justifier son utilisation, et donner sa composition sa concentration et son pH ainsi que le pH de la phase aqueuse avant et après l'expérience. Pour la méthode par HPLC: - le résultat de l'estimation préliminaire, s'il y a lieu, - les substances à étudier et les substances de référence ainsi que leur degré de pureté, - la gamme de température à laquelle sont effectuées les déterminations, - le pH auquel sont effectuées les déterminations, - une description détaillée de la colonne analytique et de la colonne de sécurité ainsi que de la phase mobile et des moyens de détection, - des données relatives à la rétention et les valeurs de log P citées dans la littérature pour les composés de référence utilisés pour l'étalonnage, - une description détaillée de la ligne de régression ajustée (log k en fonction de log P), - des données relatives à la rétention moyenne et à la valeur interpolée de log P pour le composé à étudier, - une description du matériel et des conditions expérimentales, - les profils d'élution, - les quantités de produit à étudier et de substances de référence introduites dans la colonne; - le temps mort et la méthode utilisée pour le calculer. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 107, Décision du Conseil C(81) 30 final. (2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. (3) Log P and Parameter Database, A tool for quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711. (4) L. Renberg, G. Sundström and K. Dundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683. (5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219. (6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. (7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. (8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. (9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed Mat. Res., 1981, vol. 15, 787. (10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (édité par E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. (11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479. (12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem Rev., 1971, vol. 71, 525. (13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977. (14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination du coefficient de partage - Méthode par agitation en flacon. (15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. (16) A. Leo, C.Hansch and D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525. (17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207. (18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113. (19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. (20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979. (21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984. (22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978. (23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615. Annexe Méthodes de calcul/estimation INTRODUCTION Une introduction générale aux méthodes de calcul des données et des exemples figurent dans le «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (a). Les valeurs calculées du Pow peuvent servir: - à choisir la méthode expérimentale appropriée (gamme pour la méthode par agitation du flacon: log Pow: de 2 à 4 T; gamme pour l'HPLC: log Pow: de 0 à 6), - à déterminer les conditions d'essai appropriées (par exemple, les substances de référence pour l'HPLC, le rapport de volume n-Octanol/eau pour la méthode par agitation du flacon), - de contrôle propre au laboratoire relatif aux erreurs expérimentales éventuelles, - à fournir une estimation de Pow au cas où les méthodes expérimentales ne peuvent être appliquées pour des raisons techniques. MÉTHODES D'ESTIMATION Estimation préliminaire du coefficient de partage La valeur du coefficient de partage peut être estimée à l'aide de la solubilité de la substance à tester dans les solvants purs: Pestimé = saturation cn-Octanol saturation ceau MÉTHODES DE CALCUL Principe des méthodes de calcul Toutes les méthodes de calcul reposent sur la fragmentation formelle de la molécule en sous-structures appropriées pour lesquelles on dispose de données précises concernant le log Pow. Le log Pow de la molécule entière est alors calculé en ajoutant la somme des valeurs des fragments correspondantes et la somme des termes de correction pour les interactions moléculaires. Il existe des listes de constantes de fragments et de termes de correction (b)(c)(d)(e) dont certaines sont régulièrement mises à jour (b). Critères de qualité En général, la fiabilité de la méthode de calcul est inversement proportionnelle à la complexité du composé étudié. Dans le cas de molécules simples, dont le poids moléculaire est faible et qui contiennent un ou deux groupes fonctionnels, on peut prévoir une déviation de 0,1 à 0,3 unité de log P entre les résultats obtenus à l'aide de différentes méthodes de fragmentation et la valeur mesurée. La marge d'erreur peut être plus importante dans le cas de molécules plus complexes. Cette marge d'erreur dépend de l'existence des constantes de fragments et de leur fiabilité ainsi que de la possibilité d'identifier les interactions intramoléculaires (par exemple les liaisons hydrogènes) et de l'utilisation correcte des termes de correction (ce qui ne pose aucune difficulté avec un logiciel informatique CLOGP-3) (b). Dans le cas des composés ionisables, il est important de prendre en considération la charge ou le degré d'ionisation. Calcul Méthode ð de Hansch La constante du substituant hydrophobe d'origine, ð , établie par Fujita et al. (f) est définie comme suit: px = log Pow (PhX)log Pow (PhH) où Pow (PhX) est le coefficient de partage d'un dérivé aromatique et Pow (PhH), celui du composé parent; (par exemple pCl= log Pow (C6H5Cl)log Pow (C6H6)= 2,84 2,13 = 0,71). Conformément à sa définition la méthode ð s'applique surtout à la substitution aromatique. Les valeurs de ð d'un grand nombre de substituants ont été rassemblées (b)(c)(d). Elles sont utilisées pour calculer le log P de molécules aromatiques ou de sousstructures. Méthode de Rekker Selon Rekker (g), la valeur de log Pow est calculée de la manière suivante: log Pow = Siai fi + Sj où fi représente les constantes des divers fragments moléculaires et ai leur fréquence dans la molécule à l'étude. Les termes de corrections peuvent être exprimés sous la forme du multiple entier d'une constante unique Cm (appelée «constante magique»). Les constantes de fragments fi et Cm ont été déterminées à partir d'une liste de 1 054 valeurs de Pow obtenues expérimentalement (825 composés) à l'aide d'une analyse de régression multiple (c)(h). La détermination des termes d'interaction est effectuée conformément aux règles établies décrites dans la littérature (e)(h)(i). Méthode de Hansch-Leo Selon Hansch et Leo (c), la valeur de log Pow est calculée à l'aide de l'équation suivante: log Pow = Siai fi + Sj bj Fj où fi représente les constantes des divers fragments moléculaires, Fj les termes de correction et ai et bj les fréquences correspondantes. Une liste de valeurs de fragments (atomes ou groupes) a été déterminée par essai et erreur à partir de valeurs expérimentales de Pow, ainsi qu'une liste de termes de correction Fj (appelés «facteurs»). Les termes de correction ont été classés en plusieurs classes (a)(c). Il est relativement long et compliqué de tenir compte de toutes les règles et de tous les termes de correction mais des logiciels ont été mis au point (b). Méthode mixte Le calcul de log Pow pour des molécules complexes peut être considérablement amélioré si l'on découpe la molécule en infrastructures de plus grande dimension, pour lesquelles on dispose de valeurs de log Pow fiables, provenant soit de tableaux (b)(c) soit de mesures. De tels fragments (par exemple des hétérocycles, anthraquinone, azobenzène) peuvent être associés avec les valeurs de ð définies selon Hansch ou avec les constantes de fragments définies par Rekker ou par Leo. Observations i) Les méthodes de calcul ne s'appliquent qu'à des composés partiellement ou totalement ionisés lorsqu'il est possible de tenir compte des facteurs de correction nécessaires. ii) Si les liaisons hydrogène intramoléculaires peuvent être déterminées, les termes de correction correspondants (de + 0,6 à + 1,0 unité log P) doivent être ajoutés (a). Les modèles stériques ou les données spectroscopiques relatives à la molécule peuvent indiquer la présence de telles liaisons. iii) Si plusieurs formes tautomériques sont possibles, les calculs doivent être basés sur la forme la plus probable. iv) Les révisions des listes de constantes de fragments doivent être soigneusement suivies. Procès-verbal Lors de l'utilisation de méthodes de calcul/estimation. Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - description de la substance (mélange, impuretés, etc.), - indication concernant toute liaison hydrogène intramoléculaire possible, charge, ou tout effet inhabituel (par exemple tautomérisme), - description de la méthode de calcul, - identification ou base de données, - particularités du choix des fragments, - documentation détaillée du calcul. RÉFÉRENCES (a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983. (b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). (c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. (d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. (e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim Ther., 1979, vol. 14, 479. (f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175 (g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977. (h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. (i) R.A. Scherrer, ACS - American Chemical Society, Washington, D.C. 1984, Symposium Series 255, p. 225. Annexe II >EMPLACEMENT TABLE> A.9. POINT D'ÉCLAIR 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Pour réaliser cet essai, il est utile de disposer d'informations préliminaires sur l'inflammabilité de la substance. Le mode opératoire est applicable aux substances liquides dont les vapeurs peuvent être enflammées par des sources d'inflammation. Les méthodes d'essai énumérées dans le présent document ne sont valables que pour les intervalles de point d'éclair spécifiés dans les méthodes individuelles. Il convient de tenir compte dans le choix de la méthode des réactions chimiques éventuelles entre la substance et le support de l'échantillon. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le point d'éclair est la température la plus basse, corrigée pour une pression de 101,325 kPa, à laquelle le liquide d'essai dégage des vapeurs, dans les conditions définies dans la méthode d'essai, en quantité telle qu'il en résulte dans le récipient d'essai un mélange vapeur/air inflammable. Unités: Ct = T273,15(t est exprimé en C et T en K) 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'employer des substances de référence dans tous les cas où l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance est placée dans un récipient d'essai que l'on chauffe ou que l'on refroidit à la température d'essai, suivant le mode opératoire décrit dans la méthode d'essai individuel. Des essais d'inflammation doivent être effectués afin de s'assurer que la substance dégage ou non des vapeurs inflammables à la température d'essai. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ 1.5.1. Répétabilité La répétabilité dépend de l'intervalle de point d'éclair et de la méthode d'essai utilisée; maximum 2 C. 1.5.2. Sensibilité La sensibilité dépend de la méthode d'essai utilisée. 1.5.3. Spécificité La spécificité de certaines méthodes d'essai est limitée à certains intervalles de point d'éclair et dépend de données relatives à la substance (par exemple haute viscosité). 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparation Un échantillon de la substance à tester est placé dans un appareil d'essai conforme aux points 1.6.3.1 ou 1.6.3.2. Par mesure de sécurité, il est conseillé d'utiliser pour les substances énergétiques ou toxiques, une méthode n'exigeant qu'un échantillon de petite taille (2 cm3 environ). 1.6.2. Conditions d'essai L'appareil doit, dans la limite des règles de sécurité, être placé à l'abri des courants d'air. 1.6.3. Mode opératoire 1.6.3.1. Méthode de l'équilibre Voir normes ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679. 1.6.3.2. Méthode du non-équilibre Appareil d'Abel: Voir normes BS 2000 partie 170, NF M07-011, NF T66-009. Appareil d'Abel-Pensky: Voir normes EN 57, DIN 51755 partie 1 (pour des températures de 5 à 65 C), DIN 51755 partie 2 (pour des températures inférieures à 5 C), NF M07-036. Appareil Tag: Voir norme ASTM D 56. Appareil de Pensky-Martens: Voir normes ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019. Observations: Lorsque le point d'éclair, déterminé par une méthode basée sur le non-équilibre (point 1.6.3.2.), a une valeur de 0 ± 2 C, 21 ± 2 C ou 55 ± 2 C, il importe de confirmer cette valeur par une méthode basée sur l'équilibre en utilisant le même appareil. Seules les méthodes susceptibles de donner la température du point d'éclair peuvent être utilisées pour une notification. Pour déterminer le point d'éclair des liquides visqueux (peintures, gommes et substances similaires) contenant des solvants, il ne faut utiliser que des appareils et des méthodes d'essai permettant de déterminer le point d'éclair des liquides visqueux. Voir normes ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partie 1. 2. DONNÉES 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés), - la méthode utilisée ainsi que toute variante éventuelle, - les résultats et toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats. 4. RÉFÉRENCES Aucune. A.10. INFLAMMABILITÉ (SOLIDES) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Avant de procéder à cet essai, il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les propriétés explosives potentielles de la substance. Cet essai ne doit être appliqué qu'aux substances poudreuses, granuleuses ou pâteuses. De façon à ne pas englober toutes les substances susceptibles d'être enflammées, mais uniquement celles qui brûlent rapidement ou celles dont la combustion est particulièrement dangereuse d'une façon ou d'une autre, ne sont considérées comme très inflammables que les substances dont la vitesse de combustion dépasse une certaine limite. La propagation de l'incandescence dans une poudre métallique peut être particulièrement dangereuse en raison des difficultés que présente l'extinction du feu. Les poudres métalliques sont considérées comme très inflammables si l'incandescence se propage dans tout l'échantillon en un temps déterminé. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le temps de combustion est exprimé en secondes. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Non spécifiées. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance est disposée de manière à former une bande ininterrompue ou une traînée de poudre d'environ 250 mm de longueur. Un essai préliminaire est effectué afin de déterminer si, par allumage à la flamme d'un brûleur à gaz, il se produit une propagation de la combustion avec ou sans flamme. Si la combustion se propage sur une distance de plus de 200 mm en un temps déterminé, un essai complet est effectué pour déterminer la vitesse de combustion. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non établis. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Essai préliminaire La substance est disposée en bande ininterrompue ou en traînée de poudre d'environ 250 mm de longueur par 20 mm de largeur et 10 mm de hauteur sur une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice. La flamme chaude d'un brûleur à gaz (diamètre minimum 5 mm) est appliquée à l'une des extrémités de la traînée de poudre jusqu'à ce que celle-ci s'enflamme, ou pendant un maximum de 2 minutes (5 minutes pour les poudres métalliques ou d'alliages métalliques). Noter si la combustion se propage le long de la traînée sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 4 minutes (40 minutes pour les poudres métalliques). Si la substance ne s'enflamme pas et ne propage pas la combustion, avec ou sans flamme, sur une distance de 200 mm pendant une durée d'essai de 4 minutes (ou 40 minutes), la substance n'est pas considérée comme très inflammable, et il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si la combustion de la substance se propage sur une distance de 200 mm sur la traînée de poudre en moins de 4 minutes (ou de 40 minutes pour les poudres métalliques), le mode opératoire décrit ci-dessous (au points 1.6.2 et suivants) doit être suivi. 1.6.2. Essai de vitesse de combustion. 1.6.2.1. Préparation Les substances poudreuses ou granuleuses sont versées en vrac dans un moule de 250 mm de longueur et de section transversale triangulaire dont la hauteur et la largeur intérieure sont respectivement de 10 et 20 millimètres. Disposer de part et d'autre du moule, dans le sens de la longueur, deux plaques métalliques destinées à jouer le rôle de supports latéraux. Ces plaques dépassent de 2 mm le bord supérieur de la section triangulaire transversale (voir figure). Ensuite, laisser tomber trois fois le moule d'une hauteur de 2 cm sur une surface dure. Rajouter de la substance s'il y a lieu. Enlever ensuite les plaques latérales et racler le trop-plein. Placer une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice sur le moule, retourner l'ensemble et démouler. Les substances pâteuses sont étalées sur une plaque non combustible, non poreuse et peu thermoconductrice sous la forme d'un cordon de 250 mm de longueur et d'environ 1 cm2 de section transversale. 1.6.2.2. Conditions d'essai Dans le cas de substances sensibles à l'humidité, effectuer l'essai le plus vite possible après avoir retiré la substance de son récipient. 1.6.2.3. Mode opératoire Disposer le tas dans une hotte, perpendiculairement au sens du courant d'air. La vitesse de l'air doit suffire à empêcher la fumée de se répandre dans le laboratoire et ne doit pas être modifiée au cours de l'essai. Le flux d'air doit former un écran qui entoure l'appareil. L'une des extrémités du tas est enflammée à l'aide de la flamme chaude d'un brûleur à gaz (diamètre minimal 5 mm). Lorsque le tas a brûlé sur une distance de 80 mm, mesurer la vitesse de combustion sur les 100 mm suivants. Répéter l'essai six fois, en utilisant chaque fois une plaque propre et froide, à moins d'observer un résultat positif avant. 2. DONNÉES Le temps de combustion observé lors de l'essai préliminaire (1.6.1) et le temps de combustion le plus court observé au cours de l'essai (1.6.2.3) sont pertinents pour l'évaluation. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés), - une description de la substance à essayer, son état physique, y compris son taux d'humidité, - les résultats des essais préliminaires et des essais de vitesse de combustion, si ces derniers ont été effectués, - toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats. 3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Les substances poudreuses, granuleuses ou pâteuses doivent être considérées comme très inflammables lorsque le temps de combustion observé au cours de l'un des essais effectués conformément au mode opératoire décrit au point 1.6.2 est inférieur à 45 secondes. Les poudres métalliques ou d'alliages métalliques doivent être considérées comme très inflammables lorsqu'elles peuvent être enflammées et que la flamme ou la zone de réaction s'étend à tout l'échantillon en 10 minutes ou moins. 4. RÉFÉRENCES (1) NF T 20-042 (Septembre 85). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de l'inflammabilité des solides. Annexe Figure >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Moule et accessoires nécessaires à la confection des tas (toutes les dimensions sont exprimées en millimètres) A.11. INFLAMMABILITÉ (GAZ) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION La présente méthode permet de déterminer si des gaz mélangés à l'air à température ambiante (20 C environ) et à la pression atmosphérique sont inflammables et, s'ils le sont, dans quel intervalle de concentration. Des mélanges contenant des concentrations croissantes du gaz à tester dans de l'air sont exposés à une étincelle électrique et on observe si l'inflammation se produit. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'intervalle d'inflammabilité est l'intervalle de concentration entre les limites d'explosion supérieure et inférieure. Les limites d'explosion supérieure et inférieure sont les concentrations dans l'air du gaz inflammable auxquelles l'inflammation ne se propage pas. 1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Non spécifiée. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La concentration du gaz dans l'air est augmentée graduellement et le mélange est exposé à une étincelle électrique à chaque étape. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non fixés. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Appareil Le récipient d'essai est un cylindre en verre d'un diamètre intérieur de 50 mm au moins et d'une hauteur de 300 mm au moins, disposé verticalement. Les électrodes d'inflammation sont distantes l'une de l'autre de 3 à 5 mm et placées à 60 mm du fond du cylindre. Le cylindre est équipé d'une soupape. L'appareil doit être protégé par un blindage pour limiter les dégâts d'une explosion éventuelle. La source d'inflammation est une étincelle inductive entretenue d'une durée de 0,5 seconde, produite par un transformateur à haute tension avec une tension de sortie de 10 à 15 kV (la puissance maximale est de 300 W). Un modèle d'appareil approprié est décrit dans la référence (2). 1.6.2. Conditions d'essai L'essai doit avoir lieu à température ambiante (20 C environ). 1.6.3. Mode opératoire Remplir le cylindre en verre d'un mélange air-gaz de concentration connue à l'aide de pompes doseuses. Faire jaillir une étincelle au travers de ce mélange et observer si une flamme se détache de la source d'inflammation et se propage de manière indépendante. La concentration du gaz est modifiée par étapes de 1 % en volume jusqu'à ce que l'inflammation décrite ci-dessus se produise. Si la structure chimique du gaz laisse supposer qu'il doit être ininflammable et s'il est possible de calculer la composition du mélange stoechiométrique avec l'air, ne soumettre à essai, par étapes de 1 %, que des mélanges dans une gamme comprise entre 10 % de moins que la composition stoechiométrique et 10 % de plus. 2. DONNÉES La propagation de la flamme constitue la seule donnée d'information valable pour la détermination de cette propriété. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés), - une description, incluant les dimensions, de l'appareil utilisé, - la température à laquelle l'essai a été réalisé, - les concentrations d'essai ainsi que les résultats obtenus, - le résultat de l'essai: gaz ininflammable ou très inflammable, - lorsque l'on conclut à l'ininflammabilité, il convient de préciser l'intervalle de concentration sur lequel a porté l'essai, par étapes de 1 %. - toute information et observation pertinente pour l'interprétation des résultats. 4. RÉFÉRENCES (1) NF T 20-041 (Septembre 85). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de l'inflammabilité des gaz. (2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, 126-127. A.12. INFLAMMABILITÉ (AU CONTACT DE L'EAU) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cette méthode d'essai peut être utilisée pour déterminer si la réaction d'une substance avec l'eau ou l'air humide entraîne le dégagement d'une quantité dangereuse d'un gaz ou de plusieurs gaz, susceptibles d'être très inflammables. Elle peut être appliquée à la fois aux substances solides et liquides mais non aux substances qui s'enflamment spontanément au contact de l'air. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Très inflammables: substances qui, au contact de l'eau ou de l'air humide, dégagent une quantité dangereuse de gaz très inflammables à raison d'un débit minimal de 1 litre/kg par heure. 1.3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'essai de la substance comporte plusieurs phases décrites ci-après; si l'inflammation intervient à une quelconque de ces phases, il n'est pas nécessaire de poursuivre l'essai. Si on sait que la substance ne réagit pas violemment avec l'eau, procéder à la phase 4 (voir 1.3.4). 1.3.1. Phase 1 Placer la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée à 20 C et noter si le gaz s'enflamme ou non. 1.3.2. Phase 2 Placer la substance à tester sur un papier filtrant flottant sur de l'eau distillée à 20 C contenue dans une capsule et noter si le gaz qui se dégage s'enflamme ou non. Le papier-filtre ne sert qu'à maintenir la substance en place, ce qui accroît les probabilités d'inflammation. 1.3.3. Phase 3 Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un diamètre de 3 cm environ. Ajouter quelques gouttes d'eau au tas ainsi constitué et noter si le gaz qui se dégage s'enflamme ou non. 1.3.4. Phase 4 Mélanger la substance d'essai avec de l'eau distillée à 20 C et mesurer le débit du gaz pendant 7 heures, à intervalles d'une heure. Si ce débit est variable ou s'il s'accroît après 7 heures, le temps de mesure doit être prolongé jusqu'à 5 jours au maximum. L'essai peut être arrêté si le débit excède 1 l/kg par heure à un moment donné. 1.4. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Non spécifiée. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non indiqués. 1.6. DESCRIPTION DES MÉTHODES 1.6.1. Phase 1 1.6.1.1. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 C, environ). 1.6.1.2. Mode opératoire Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de la substance à tester dans un bac contenant de l'eau distillée. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse. 1.6.2. Phase 2 1.6.2.1. Appareil Papier-filtre flottant sur la surface de l'eau distillée dans un récipient approprié, par exemple une capsule de 100 mm de diamètre. 1.6.2.2. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 C, environ). 1.6.2.3. Mode opératoire Placer une petite quantité (approximativement 2 mm de diamètre) de la substance à tester au centre du papier-filtre. Noter si: i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse. 1.6.3. Phase 3 1.6.3.1. Conditions de l'essai L'essai est effectué à température ambiante (20 C, environ). 1.6.3.2. Mode opératoire Mettre la substance à tester en tas sur une hauteur de 2 cm et un diamètre de 3 cm environ en aménageant au sommet un petit cratère. Ajouter quelques gouttes d'eau dans le creux. Noter si:i) il y a dégagement de gaz, ii) le gaz s'enflamme. Si le gaz s'enflamme, il est inutile de poursuivre l'essai de la substance, celle-ci étant dès lors considérée comme substance dangereuse. 1.6.4. Phase 4 1.6.4.1. Appareil L'appareil est monté comme indiqué sur la figure. 1.6.4.2. Conditions de l'essai S'assurer que le récipient contenant la substance à tester est exempt de particules pulvérulentes (DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Appareillage A.13. PROPRIÉTÉS PYROPHORIQUES DES SOLIDES ET DES LIQUIDES 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cet essai est applicable aux substances solides et liquides, qui, en petite quantité, s'enflamment spontanément, peu de temps après être entrées en contact avec l'air à température ambiante (20 C environ). Les substances dont l'inflammation spontanée n'intervient qu'après une exposition de plusieurs heures ou de plusieurs jours à température ambiante, ou à des températures élevées, ne sont pas couvertes par cette méthode d'essai. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Les substances sont considérées comme ayant des propriétés pyrophores si elles s'enflamment ou causent la carbonisation dans les conditions décrites au point 1.6. L'auto-inflammabilité des liquides peut également exiger d'être évaluée selon la méthode A.15 (température d'inflammation spontanée des liquides et des gaz). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Non spécifiées. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance, solide ou liquide, est ajoutée à un porteur inerte et mise en contact avec l'air à température ambiante pendant une période de cinq minutes. Si les substances liquides ne s'enflamment pas, elles sont absorbées sur un papier-filtre qui est exposé à l'air, à température ambiante (20 C environ), pendant cinq minutes. Si la substance, solide ou liquide, enflamme ou carbonise un papier-filtre, elle est considérée comme pyrophorique. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Répétabilité: en raison de l'importance que revêt l'aspect «sécurité», un seul résultat positif est suffisant pour conclure que la substance est très inflammable. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Appareillage Remplir une capsule de porcelaine de 10 cm de diamètre environ de terre d'infusoires, sur une épaisseur de 5 mm environ, à température ambiante (20 C environ). Remarque: La terre d'infusoires, ou toute autre substance inerte comparable généralement disponible, sera prise comme représentative du sol sur lequel la substance pourra être accidentellement répandue. Les essais concernant les liquides qui ne s'enflamment pas au contact de l'air lorsqu'ils sont en contact avec un porteur inerte seront effectués avec un papier-filtre sec. 1.6.2. Réalisation de l'essai a) Solides pulvérulents Verser 1 ou 2 cm3 de substance pulvérulente à tester, d'une hauteur d'environ 1 m sur une surface non combustible et observer si la substance s'enflamme pendant la chute ou pendant les cinq premières minutes de tassement. L'essai est répété six fois, à moins qu'une inflammation ne survienne. b) Liquides Verser environ 5 cm3 de liquide à essayer dans une capsule de porcelaine préparée et observer si la substance s'enflamme dans les cinq minutes. S'il ne survient pas d'inflammation au cours de six essais, effectuer l'essai suivant: Déposer à l'aide d'une seringue 0,5 ml de l'échantillon à essayer sur un papier-filtre à cet usage et observer si le papier-filtre s'enflamme ou se carbonise dans les cinq minutes qui suivent le dépôt du liquide. L'essai est effectué trois fois, à moins qu'une inflammation ou une carbonisation ne survienne. 2. DONNÉES 2.1. TRAITEMENT DES RÉSULTATS L'essai peut être interrompu dès que l'un des essais donne un résultat positif. 2.2. ÉVALUATION Si la substance s'enflamme dans les cinq minutes après avoir été ajoutée à un porteur inerte et exposée à l'air, ou si un liquide carbonise ou enflamme un papier-filtre dans les cinq minutes après avoir été déposé sur ce dernier et exposé à l'air, il est considéré comme pyrophore. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés), - les résultats de l'essai, - toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats. 4. REFERENCES (1) NF T 20-039 (Septembre 85), Produits chimiques à usage industriel - Détermination de l'inflammabilité spontanée des solides et liquides. (2) Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses - Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York. A.14. DANGER D'EXPLOSION 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cette méthode permet de déterminer si une substance solide ou pâteuse présente un danger d'explosion lorsqu'elle est soumise à l'effet d'une flamme (sensibilité thermique), à un choc ou à une friction (sensibilité aux stimulations mécaniques), et si une substance liquide présente un danger d'explosion lorsqu'il est soumis à l'effet d'une flamme ou d'un choc. La méthode comprend trois parties: a) un essai de sensibilité thermique (1), b) un essai de sensibilité mécanique (choc) (1), c) un essai de sensibilité mécanique (friction) (1). La méthode fournit des données permettant d'évaluer la probabilité d'amorcer une explosion par certaines stimulations ordinaires. Elle n'a pas pour objet d'affirmer qu'une substance n'est pas susceptible d'exploser dans certaines conditions. La méthode est apte à déterminer si une substance présentera un danger d'explosion (sensibilité thermique et mécanique) dans les conditions particulières définies par la directive. Elle repose sur un certain nombre de types d'appareils qui sont largement utilisés sur le plan international (1) et qui donnent en règle générale des résultats probants. Il est cependant admis qu'elle n'a pas une valeur définitive. D'autres appareils que ceux qui sont mentionnés peuvent être utilisés, à condition qu'ils soient reconnus à l'échelle internationale et que les résultats puissent être mis en corrélation avec les résultats obtenus avec les appareils spécifiés. Il n'est pas nécessaire d'effectuer les essais lorsque les informations disponibles, d'ordre thermodynamique (par exemple: chaleur de formation, chaleur de décomposition) ou structural (absence de certains groupes réactifs (2) dans la formule développée), montrent que la substance n'est, sans aucun doute, pas susceptible de se décomposer rapidement en libérant des gaz ou de la chaleur (à savoir, que ce matériau ne présente aucun risque d'explosion). Il est inutile de réaliser un essai de sensibilité mécanique à la friction pour les liquides. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Substances explosibles: substances qui sont susceptibles d'exploser sous l'effet d'une flamme, ou qui sont sensibles au choc ou à la friction dans l'appareil spécifié (ou dont la sensibilité mécanique est supérieure à celle du 1,3-dinitrobenzène dans un autre appareil). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE 1,3-dinitrobenzène, produit technique cristallisé, tamisé (qui passe au travers d'une maille de 0,5 mm) pour la méthode d'essai par friction et par choc. Perhydro-1,3,5,-trinitro-1,3,5-triazine (RDX, hexogène, cyclonite - CAS 121-82-4), recristallisé à partir d'une solution aqueuse de cyclohexanone, tamisé mouillé au travers d'une maille de 250 ìm et retenu par une maille de 150 ìm) puis séché à 103 ± 2 C (pendant 4 heures) pour la seconde série d'essais par friction et par choc. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Des essais préliminaires sont nécessaires pour établir les conditions de sécurité devant présider à l'exécution des trois essais de sensibilité. 1.4.1. Essais de sécurité de manipulation (3) Pour des raisons de sécurité, avant d'effectuer les essais proprement dits, des échantillons très réduits (10 mg environ) de substance sont soumis à échauffement sans confinement dans la flamme d'un brûleur à gaz, à un choc dans toute forme appropriée d'appareil, et à friction en utilisant un maillet et une enclume ou tout autre type de dispositif à friction. Ces essais ont pour objectif de déterminer si la substance est sensible et explosible au point de devoir s'entourer de précautions particulières pour réaliser les essais de sensibilité prescrits, notamment les essais de sensibilité thermique, afin d'éviter tout dommage corporel pour l'expérimentateur. 1.4.2. Sensibilité thermique Cette méthode consiste à chauffer la substance dans un tube d'acier, fermé par des plaques à orifice dont le trou peut avoir différents diamètres, pour déterminer si la substance ou la préparation est susceptible d'exploser dans des conditions de température très élevée et de confinement défini. 1.4.3. Sensibilité mécanique (choc) Cette méthode consiste à soumettre la substance au choc d'une masse spécifiée tombant d'une hauteur définie. 1.4.4. Sensibilité mécanique (friction) La méthode consiste à soumettre des substances solides ou pâteuses à une friction entre des surfaces standard dans des conditions spécifiées de charge et de mouvement relatif. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Non indiqués. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Sensibilité thermique (effet d'une flamme) 1.6.1.1. Appareil L'appareil consiste en un tube d'acier non réutilisable et de son système de fermeture réutilisable (figure 1), installé dans un dispositif de chauffage et de protection. Chaque tube, d'un diamètre interne de 24 mm, d'une longueur de 75 mm et d'une épaisseur de paroi de 0,5 mm, est réalisé par un processus d'emboutissage profond à partir d'une tôle (voir appendice). Les tubes sont pourvus d'une bride de fermeture à leur extrémité ouverte afin de pouvoir les fermer par une plaque à orifice. Il s'agit d'une plaque solidement assujettie au tube par un joint fileté en deux parties (écrou et écrou borgne), résistante à la pression et munie d'un orifice central. L'écrou et l'écrou borgne sont en acier au chrome-manganèse (voir annexe) ne produisant aucune étincelle jusqu'à 800 C. Les plaques ont une épaisseur de 6 mm et sont fabriquées avec un acier résistant à la chaleur (voir annexe). L'expérimentateur dispose d'une série de plaques dont l'orifice présente différents diamètres. 1.6.1.2. Conditions de l'essai L'essai est normalement réalisé avec la substance telle qu'elle est reçue; toutefois, dans certains cas, par exemple si elle est comprimée, coulée ou condensée d'une manière quelconque, il peut être nécessaire de la désagréger avant de procéder à l'essai. Pour les solides, la masse de matériel à utiliser pour chaque essai est déterminée par une opération préliminaire à deux étapes. Placer un volume de substance de 9 cm3 dans un tube taré, puis tasser en appliquant une force de 80 N sur toute la surface de la section du tube. D'autres méthodes de remplissage doivent parfois être utilisées pour des raisons de sécurité ou lorsque l'état physique de l'échantillon peut être modifié par la compression; par exemple, si la substance est très sensible à la friction, il ne faut pas tasser. Si le matériel est compressible, en rajouter et tasser jusqu'à ce que le tube soit rempli jusqu'à 55 mm du bord. Déterminer la masse totale utilisée pour remplir le tube jusqu'à ce niveau, puis ajouter de la substance encore deux fois, en tassant à chaque fois avec une force de 80 N. Ensuite, rajouter du matériel et tasser, ou en enlever, de manière à ce que le tube soit rempli jusqu'à 15 mm du bord. Effectuer une seconde opération préliminaire en commençant avec une quantité tassée correspondant au tiers de la masse totale déterminée lors de l'opération précédente. Ajouter deux fois de la substance en tassant avec une force de 80 N et ajuster le niveau à 15 mm du bord du tube en ajoutant du matériel ou en enlevant. La quantité de produit solide déterminée lors de cette seconde opération est utilisée pour chaque essai; le remplissage est effectué en trois fois avec des quantités égales de substance comprimées afin que leur volume soit de 9 cm3, quelle que soit la force nécessaire pour y parvenir. (Cette opération peut être facilitée par l'emploi d'anneaux d'espacement.) Les liquides et les gels sont versés dans le tube jusqu'à une hauteur de 60 mm, en prenant soin d'éviter la formation de bulles d'air avec les gels. L'écrou borgne est glissé sur le tube par le bas, la plaque à orifice appropriée est insérée et l'écrou est serré après qu'a été appliqué un lubrifiant à base de bisulfite de molybdène. Il est important de vérifier qu'aucune substance n'est emprisonnée entre la bride et la plaque, ni dans les filetages. Le chauffage est assuré par du propane venant d'une bouteille industrielle, équipée d'un régulateur de pression (60 à 70 mbar), grâce à un débitmètre, et distribué régulièrement (ce que l'on vérifie en observant les flammes des brûleurs) par un collecteur à quatre brûleurs. Les brûleurs sont situés autour de la chambre d'essai, comme indiqué à la figure 1. Les quatre brûleurs consomment ensemble 3,2 litres de propane par minute, environ. Il est possible d'utiliser d'autres gaz de chauffage et d'autres brûleurs, mais la vitesse de chauffage doit correspondre à celle qui est spécifiée à la figure 3. Pour tous les appareils, la vitesse de chauffage doit être vérifiée régulièrement en utilisant des tubes remplis de phtalate de dibutyle, comme indiqué à la figure 3. 1.6.1.3. Déroulement des essais Chaque essai est poursuivi jusqu'à ce que le tube se soit fragmenté ou que le tube ait été chauffé pendant cinq minutes. Un essai aboutissant à la fragmentation du tube en trois parties, ou plus, qui peuvent parfois être reliées l'une à l'autre par d'étroites bandes de métal, comme l'illustre la figure 2, est considéré comme produisant une explosion. Un essai aboutissant à un plus petit nombre de fragments ou à une absence de fragmentation, est considéré comme ne produisant pas d'explosion. Une série de trois essais est d'abord effectuée avec une plaque dont l'orifice a un diamètre de 6,0 mm et, si aucune explosion ne se produit, une seconde série de trois essais est réalisée avec une plaque dont l'orifice a un diamètre de 2,0 mm. S'il se produit une explosion au cours de l'une des séries d'essais, aucun essai supplémentaire n'est requis. 1.6.1.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit une explosion au cours de l'une des séries d'essais mentionnées ci-avant. 1.6.2. Sensibilité mécanique (choc) 1.6.2.1. Appareil (figure 4) Le mouton de choc classique comprend essentiellement: un bloc de fonte avec une embase, une enclume, une colonne, des guides, des masses tombantes, un mécanisme de libération et un support pour l'échantillon. L'enclume d'acier (100 mm de diamètre × 70 mm de hauteur) est vissée sur un bloc d'acier (230 mm de longueur × 250 mm de largeur × 200 mm de hauteur) avec une embase coulée (450 mm de longueur × 450 mm de largeur × 60 mm de hauteur). Une colonne, qui consiste en un tube d'acier étiré sans soudure, est fixée dans un support vissé au dos du bloc d'acier. Quatre vis ancrent l'appareil dans un bloc de béton (60 × 60 × 60 cm) de telle sorte que les rails soient absolument verticaux et que la chute de la masse tombante ne soit pas entravée. L'expérimentateur dispose de masses de 5 et 10 kg, en acier trempé et dont la surface d'impact, d'un diamètre minimal de 25 mm, est en acier traité HRC 60 à 63. L'échantillon à essayer est enfermé dans une matrice de choc constituée de deux cylindres coaxiaux en acier trempé, placés l'un au dessus de l'autre dans un cylindre d'acier creux faisant office de bague de guidage. Les cylindres d'acier trempé doivent avoir un diamètre de 10 ( 0,003, 0,005) mm et une hauteur de 10 mm, des surfaces polies, des arêtes arrondies (rayon de courbure 0,5 mm) et une dureté de HRC 58 à 65. Le cylindre creux doit avoir un diamètre extérieur de 16 mm, un alésage de 10 (+0,005, +0,010) mm et une hauteur de 13 mm. La matrice de choc est placée sur une enclume intermédiaire (26 mm de diamètre et 26 mm de hauteur) en acier, centrée par une bague munie de perforations permettant aux vapeurs de s'échapper. 1.6.2.2. Conditions de l'essai L'échantillon doit avoir un volume de 40 mm3, ou un volume compatible avec l'appareil utilisé. Les substances solides doivent être essayées à l'état sec et préparées comme suit: a) les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai; b) les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagrégées et tamisées; la fraction de 0,5 à 1 mm de diamètre séparée par tamisage est utilisée pour l'essai et doit être représentative de la substance originale. Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec si c'est possible, ou, en tout cas, après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluant. Pour ce qui est des substances liquides, l'essai est réalisé avec un intervalle de 1 mm entre le cylindre d'acier du haut et celui du bas. 1.6.2.3. Déroulement des essais On effectue une série de six essais en faisant tomber une masse de 10 kg d'une hauteur de 0,40 m (40 J). S'il se produit une explosion au cours des six essais effectués à 40 J, une autre série de six essais doit être effectuée en faisant tomber une masse de 5 kg d'une hauteur de 0,15 m (7,5 J). Dans d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie selon la procédure établie (technique du «up-and-down», etc.). 1.6.2.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif si une explosion (l'inflammation ou un bruit intense équivaut à une explosion) se produit au moins une fois au cours des six essais réalisés avec l'appareil de choc indiqué ou si l'échantillon est plus sensible que le 1,3-dinitrobenzène ou le RDX lors d'un autre essai par choc. 1.6.3. Sensibilité mécanique (friction) 1.6.3.1. Appareil (figure 5) L'appareil consiste en une plaque de base en fonte sur laquelle est monté le dispositif de friction proprement dit comprenant un crayon fixe en porcelaine et une plaquette mobile en porcelaine. La plaquette est fixée dans un coulisseau se déplaçant entre deux rails. Le coulisseau est relié par une barre d'entraînement et un engrenage de transmission excentrique à un moteur électrique, de telle sorte que la plaquette se déplace une fois seulement sur une distance de 10 mm, en arrière et en avant sous le crayon. Le crayon peut être chargé, par exemple, à 120 ou 360 newtons. Les plaquettes de porcelaine plates sont en porcelaine blanche technique (rugosité de 9 à 32 ìm) et ont les dimensions suivantes: 25 mm de longueur, 25 mm de largeur et 5 mm de hauteur. Le crayon cylindrique qui est également en porcelaine blanche technique (longueur 15 mm, diamètre 10 mm), présente des extrémités sphériques rugueuses dont le rayon de courbure est de 10 mm. 1.6.3.2. Conditions de l'essai L'échantillon doit avoir un volume de 10 mm3, ou un volume compatible avec l'appareil utilisé. Les substances solides sont essayées à l'état sec et préparées comme suit: a) les substances pulvérulentes sont tamisées (maille de 0,5 mm); la fraction séparée par tamisage est entièrement utilisée pour l'essai; b) les substances comprimées, coulées ou condensées sont désagrégées et tamisées; la fraction tamisée d'un diamètre inférieur à 0,5 mm est utilisée pour l'essai. Les substances sous forme de pâte doivent être essayées à l'état sec si possible. Si la substance ne peut pas être préparée à l'état sec, la pâte (après avoir enlevé la plus grande quantité possible de diluent) est essayée sous la forme d'un film de 0,5 mm d'épaisseur, 2 mm de largeur et 10 mm de longueur préparé à l'aide d'un gabarit. 1.6.3.3. Déroulement des essais Placer le crayon de porcelaine sur l'échantillon soumis à essai et accrocher le poids. Lors de la réalisation de l'essai, les marques laissées par l'éponge sur la plaquette de porcelaine doivent être transversales par rapport à la direction du mouvement. Veiller à ce que le crayon repose sur l'échantillon, à ce que la quantité de substance essayée soit suffisante et à ce que la plaquette se déplace correctement sous le crayon. Les substances pâteuses seront appliquées sur le plateau à l'aide d'une gabarit de 0,5 mm d'épaisseur avec une rainure de 2 × 10 mm. La plaquette de porcelaine accomplit sous le crayon un mouvement de va-et-vient sur une distance de 10 mm dans chaque direction en 0,44 secondes. N'utiliser chaque partie de la surface de la plaquette et du crayon que pour un seul essai; les deux extrémités de chaque crayon serviront pour deux essais et les deux surfaces de la plaquette pour trois essais. Une série de six essais est effectuée avec une charge de 360 N. Si un résultat positif survient au cours de ces six essais, il convient d'effectuer une autre série de six essais avec une charge de 120 N. Dans d'autres appareils, l'échantillon est comparé avec la substance de référence choisie en suivant un mode opératoire établi (technique «up-and-down», etc). 1.6.3.4. Évaluation Le résultat de l'essai est considéré comme positif s'il se produit au moins une explosion (un crépitement, un bruit intense ou une inflammation sont équivalents à une explosion) au cours de l'un des essais réalisés avec l'appareil de friction indiqué ou s'il satisfait aux critères équivalents pour un autre essai de friction. 2. DONNÉES En principe, une substance est considérée comme présentant un risque d'explosion dans le sens de la directive dés qu'un résultat est positif lors des essais de sensibilité thermique, au choc ou à la friction. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - l'identité, la composition, la pureté, le contenu en humidité, etc. de la substance soumise à essai, - la forme physique de l'échantillon; préciser s'il a été désagrégé, cassé ou tamisé, - les observations relevées au cours des essais de sensibilité thermique (par exemple masse de l'échantillon, nombre de fragments etc.), - les observations relevées au cours des essais de sensibilité mécanique (par exemple formation d'une quantité considérable de fumée ou décomposition complète sans bruit intense, flammes, étincelles, crépitation etc.), - les résultats de chaque type d'essai, - si un autre appareil a été utilisé, fournir une justification scientifique ainsi que la preuve de la corrélation entre les résultats obtenus avec l'appareil spécifié et les résultats obtenus avec l'appareil utilisé, - tout commentaire utile, se référant notamment aux essais pratiqués avec des produits similaires, susceptible d'être pertinent pour une interprétation correcte des résultats, - toutes observations supplémentaires pertinentes pour l'interprétation des résultats. 3.2. INTERPRÉTATION ET ÉVALUATION DES RÉSULTATS Le rapport d'essai doit mentionner tous les résultats considérés comme erronés, anormaux, ou non représentatifs. Lorsqu'un des résultats est rejeté, fournir une explication et indiquer les résultats de tout essai substitutif ou supplémentaire. À moins de pouvoir expliquer un résultat anormal, celui-ci doit être accepté tel quel et utilisé pour classer la substance en conséquence. 4. RÉFÉRENCES (1) Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses, Épreuves et critères, 1990, Nations unies, New York (2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990. (3) Koenen, H., Ide, K.H. und Swart, K.H. Explosive Stoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42. (4) NFT 20-038 (septembre 85). Produits chimiques à usage industriel - Détermination du danger d'explosion. Annexe Exemple de spécification de matériel pour les essais de sensibilité thermique (voir norme DIN 1623) (1) Tube: Spécification de matériel N 1.0336.505 g (2) Plaque à orifice: Spécification de matériel N 1.4873 (3) Écrou et écrou borgne: Spécification de matériel N 1.3817 Figure 1 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Figure 2 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Essai de sensibilité thermique Exemples de fragmentation Figure 3 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Étalonnage de la vitesse d'échauffement pour essai de sensibilité thermique TEMPS (s) Courbe de température en fonction du temps obtenue en chauffant du phtalate de dibutyle (27 cm3) dans un tube fermé (plaque à orifice de 1,5 mm) au moyen d'un débit de propane de 3,2 litres/minute. La température est mesurée à l'aide d'un thermocouple chromel/alumel gainé d'acier inoxydable de 1 mm de diamètre, placé en position centrale, 43 mm sous le bord du tube. Entre 135 C et 285 C, la vitesse d'échauffement doit se situer entre 185 et 215 K/minute. Figure 4 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Figure 4 Fig.4c Dispositif de choc pour les substances Fig.4d Dispositif de choc pour les substances liquides sous forme de poudres ou de pâtes (1) cylindres d'acier (2) anneau de guidage pour les cylindres d'acier (3) bague de positionnement munie d'orifices (a) section verticale (b) plan (4) anneau de caoutchouc (5) substance liquide (40 mm3) (6) espace sans liquide >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Fig.4e mouton(masse de 5 kg) (1) ergot de suspension (2) marqueur de hauteur (3) sillon de positionnement (4) tête d'impact cylindrique (5) arrêt de rebond Figure 5 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> A.15. TEMPÉRATURE D'INFLAMMATION SPONTANÉE DES LIQUIDES ET DES GAZ 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Les substances explosives qui s'enflamment spontanément au contact de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai. Le mode opératoire est applicable aux gaz, aux liquides et aux vapeurs qui peuvent être enflammés par une surface chaude, en présence d'air. La température d'inflammation spontanée peut être réduite considérablement par la présence d'impuretés catalytiques, par la matière de la surface ou par une augmentation du volume du récipient d'essai. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Le degré d'inflammabilité spontanée est exprimé en termes de température d'inflammation spontanée. La température d'inflammation spontanée est la température la plus basse à laquelle s'enflamme la substance à essayer mélangée avec de l'air dans les conditions définies dans la méthode d'essai. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Les substances de références sont citées dans les normes (voir 1.6.3). Elles devraient servir en premier lieu à vérifier de temps à autre la fiabilité de la méthode et à permettre de comparer les résultats obtenus avec différentes méthodes. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La méthode permet de déterminer la température minimale de la surface interne d'une enceinte qui provoquera l'inflammation d'un gaz, d'une vapeur ou d'un liquide injecté dans l'enceinte. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ La répétabilité varie en fonction de l'intervalle de température d'inflammation spontanée et de la méthode d'essai utilisée. La sensibilité et la spécificité dépendent de la méthode d'essai utilisée. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Appareil L'appareil est décrit dans la méthode évoquée au point 1.6.3. 1.6.2. Conditions de l'essai Un échantillon de la substance à essayer est essayé selon le point 1.6.3. 1.6.3. Mode opératoire Voir normes IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037. 2. DONNÉES Noter la température d'essai, la pression atmosphérique, la quantité d'échantillon utilisée et le laps de temps qui s'écoule avant que l'inflammation se produise. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications précises de la substance (identité et impuretés), - la quantité d'échantillon utilisée, la pression atmosphérique, - l'appareil utilisé, - les résultats des mesures (température d'essai, résultats concernant l'inflammation, laps de temps correspondants), - toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats. 4. RÉFÉRENCES Aucune. A.16. TEMPÉRATURE RELATIVE D'INFLAMMATION SPONTANÉE POUR LES SOLIDES 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Les substances explosibles et les substances qui s'enflamment spontanément au contact de l'air à température ambiante ne doivent pas être soumises à cet essai. L'objectif en est de fournir des données préliminaires sur l'inflammabilité spontanée des substances solides soumises à de hautes températures. Si la chaleur engendrée, soit par une réaction de la substance avec l'oxygène, soit par décomposition exothermique, ne se dissipe pas assez rapidement dans l'environnement, l'auto-échauffement entraîne l'inflammation spontanée. L'inflammation spontanée se produit par conséquent lorsque la vitesse de production de chaleur excède la vitesse de perte de chaleur. Le procédé d'essai est utile en tant que test préliminaire de sélection des substances solides. Compte tenu de la nature complexe de l'inflammation et de la combustion des solides, la température d'inflammation spontanée déterminée selon cette méthode d'essai ne doit servir qu'à des fins de comparaison. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La température d'inflammation spontanée telle qu'elle est déterminée par cette méthode est la température ambiante minimale exprimée en degrés Celsius ( C), à laquelle un certain volume d'une substance s'enflamme spontanément dans des conditions définies. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Placer un volume défini de la substance soumise à essai dans un four à température ambiante; enregistrer la courbe température/temps au centre de l'échantillon, la température du four étant portée à 400 C, ou à la température du point de fusion si celle-ci est inférieure, à la vitesse de 0,5 C/mn. Pour les besoins de cet essai, la température du four à laquelle l'échantillon atteint une température de 400 C par auto-échauffement est appelée température d'inflammation spontanée. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Aucun. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Appareil 1.6.1.1. Four Un four de laboratoire à température programmable (d'un volume de 2 litres environ) équipé d'une circulation d'air naturel et d'un clapet d'explosion. Pour éviter tout risque potentiel d'explosion, il convient d'empêcher que les gaz de décomposition puissent entrer en contact avec les éléments de chauffage électrique. 1.6.1.2. Cube en treillis de fil métallique Couper un morceau de treillis en fil d'acier inoxydable d'une maille d'une taille de 0,045 mm, selon le modèle indiqué à la figure 1. Plier le treillis et l'attacher avec du fil métallique en forme de cube ouvert. 1.6.1.3. Thermocouples. Thermocouples appropriés. 1.6.1.4. Enregistreur Tout enregistreur à deux canaux, étalonné à l'intervalle 0 - 600 C ou à une tension correspondante. 1.6.2. Conditions de l'essai Les substances sont testées telles qu'elles sont reçues. 1.6.3. Mode opératoire Remplir le cube de la substance soumise à essai. Tasser doucement en ajoutant de la substance jusqu'à le remplir complètement. Suspendre ensuite le cube au centre du four à température ambiante. Placer un thermocouple au centre du cube et l'autre entre le cube et la paroi du four afin d'enregistrer la température du four. Les températures du four et de l'échantillon sont enregistrées en continu pendant que la température du four est portée à 400 C, ou au point de fusion si cette valeur est plus basse, à une vitesse de 0,5 C/min. Lorsque la substance s'enflamme, le thermocouple de l'échantillon indiquera une très forte montée de température par rapport à la température du four. 2. DONNÉES La température du four à laquelle la température de l'échantillon atteint 400 C par auto-échauffement est pertinente pour l'évaluation (voir figure 2). 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - une description de la substance à essayer, - les résultats des mesures incluant la courbe température/temps, - toute observation supplémentaire pertinente pour l'interprétation des résultats. 4. RÉFÉRENCES (1) NF T 20-036 (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel - Détermination de la température relative d'inflammation spontanée des solides. Figure 1 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Modèle de cube d'essai de 20 mm Figure 2 >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Courbe type température/temps A.17 PROPRIÉTÉS COMBURANTES (SOLIDES) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur les propriétés explosives éventuelles de la substance avant d'effectuer cet essai. Cet essai n'est pas applicable aux liquides, aux gaz, aux substances explosives ou très inflammables ou aux peroxydes organiques. Cet essai est inadapté quand l'examen de la structure chimique montre que la substance ne peut sans aucun doute avoir de réaction de type exothermique avec un combustible. Un essai préliminaire doit être effectué pour s'assurer que cet essai ne nécessite pas de précautions particulières. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Temps de combustion: temps de réaction, exprimé en secondes, pris par la zone de réaction pour se propager à travers un tas, selon la procédure décrite au point 1.6. Vitesse de combustion: exprimée en millimètres par seconde. Vitesse maximale de combustion: valeur la plus élevée parmi les vitesses de combustion obtenues avec des mélanges contenant 10 à 90 % en poids de comburant. 1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Le nitrate de barium (de pureté analytique) est utilisé comme substance de référence pour l'essai et l'essai préliminaire. Le mélange de référence est composé de nitrate de barium et de cellulose en poudre, préparé conformément au point 1.6 et possédant la vitesse de combustion maximale (il s'agit généralement d'un mélange contenant 60 % de nitrate de barium en poids). 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Il convient, pour des raisons de sécurité, d'effectuer un essai préliminaire. Il est inutile de continuer l'essai si l'essai préliminaire montre clairement que la substance a des propriétés oxydantes. Lorsque ce n'est pas le cas, la substance est soumise à l'essai complet. Dans l'essai complet, la substance à essayer et une substance combustible définie sont mélangées dans des proportions variables. Chacun de ces mélanges est alors disposé en tas, que l'on enflamme à une extrémité. La vitesse maximale de combustion est comparée à la vitesse maximale de combustion du mélange de référence. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Lorsqu'elle est requise, toute méthode de broyage et de mélange est valable pour autant que l'écart entre la vitesse maximale de combustion et la moyenne arithmétique, dans les six essais, ne dépasse pas 10 %. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparation 1.6.1.1. Substance à essayer L'échantillon à essayer est traité comme suit afin d'obtenir une granulométrie inférieure à 0,125 mm: tamiser la substance à essayer et broyer la fraction restante; répéter cette opération jusqu'à ce que tout l'échantillon soit passé au travers du tamis. Toutes méthodes de broyage et de tamisage respectant les critères de qualité requis peuvent être utilisées. Avant de préparer le mélange, sécher la substance à 105 C jusqu'à obtention d'un poids constant. Si la température de décomposition de la substance est inférieure à 105 C, la substance doit être séchée à une température moins élevée. 1.6.1.2. Substance combustible On utilise de la cellulose en poudre comme substance combustible. Elle doit être du type utilisé en chromatographie en couche mince ou en colonne. Un type de cellulose dont la longueur de plus de 85 % des fibres est comprise entre 0,020 mm et 0,075 mm s'est avérée adéquate. La poudre de cellulose est tamisée au moyen d'un tamis à mailles de 0,125 mm. Il faut utiliser le même lot de cellulose pour tout l'essai. Avant de préparer le mélange, sécher la poudre de cellulose à 105 C jusqu'à ce que son poids soit constant. Si de la sciure de bois est utilisée lors de l'essai préliminaire, préparer une sciure de bois tendre qui passe au travers d'un tamis d'une maille de 1,6 mm, mélanger, puis sécher à 105 C pendant 4 heures en couche de moins de 25 mm d'épaisseur. Refroidir la sciure et la conserver jusqu'à utilisation dans un récipient hermétique aussi rempli que possible. Elle sera de préférence utilisée dans les 24 heures après séchage. 1.6.1.3. Source d'allumage Utiliser la flamme d'un brûleur à gaz (diamètre: 5 mm minimum). Si une autre source d'allumage est utilisée (par exemple lorsque l'essai est effectué dans une atmosphère inerte), fournir la description et la justification. 1.6.2. Mode opératoire Note: Les mélanges de comburants avec de la cellulose ou de la sciure de bois doivent être considérés comme des explosifs potentiels et manipulés avec prudence. 1.6.2.1. Essai préliminaire La substance séchée est grossièrement mélangée à de la cellulose ou à de la sciure de bois sèche dans des proportions de 2 (substance à essayer) pour 1 (cellulose ou sciure de bois) en poids et le mélange est disposé en petit tas conique de 3,5 cm (diamètre de base) × 2,5 cm (hauteur) par remplissage sans tassement d'une forme conique (par exemple un entonnoir de laboratoire en verre dont le tube est bouché). Le tas est placé sur une plaque froide, non-combustible, non poreuse, et peu thermo-conductrice. L'essai doit être conduit dans une hotte aspirante (voir point 1.6.2.2). La source d'allumage est mise en contact avec le cône. L'intensité et la durée de la réaction sont observées et enregistrées. La substance doit être considérée comme comburante si la réaction est intense. Lorsqu'il y a doute quant au résultat, il est nécessaire de pratiquer l'essai complet décrit ci-après. 1.6.2.2. Essai complet Préparer des mélanges oxydant/cellulose contenant de 10 à 90 % de comburant, en poids, par incréments de 10 %. Pour les cas limites utiliser des mélanges comburant/cellulose intermédiaires pour déterminer la vitesse maximale de combustion avec plus de précision. On réalise un tas au moyen d'un moule métallique d'une longueur de 250 mm et dont la section triangulaire transversale a une hauteur intérieure de 10 mm et une largeur intérieure de 20 mm. Placer comme cadres latéraux des deux côtés du moule, dans le sens de la longueur, deux plaques métalliques dépassant de 2 mm le bord supérieur de la section triangulaire (figure). Remplir ce dispositif avec un excès de mélange, sans tasser. Après avoir laissé tomber le moule une fois d'une hauteur de 2 cm sur une surface dure, racler l'excès avec une raclette tenue obliquement. Enlever alors les cadres latéraux et égaliser la surface de la poudre à l'aide d'un rouleau. Disposer une plaque non-combustible non-poreuse et peu thermo-conductrice sur le moule, retourner et démouler. Disposer le tas dans une hotte perpendiculairement au sens de courant d'air. Le débit d'air doit être suffisant pour empêcher les vapeurs de se répandre dans le laboratoire et il ne doit pas subir de modification au cours de l'essai. Le courant d'air doit former un écran entourant l'appareil. Vu les propriétés hygroscopiques de la cellulose et de certaines substances à essayer, l'essai doit être effectué aussi rapidement que possible. Enflammer une extrémité du tas par contact avec la flamme. Mesurer le temps de réaction sur une distance de 200 mm après que la zone de réaction a parcouru une distance initiale de 30 mm. L'essai est effectué avec la substance de référence et au moins une fois avec chacun des mélanges de substance à essayer et de cellulose. Si l'on trouve une vitesse maximale de combustion significativement plus grande que celle de la substance de référence, l'essai peut être arrêté; autrement, les essais doivent être répétés cinq fois avec chacun des trois mélanges qui donnent les vitesses de combustion les plus élevées. Si l'on soupçonne que le résultat est un «faux positif», répéter l'essai en remplaçant la cellulose par une substance inerte dont la taille des particules est la même, comme le kieselguhr. Une autre possibilité consiste à renouveler l'essai avec le mélange substance à essayer/cellulose dont la vitesse de combustion est la plus élevée, dans une atmosphère inerte (contenu d'oxygène DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Moule et accessoires nécessaires à la confection de tas (toutes les dimensions sont en millimètres) PARTIE B: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE LA TOXICITÉ INTRODUCTION GÉNÉRALE: PARTIE B A. INTRODUCTION Voir l'introduction générale B. DÉFINITIONS i) La toxicité aiguë exprime les effets néfastes qui se manifestent pendant une période donnée (habituellement 14 jours) après l'administration d'une dose unique de substance. ii) La DL50 (dose létale médiane) est la dose unique déduite statistiquement, censée provoquer la mort de 50 % des animaux auxquels la substance a été administrée. La valeur de la DL50 est exprimée en poids de la substance étudiée rapporté à l'unité de poids corporel des animaux soumis à l'expérimentation (mg/kg). iii) La CL50 (concentration létale médiane) est la concentration d'une substance déduite statistiquement qui devrait provoquer au cours d'une exposition ou après celle-ci, pendant une période définie la mort de 50 % des animaux exposés pendant une durée déterminée. La valeur de la CL50 est exprimée en poids de substance étudiée rapportée à un volume standard d'air (milligramme par litre). iv) Le niveau d'exposition sans effet néfaste correspond à la dose ou au niveau d'exposition maximal utilisé au cours d'un essai n'ayant pas produit de signe décelable de toxicité. v) La toxicité subaigüe/subchronique inclut les effets néfastes qui apparaissent chez les animaux d'expérience lorsqu'ils reçoivent des administrations quotidiennes d'une substance ou lorsqu'ils sont exposés quotidiennement pendant une période brève en regard de leur espérance de vie. vi) La dose maximale tolérable (DMT) correspond à la dose maximale provoquant, dans l'essai où elle est utilisée, des signes d'intoxication chez les animaux sans avoir d'effets majeurs sur leur survie. vii) L'irritation cutanée correspond aux modifications cutanées réversibles de nature inflammatoire qui apparaissent après application d'une substance sur la peau. viii) L'irritation des yeux correspond aux modifications oculaires réversibles qui apparaissent après application de la substance sur la surface antérieure de l'oeil. ix) La sensibilisation cutanée (dermites allergiques de contact) est une réaction cutanée d'origine immunologique résultant du contact avec une substance. Définitions spécifiques pour la toxicité par inhalation - un aérosol est défini comme un ensemble de particules (solides et/ou liquides) dispersées dans l'air d'une manière homogène, - le diamètre aérodynamique d'une particule est le diamètre d'une sphère de densité unitaire (1 g cm 3) présentant la même vitesse finale de sédimentation que la particule en question, - le diamètre aérodynamique médian en masse (DAMM) est le diamètre aérodynamique calculé qui correspond au 50ecentile de la distribution dimensionnelle relative à la masse des particules de l'aérosol, - l'écart-type géométrique (ETG) est le rapport du 84e centile sur le 50ecentile estimés; Il indique la pente de la courbe de distribution cumulée de la taille des particules, en supposant que la distribution de taille est log normale. Définitions spécifiques de la méthode de la dose fixée pour l'étude de la toxicité aiguë par voie orale - Le terme «toxicité évidente» correspond aux effets toxiques consécutifs à l'administration de la substance d'essai, dont la sévérité est telle que l'administration d'une dose immédiatement supérieure pourrait entraîner la mort. - La «dose discriminante» est la plus forte des quatre doses fixées pouvant être administrée sans provoquer de mortalité (y compris les animaux euthanasiés). C. MUTAGÉNÈSE (y compris essai de dépistage de la cancérogénèse) L'évaluation préliminaire du potentiel mutagène d'une substance nécessite l'obtention d'informations concernant deux mécanismes, à savoir, la mutation génique et les aberrations chromosomiques. Ces deux mécanismes sont étudiés au moyen des essais suivants: i) des tests fondés sur l'apparition de mutations géniques (ponctuelles) sur des cellules procaryotes telles que Salmonella typhimurium; il est possible également d'utiliser Escherichia coli. Le choix entre ces deux organismes peut être déterminé par la nature de la substance à étudier ii) des tests fondés sur la production d'aberrations chromosomiques sur des cellules de mammifères cultivées in vitro; on peut également opérer in vivo (essai du micronoyau ou analyse des métaphases de cellules de moelle osseuse). Cependant, en l'absence de contre-indications, les méthodes in vitro sont fortement recommandées. D. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION L'extrapolation directe à l'homme des résultats obtenus par l'expérimentation animale et ceux obtenus in vitro ne peut se pratiquer que dans certaines limites; il faut en tenir compte lors de l'évaluation et de l'interprétation des essais de toxicité. Lorsqu'elles sont disponibles, les informations sur des effets nocifs rapportés chez des personnes exposées au produit, peuvent être utilisables pour déterminer les propriétés toxiques potentielles sur l'homme. E. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES La toxicologie est une science expérimentale en plein essor et il existe une littérature abondante pour chaque sujet. Des renseignements utiles figurent dans les lignes directrices de l'OCDE. Remarques complémentaires Soins à apporter aux animaux Lors des expérimentations toxicologiques, il est essentiel de procéder à des contrôles rigoureux des conditions ambiantes et d'utiliser des techniques appropriées au soin des animaux. i) conditions d'hébergement Les conditions ambiantes des locaux ou enceintes où ont lieu les expérimentations doivent être adaptées à l'espèce utilisée pour l'essai. Pour les rats, souris et cobayes, la température du local doit être de 22 ± 3 C et l'humidité relative de 30 à 70 %; pour les lapins, la température doit être de 20 ± 3 C et l'humidité relative de 30 à 70 %. Certaines techniques expérimentales sont particulièrement sensibles aux effets de la température et, dans ces cas, des indications détaillées concernant les conditions adéquates sont incluses dans la description de la méthode. Dans toutes les recherches sur les effets toxiques, la température et l'humidité doivent être contrôlées, enregistrées et consignées dans le rapport final d'étude. Lorsque l'on utilise un éclairage artificiel, il faut normalement alterner 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les données relatives au programme d'éclairage doivent être enregistrées et consignées dans le rapport final d'étude. Dans les rapports concernant les expériences sur les animaux, il est important d'indiquer le type de cage utilisé ainsi que le nombre d'animaux placés dans chaque cage, tant pendant l'exposition aux substances chimiques que pendant la période d'observation qui y fait suite. ii) Alimentation La nourriture doit répondre à toutes les exigences alimentaires de l'espèce soumise à l'expérience. Lorsque les substances sont incorporées à la nourriture des animaux, la valeur nutritionnelle de cette nourriture peut être réduite par suite d'une interaction entre la substance et un constituant de l'alimentation. La possibilité d'une telle réaction doit être considérée lors de l'interprétation des résultats de l'essai. Il faut veiller à ce que les impuretés contenues dans le régime alimentaire et connues pour influencer la toxicité ne soient pas présentes en concentration telle qu'elles puissent interférer. Protection des animaux Les méthodes d'essai ont été élaborées en accordant l'importance qui est due à la protection des animaux. Quelques exemples sont brièvement cités ci-après, mais cette liste n'est pas exhaustive. Pour en connaître les termes et/ou conditions exacts, se référer à l'énoncé des méthodes. - Une autre méthode, la «méthode des doses fixes» est introduite pour définir la toxicité orale aiguë. Dans cette méthode, ce n'est pas la mort qui sert de moyen de mesure de la toxicité. Moins d'animaux sont employés et détresse et souffrances sont moindres que dans la méthode traditionnelle de détermination de la toxicité orale aiguë. - Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum scientifiquement acceptable: cinq animaux seulement du même sexe sont testés par dose pour les méthodes B.1 et B.3; 10 animaux seulement (et 5 seulement pour le groupe témoin négatif) sont utilisés pour déterminer la sensibilisation cutanée par la méthode de maximalisation chez le cobaye (méthode B.6); le nombre d'animaux nécessaires comme témoins positifs pour étudier la mutagénicité in vivo est également réduit (méthode B.11 et B.12). - La souffrance et la détresse des animaux pendant les essais sont atténuées: les animaux présentant des signes importants et persistants de détresse et de souffrance peuvent être euthanasiés; il n'est pas nécessaire d'administrer les substances connues pour provoquer une détresse et des douleurs importantes du fait de leurs propriétés corrosives ou irritantes (méthodes B.1, B.2 et B.3). - L'introduction d'essais «limites» non seulement pour la toxicité aiguë (méthode B.1, B.2 et B.3) mais également pour la mutagénicité in vivo (méthodes B.11 et B.12) permet d'éviter la réalisation de tests à des doses inutilement élevées. - Une stratégie d'essais en vue de détermination des propriétés irritantes permet maintenant de ne pas effectuer l'essai, ou de le limiter à un seul animal lorsqu'on dispose d'éléments scientifiques suffisants. Ces informations d'ordre scientifique peuvent reposer sur les propriétés physico-chimiques de la substance, sur les résultats d'autres essais déjà réalisés, ou sur les résultats de méthodes in vitro validées. Par exemple, si la substance a été soumise à une étude de toxicité aiguë par administration cutanée à la dose de l'essai limite (méthode B.3) et qu'aucune irritation cutanée n'a été décelée, il peut être inutile d'effectuer des essais supplémentaires relatifs à l'irritation cutanée (méthode B.4); les produits qui se sont révélés corrosifs ou responsables d'une irritation grave au cours d'une étude d'irritation cutanée (méthode B.4) ne doivent pas être soumis à des essais supplémentaires d'irritation oculaire (méthode B.5). B.1 TOXICITÉ AIGUË (ORALE) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2 DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des doses croissantes de la substance à étudier sont administrées par voie orale, par gavage, à plusieurs lots d'animaux d'expérience, une seule dose étant utilisée par lot. Le choix des doses peut reposer sur les résultats d'un essai préliminaire. On observe ensuite les effets et la mortalité dus à la substance. Les animaux qui meurent pendant l'essai ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés. (Cette méthode s'applique essentiellement aux essais pratiqués sur des rongeurs.) Si des animaux montrent des signes d'inconfort et de douleurs intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai avec des substances connues pour entrainer une détresse ou des douleurs intenses du fait de leurs propriétés corrosives ou irritantes. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Si nécessaire, la substance à tester est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Il est recommandé d'utiliser en priorité une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans une huile végétale, éventuellement une solution dans d'autres véhicules, ou une suspension. En ce qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue ou être déterminée avant ou pendant l'essai. Normalement, pour les rongeurs, le volume ne doit pas dépasser 10 ml/kg de poids corporel, sauf s'il s'agit de solutions aqueuses, pour lesquelles on peut utiliser jusqu'à 20 ml/kg de poids corporel. Pour minimiser la variabilité du volume d'essai, les concentrations doivent être ajustées de façon à réaliser les administrations sous volume constant. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce préférée. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Cinq rongeurs au moins sont utilisés pour chaque dose. Ils doivent être du même sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non-gravides. Si l'on dispose d'informations indiquant qu'un sexe est nettement plus sensible, on utilisera des animaux de ce sexe. Note: Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux pour les tests de toxicité aiguë sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les doses doivent être soigneusement choisies, en multipliant les efforts visant à ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester. 1.6.2.3. Doses Les doses doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et espacées de façon à produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la DL50. 1.6.2.4. Essai «limite» Si l'on utilise des rongeurs, un essai «limite» peut être effectué en administrant une dose au moins égale à 2 000 mg/kg de poids corporel à un lot de 5 mâles et 5 femelles, en suivant le mode opératoire décrit ci-après. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut être nécessaire de réaliser une étude complète. 1.6.2.5. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre sur 14 jours au moins. Cependant sa durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des effets toxiques, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée si nécessaire. Les moments où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent ainsi que celui de la mort sont importants, surtout en cas de mortalité retardée. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la substance. Dans le cas du rat, celui-ci doit être privé de nourriture pendant la nuit qui précède l'administration de la substance; pour des animaux ayant un métabolisme plus rapide il convient d'écourter la période de jeûne; l'eau n'est pas limitée. Le lendemain, les animaux doivent être pesés et la substance à tester leur est ensuite administrée par gavage sous forme d'une dose unique. Si l'administration en une dose unique n'est pas possible, la substance peut être administrée par fractions plus petites pendant une période ne dépassant pas 24 heures. Après l'administration de la substance, les animaux peuvent encore être privés de nourriture pendant 3 à 4 heures. Si la dose a été administrée par fractions pendant un certain laps de temps, il peut être nécessaire d'alimenter et de faire boire les animaux en fonction de la durée du traitement. Une fois la substance administrée, les observations sont effectuées et consignées de façon systématique, en établissant, si possible, une fiche individuelle pour chaque animal. Les observations doivent être effectuées fréquemment le premier jour. Un examen clinique attentif doit être pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations doivent être faites quotidiennement, en agissant de façon à réduire la perte d'animaux pour l'étude, par exemple en pratiquant l'autopsie ou la conservation au froid des animaux trouvés morts ainsi qu'en isolant et en sacrifiant les animaux faibles ou moribonds. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, ainsi que des systèmes respiratoire, circulatoire et nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera apportée aux tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être noté avec autant de précision que possible. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés. Toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être notées. Si nécessaire, les tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique. Estimation de la toxicité pour l'autre sexe Après avoir mené l'étude à terme sur des animaux appartenant à un sexe, la substance est administrée à au moins un lot de 5 animaux de l'autre sexe, afin de déterminer si les animaux de ce sexe ne sont pas nettement plus sensibles à la substance à tester. L'utilisation d'un plus petit nombre d'animaux peut être justifiée dans des circonstances particulières. Si l'on dispose d'informations appropriées qui montrent que les animaux du sexe testé sont nettement plus sensibles, on peut se dispenser d'effectuer des essais sur les animaux de l'autre sexe. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres symptômes de toxicité, la description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le poids de chaque animal doit être déterminé et noté peu de temps avant l'administration de la substance à tester, puis une fois par semaine et au moment de sa mort. Les modifications de poids doivent être calculées et consignées lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause des souffrances et de l'inconfort dus à la substance sont enregistrés comme s'ils étaient morts du fait du composé étudié. La DL50 peut être déterminée par application d'une méthode reconnue. L'évaluation des données doit inclure la relation, si elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et l'apparition ainsi que la gravité de toutes les anomalies, y compris les anomalies du comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les changements de poids corporel, la mortalité et tout autre effet toxique. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai, contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions expérimentales, - doses (avec indication du véhicule le cas échéant, et de la concentration), - sexe des animaux utilisés, - tableau des résultats par sexe et par dose (à savoir, nombre d'animaux morts ou sacrifiés au cours de l'essai, nombre d'animaux présentant des symptômes d'intoxication, nombre d'animaux exposés), - moment de la mort après administration, raisons et critères justifiant l'euthanasie des animaux, - toutes les observations, - valeur de la DL50 pour le sexe soumis à l'étude complète, déterminée à 14 jours (en précisant la méthode de calcul), - intervalle de confiance de 95 % pour la DL50 (lorsque le calcul est possible), - courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la méthode de calcul le permet), - résultats d'autopsie, - résultats des examens histopathologiques, - résultats de tout essai réalisé sur l'autre sexe, - discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de l'effet que peuvent avoir sur la valeur calculée de la DL50 les animaux euthanasiés au cours de l'essai), - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.1 BIS TOXICITÉ AIGUË (ORALE) - MÉTHODE DE LA DOSE FIXÉE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale, partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant. 1.4. PRINCIPES DE LA MÉTHODE D'ESSAI L'essai de toxicité aiguë par voie orale fournit des informations sur les effets néfastes susceptibles d'apparaître peu de temps après l'ingestion d'une dose unique de la substance d'essai. La méthode de la dose fixée se déroule en deux stades. Lors d'une étude préliminaire, on détermine, de manière séquentielle, les effets de plusieurs doses administrées chacune oralement par gavage à un seul animal d'un même sexe. Cette étude préliminaire donne des informations sur la relation dose-effet et permet d'estimer la dose minimale létale. Normalement, pas plus de cinq animaux ne sont utilisés dans ce premier stade. Lors de l'étude principale, la substance est administrée oralement, par gavage, à un lot de cinq mâles et un lot de cinq femelles, en utilisant une dose unique choisie parmi les doses fixes (5, 50, 500 ou 2 000 mg/kg). La dose à utiliser est déduite de l'étude préliminaire et est celle supposée devoir produire une «toxicité manifeste» (voir 1.2. Définitions), sans entraîner la mort. On observe ensuite les effets. Lorsque la dose initialement retenue entraîne des effets toxiques manifestes mais sans mortalité liée au composé, aucun essai ultérieur n'est nécessaire. Lorsqu'aucune toxicité manifeste n'apparaît à la dose retenue, il convient de répéter l'essai avec la dose immédiatement supérieure. Si des animaux meurent ou si, en raison de la sévérité des effets toxiques, il est nécessaire d'euthanasier des animaux, il convient de répéter l'essai avec la dose immédiatement inférieure. Cette méthode permet d'identifier la «dose discriminante» (voir 1.2. Définitions), c'est-à-dire la plus élevée des doses fixes pouvant être administrée sans entraîner la mort ou la nécessité d'euthanasier. Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsqu'on sait que la substance à étudier peut entraîner une détresse ou des douleurs intenses du fait de ses propriétés corrosives ou irritantes. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparations 1.6.1.1. Animaux d'expérience Sauf contre indication, le rat est l'espèce préférée. Il faut utiliser des souches d'animaux de laboratoire courantes. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation de poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant de commencer l'essai, des animaux adultes jeunes et sains sont répartis au hasard dans les différents lots, pour l'étude préliminaire et pour l'étude principale. Il se peut qu'en pratique, un lot seulement de chaque sexe soit nécessaire pour l'étude principale. 1.6.1.2. Préparation et administration de la dose Au besoin, la substance d'essai est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Il est recommandé d'utiliser en priorité une solution aqueuse chaque fois que cela est possible, sinon on peut utiliser une solution dans de l'huile végétale, éventuellement une solution dans d'autres véhicules, ou une suspension. En ce qui concerne les véhicules non aqueux, leur toxicité doit être connue ou être déterminée avant ou pendant l'essai. Normalement, pour les rongeurs, le volume ne doit pas dépasser 10 ml/kg de poids corporel, sauf s'il s'agit de solutions aqueuses, pour lesquelles on peut utiliser 20 ml/kg. Pour minimiser la variabilité du volume d'essai, les concentrations doivent être ajustées de façon à réaliser les administrations sous volume constant. Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la substance. Dans le cas du rat, celui-ci doit être privé de nourriture pendant la nuit qui précède l'administration de la substance; l'eau n'est pas limitée. Le lendemain, les animaux doivent être pesés avant que la substance d'essai leur soit administrée par gavage à raison d'une dose unique. Si l'administration d'une dose unique n'est pas possible, la substance peut être administrée par fractions plus petites pendant une période ne dépassant pas 24 heures. Après l'administration de la substance, les animaux peuvent être privés de nourriture pendant trois à quatre heures. Si la dose est administrée par fractions pendant un certain laps de temps, il peut s'avérer nécessaire d'alimenter et de faire boire les animaux en fonction de la durée du traitement. 1.6.2. Mode opératoire 1.6.2.1. Étude préliminaire Les effets de différentes doses sont déterminés en utilisant un seul animal par dose. En l'absence d'information montrant que les mâles seraient plus sensibles, on utilisera des animaux femelles. L'administration se fait de façon séquentielle, en laissant au moins 24 heures avant d'administrer la substance à l'animal suivant. Chaque animal est soigneusement observé pendant au moins 7 jours pour les signes de toxicité; si des signes de toxicité modérée persistent au septième jour, l'animal est maintenu en observation pendant une période pouvant aller jusqu'à 7 jours supplémentaires. La gamme de doses suivantes est essayée dans un premier temps: 5, 50, 500 et 2 000 mg/kg. Si la première dose ne produit pas de toxicité importante, et que le niveau immédiatement supérieur entraîne une mortalité, il peut être nécessaire d'essayer une ou plusieurs doses intermédiaires, afin d'obtenir des informations sur la (les) doses qui produi(sen)t des signes de toxicité et sur la dose minimale qui cause la mortalité. Il faut essayer de choisir la première dose en se basant sur des informations provenant d'autres produits chimiques de la même famille. En l'absence d'une telle information, il est conseillé de commencer par la dose de 500 mg/kg. Si l'on n'observe pas de signes de toxicité à la première dose, la dose immédiatement supérieure est employée. Si la dose de 2 000 mg/kg ne provoque pas de mortalité, l'étude préliminaire est terminée, et l'étude principale sera effectuée avec cette dose. Si l'on observe des effets sévères, nécessitant l'euthanasie, à la dose initiale (par exemple 500 mg/kg), la dose immédiatement inférieure (par exemple 50 mg/kg) est administrée à un autre animal. Si celui-ci survit, on peut alors administrer des doses intermédiaires, judicieusement choisies entre les doses fixées. Normalement, on n'utilise pas plus de cinq animaux au cours de cet essai. 1.6.2.2. Étude principale Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles) doivent être utilisés pour chaque dose étudiée. Les femelles doivent êtres nullipares et non gravides. La méthode des doses fixes veut, par principe, que l'on utilise seulement des doses entraînant une toxicité modérée. On devra donc éviter l'administration de la substance d'essai à des doses létales. La dose à utiliser dans l'essai doit être sélectionnée parmi l'une des quatre doses fixes, à savoir 5, 50, 500 ou 2 000 mg/kg de poids corporel. La première dose retenue doit être celle susceptible de produire des effets toxiques manifestes mais aucune mortalité liée au composé (y compris les animaux euthanasiés; les morts accidentelles ne sont pas prises en compte mais doivent être consignées). Il est superflu de réaliser un essai ultérieur lorsque la dose produit des effets toxiques manifestes mais aucune mortalité liée au composé. Lorsque la dose choisie ne produit aucun effet toxique manifeste, il convient de répéter l'essai avec la dose immédiatement supérieure. Les animaux doivent, néanmoins, être maintenus sous observation jusqu'au terme de la période prévue. Lorsqu'une réaction toxique sévère requiert l'euthanasie des animaux, ou lorsque l'on constate une mortalité liée au composé, il convient de répéter l'essai avec la dose immédiatement inférieure, les animaux ne nécessitant pas d'euthanasie doivent être maintenus sous observation pendant toute la période prévue. Une fois la substance administrée, les observations sont effectuées et enregistrées de façon systématique, une fiche individuelle devant être établie pour chaque animal. La période d'observation doit au moins s'étendre sur 14 jours. Cependant, sa durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée en cas de besoin. Le moment où les symptômes de toxicité apparaissent et disparaissent ainsi que le moment de la mort sont importants, surtout en cas de mortalité retardée. Un examen clinique attentif doit être fait au moins deux fois le jour de l'administration de la substance et au moins une fois par jour ensuite. Les animaux souffrant manifestement ou présentant des signes graves de détresse doivent être euthanasiés. Des observations complémentaires sont nécessaires les premiers jours suivant l'administration si les animaux continuent à présenter des signes de toxicité. Il peut être mis fin à l'essai s'il apparaît que la dose initialement retenue était trop élevée. L'observation doit porter sur les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, des systèmes nerveux autonome et central ainsi que de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera portée à l'apparition de tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Chaque animal doit être pesé peu de temps avant l'administration de la substance d'essai, puis quotidiennement au cours des trois jours suivants et enfin, une fois par semaine. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience, sont pesés et autopsiés. Toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être consignées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés en vue d'un examen histo-pathologique. L'étude d'une deuxième ou, exceptionnellement, d'une troisième dose peut être nécessaire en fonction des résultats obtenus pour la dose précédente. Si une substance se révèle létale à une dose de 5 mg/kg de poids corporel (ou lorsqu'une étude préliminaire indique que cette dose entraînera la mort), il peut être nécessaire de poursuivre l'étude de la toxicité aiguë de la substance. 2. DONNÉES Les données de l'étude préliminaire et de l'étude principale doivent être récapitulées dans un tableau indiquant, pour chaque dose testée, le nombre d'animaux au début de l'essai; le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux trouvés morts pendant l'essai ou euthanasiés, une description des effets toxiques ainsi que, pour l'étude principale, l'existence d'effets toxiques manifestes liés au composé; l'évolution de tout effet toxique et les résultats de l'autopsie. Les modifications de poids doivent être calculées et notées lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux euthanasiés en raison d'un état de détresse et de souffrance lié au composé sont enregistrés comme s'ils étaient morts du fait du composé étudié. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants, à la fois pour l'étude préliminaire et l'étude principale : - espèces, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc. - conditions expérimentales - doses (avec indication du véhicule le cas échéant, et de la concentration), - résultats complets pour toutes les doses étudiées, - tableau des données par sexe et par dose (nombre d'animaux utilisés, modifications du poids corporel; nombre d'animaux morts ou euthanasiés pendant l'essai; nombre d'animaux présentant des signes de toxicité; nature, sévérité et durée des effets, - le moment d'apparition des signes de toxicité et leur éventuelle réversibilité, - lorsque des animaux sont morts ou ont été euthanasiés, le moment de la mort après l'administration, les motifs et critères pour lesquels les animaux ont été euthanasiés, - résultats d'autopsie, - résultats d'examens histo-pathologiques, - discussion des résultats, - interprétation des résultats, y compris les signes manifestes de toxicité et la dose discriminante identifiée dans l'essai. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION >EMPLACEMENT TABLE> Voir également introduction générale, partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale, partie B (point E). B.2. TOXICITÉ AIGUË (inhalation) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la distribution de la taille des particules, la pression de vapeur, le point de fusion, le point d'ébullition, le point d'éclair et l'explosivité (le cas échéant) de la substance. Voir également l'introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Plusieurs lots d'animaux d'expérience sont exposés à des concentrations croissantes de la substance à tester pendant une période déterminée, une seule concentration étant utilisée par lot. On observe ensuite les effets et la mortalité dus à la substance. Les animaux qui meurent pendant l'essai sont autopsiés ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience. Si des animaux montrent des signes d'inconfort et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsque l'on sait que l'administration de la substance à étudier peut entraîner une détresse ou des douleurs intenses du fait des propriétés corrosives ou irritantes. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant au moins les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Il n'est pas nécessaire de soumettre les animaux témoins à une exposition simulée, à moins que le dispositif d'exposition utilisé ne l'exige. Il peut être nécessaire de microniser les substances solides à tester afin de les réduire en particules d'une taille appropriée. On peut, au besoin, ajouter à la substance à tester un véhicule approprié en vue d'obtenir la concentration adéquate de celle-ci dans l'atmosphère; il faut alors prévoir un groupe témoin pour ce véhicule. Si un véhicule ou d'autres additifs sont utilisés pour faciliter l'administration, ils doivent être non toxiques et il est possible de s'appuyer pour cela sur des données bibliographiques appropriées. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce préférée. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Dix rongeurs au moins (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés pour chaque niveau de concentration. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. Note: Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux pour les tests de toxicité aiguë sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les concentrations doivent être soigneusement choisies, en multipliant les efforts visant à ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester. 1.6.2.3. Concentrations d'exposition Les concentrations doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et espacées correctement pour produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la CL50. 1.6.2.4. Essai «limite» Si une exposition de 5 animaux d'expériences mâles et cinq femelles à une concentration de 5 mg par litre d'un gaz ou d'un aérosol d'une substance liquide ou solide (ou lorsque cela n'est pas possible en raison de propriétés physiques ou chimiques, voire explosives, de la substance à tester, la concentration la plus élevée possible) pendant quatre heures ne cause la mort d'aucun animal dans les 14 jours suivant l'exposition, on peut juger inutile de pratiquer des essais ultérieurs. 1.6.2.5. Temps d'exposition La durée de l'exposition doit être de quatre heures. 1.6.2.6. Dispositif expérimental Les animaux doivent être exposés à la substance au moyen d'un dispositif d'exposition dynamique capable de maintenir un courant d'air permettant au moins 12 renouvellements de l'atmosphère de l'enceinte d'exposition par heure, et assurant une teneur suffisante en oxygène ainsi qu'une répartition uniforme du produit à tester dans l'atmosphère de l'enceinte d'exposition. Si l'on utilise une chambre d'exposition, celle-ci doit être conçue de manière à éviter autant que possible l'entassement des animaux et à optimiser l'exposition par inhalation à la substance d'essai. En règle générale, pour assurer la stabilité de la composition de l'atmosphère d'une chambre, le «volume» total des animaux d'expérience ne doit pas dépasser 5 % du volume de la chambre d'essai. On peut aussi avoir recours à un système d'exposition soit oro-nasal, soit de la tête seule, soit du corps entier en chambre individuelle; les deux premiers types d'exposition présentent l'avantage de limiter la pénétration de la substance d'essai par d'autres voies. 1.6.2.7. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre au moins sur 14 jours. Cependant, cette durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée si nécessaire. Le moment d'apparition ou de disparition des symptômes de toxicité ainsi que le moment de la mort sont importants, surtout en cas de mortalité retardée. 1.6.3. Mode opératoire Peu de temps avant l'exposition, les animaux sont pesés, puis exposés à la concentration d'essai dans l'appareillage décrit pendant une durée de quatre heures après stabilisation de la concentration dans la chambre. La stabilisation doit être rapide. La température à laquelle s'effectue l'essai doit être maintenue à 22 C ± 3 C. L'idéal est de maintenir l'humidité relative entre 30 et 70 %, mais, dans certains cas (par exemple certains essais d'aérosols), cela peut être impossible. Le maintien d'une pression légèrement négative à l'intérieur de la chambre ( 5 mm d'eau) empêchera la substance d'essai de s'échapper dans le laboratoire. La nourriture et l'eau doivent être retirées pendant l'exposition. Il convient d'utiliser un dispositif permettant de produire et de contrôler l'atmosphère d'essai. Le système doit permettre de créer des conditions d'exposition stables aussi rapidement que possible. La chambre doit être conçue et fonctionner de telle façon qu'il y soit maintenue une distribution homogène de la substance dans l'atmosphère. Il convient de mesurer ou de surveiller: a) le débit d'air (en permanence). b) la concentration réelle de la substance d'essai. Elle doit être mesurée dans la zone de respiration au moins trois fois au cours de l'exposition (certaines atmosphères, comme les aérosols à forte concentration, peuvent nécessiter un contrôle plus fréquent). Pendant la période d'exposition, la concentration ne doit pas varier de plus de ± 15 % par rapport à la valeur moyenne. Toutefois, dans le cas de certains aérosols, ce degré de précision peut ne pas être obtenu et un écart plus grand est alors acceptable. En ce qui concerne les aérosols, la taille des particules doit être analysée aussi souvent que nécessaire (au moins une fois par groupe d'exposition). c) la température et l'humidité, en permanence si possible. Les observations ont lieu pendant et après l'exposition et sont enregistrées systématiquement; une fiche individuelle doit être établie pour chaque animal. Les observations doivent être fréquentes le premier jour. Un examen clinique attentif doit être pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations doivent être faites quotidiennement, en agissant de façon à réduire le nombre d'animaux perdus pour l'étude, par exemple grâce à l'autopsie ou à la conservation au froid des animaux trouvés morts ainsi qu'en isolant et en sacrifiant des animaux faibles ou moribonds. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera apportée à la respiration, aux tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être noté avec autant de précision que possible. Le poids de chaque animal doit être déterminé chaque semaine après l'exposition ainsi qu'au moment de la mort. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés en recherchant en particulier toutes les modifications des voies respiratoires supérieures et inférieures. Toutes les modifications doivent être consignées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées dans un tableau indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres symptômes de toxicité, la description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le poids de chaque animal doit être déterminé et enregistré lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause de l'inconfort et des souffrances dus à la substance sont enregistrés en tant que morts dues à la substance. La CL50 doit être déterminée selon une méthode reconnue. L'évaluation des données doit inclure la relation, si elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et l'apparition ainsi que la gravité de toutes les anomalies, y compris les anomalies du comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les changements de poids corporel, la mortalité et tout autre effet toxique éventuel. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions de l'essai: description de l'appareillage d'exposition, y compris conception, type, dimensions, source d'air, système de génération produisant l'aérosol, méthode de conditionnement d'air et, le cas échéant, stabulation des animaux en chambre d'essai. Le dispositif de mesure de la température, de l'humidité, de la concentration des aérosols et de la distribution de la taille des particules doit être décrit. Données relatives à l'exposition: Elles doivent être présentées sous forme d'un tableau indiquant les valeurs moyennes ainsi qu'une mesure de la variabilité (par exemple écart-type); elles devront, si possible, comprendre: a) débit d'air dans le dispositif d'inhalation, b) température et humidité de l'air, c) concentrations nominales (quantité totale de substance d'essai introduite dans le dispositif d'inhalation, divisée par le volume d'air), d) le cas échéant, nature du véhicule, e) concentrations réelles dans la zone de respiration, f) diamètre aérodynamique médian en masse (DAMM) et écart-type géométrique (ETG), g) durée de stabilisation, h) durée d'exposition. - tableau de données de réponses par sexe et par dose (à savoir, nombre d'animaux morts ou sacrifiés au cours de l'essai, nombre d'animaux présentant des symptômes d'intoxication, nombre d'animaux exposés), - moment de la mort pendant ou après exposition, raisons et critères pour lesquels les animaux ont été euthanasiés, - toutes les observations, - valeur de la CL50 pour les animaux de chaque sexe, déterminée à la fin de la période d'observation (en précisant la méthode de calcul), - intervalle de confiance de 95 % pour la CL50 (lorsque le calcul est possible), - courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la méthode de calcul le permet), - résultats d'autopsie, - tous les résultats d'examens histopathologiques, - discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de l'effet que peuvent avoir sur la valeur calculée de la CL50, les animaux euthanasiés au cours de l'essai), - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.3. TOXICITÉ AIGUË (cutanée) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Des doses croissantes de la substance à tester sont appliquées sur la peau à plusieurs lots d'animaux d'expérience, une seule dose étant utilisée par lot. On observe ensuite les effets et la mortalité. Les animaux qui meurent pendant l'essai sont autopsiés ainsi que ceux qui survivent à la fin de l'expérience. Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier; il n'y a pas lieu d'effectuer l'essai lorsque l'on sait que l'administration de la substance à étudier entraîne une détresse ou des douleurs intenses du fait de ses propriétés corrosives ou irritantes. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux adultes jeunes et sains sont distribués selon les règles du hasard dans les différents lots d'expérience. Vingt-quatre heures environ avant l'épreuve, on tond ou l'on rase les poils de la région dorsale du tronc des animaux en évitant toute lésion de la peau susceptible de modifier sa perméabilité. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être suffisamment humectée au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à assurer un bon contact avec la peau. Si l'on utilise un véhicule, son influence sur la pénétration de la substance dans la peau doit être prise en considération. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience On peut utiliser des rats ou des lapins adultes. On peut également utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en justifier l'utilisation. Il faut utiliser des souches courantes d'animaux de laboratoire. Pour chaque sexe, au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder, ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Cinq animaux au moins sont utilisés pour chaque dose. Ils doivent être de même sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non-gravides. Si l'on dispose d'informations qui montrent qu'un sexe est nettement plus sensible, les essais seront pratiqués sur des animaux de ce sexe. Note: Il faut essayer d'utiliser un nombre plus restreint d'animaux lorsque les tests de toxicité aiguë sont effectués sur des animaux appartenant à un ordre plus élevé que celui des rongeurs. Les doses doivent être soigneusement choisies, en s'efforçant au maximum de ne pas dépasser des doses modérément toxiques. Il faut éviter dans ce type d'essais d'administrer des doses létales de la substance à tester. 1.6.2.3. Doses Les doses doivent être en nombre suffisant, au moins trois, et espacées de manière à produire des lots présentant une gamme d'effets toxiques et de taux de mortalité. Tout effet irritant ou corrosif doit être pris en considération lors du choix des doses. Les données doivent être suffisantes pour permettre de tracer une courbe doses/réponses et, si possible, permettre une détermination acceptable de la DL50. 1.6.2.4. Essai «limite» Un essai «limite» peut être effectué en administrant une dose au moins égale à 2 000 mg/kg de poids corporel au moins à un lot de 5 mâles et 5 femelles, en suivant le mode opératoire décrit ci-après. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut être nécessaire de réaliser une étude complète. 1.6.2.5. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre au moins sur 14 jours. Cependant sa durée ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être déterminée en fonction des réactions de toxicité, de leur vitesse d'apparition et de la durée de la période de récupération; elle peut donc être prolongée en cas de besoin. Le moment où les signes de toxicité apparaissent et disparaissent, leur durée ainsi que le moment de la mort sont importants, surtout en cas de tendance à une mortalité retardée. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. La substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une surface à peu près égale à 10 % de la surface totale du corps. Dans le cas de substances hautement toxiques, la surface traitée peut être moindre, mais la substance d'essai doit être appliquée de manière à former un film aussi mince et uniforme que possible. Les substances d'essai doivent être maintenues en contact avec la peau au moyen d'un pansement de gaze poreux et d'un sparadrap non irritant pendant une période de 24 heures. La partie traitée doit, en outre, être convenablement couverte, de manière à maintenir en place le pansement de gaze et la substance d'essai et à éviter que les animaux puissent ingérer cette dernière. On peut utiliser des appareils de contention pour empêcher les animaux d'ingérer la substance d'essai mais une immobilisation complète n'est pas recommandée. A la fin de la période d'application, la substance d'essai résiduelle doit être éliminée, si possible, avec de l'eau, ou au moyen d'un autre procédé de nettoyage de la peau. Les observations doivent être consignées systématiquement au fur et à mesure qu'elles sont effectuées, en établissant une fiche individuelle pour chaque animal. Les animaux doivent être observés fréquemment le premier jour. Un examen clinique attentif doit être pratiqué au moins une fois par jour ouvrable, d'autres observations doivent être faites quotidiennement, en prenant des mesures de façon à réduire le nombre d'animaux perdus pour l'étude, par exemple: autopsie ou conservation au froid des animaux trouvés morts ainsi qu'en isolant et sacrifiant les animaux faibles ou moribonds. Les observations doivent concerner les modifications des poils, de la peau traitée, des yeux, des muqueuses ainsi que de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, et enfin de l'activité somato-motrice et du comportement. Une attention particulière sera apportée aux tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Le moment de la mort doit être enregistré avec autant de précision que possible. Les animaux qui meurent pendant l'expérience et ceux qui survivent à la fin de l'expérience sont autopsiés. Toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être enregistrées. Si nécessaire, des tissus doivent être prélevés pour un examen histopathologique. Estimation de la toxicité pour l'autre sexe Après avoir mené à terme l'étude portant sur des animaux appartenant à un sexe, la substance est administrée au moins à un lot de 5 animaux de l'autre sexe, afin de déterminer si les animaux de ce sexe ne sont pas nettement plus sensibles à la substance à tester. L'utilisation d'un plus petit nombre d'animaux peut être justifié dans des circonstances particulières. Si l'on dispose d'informations appropriées qui montrent que les animaux du sexe testé sont considérablement plus sensibles, on peut se dispenser d'effectuer des essais sur les animaux de l'autre sexe. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai, le moment de la mort de chaque animal, le nombre d'animaux présentant d'autres signes d'intoxication, la description des effets toxiques et les résultats de l'autopsie. Le poids de chaque animal doit être déterminé et noté peu de temps avant l'application de la substance d'essai, puis une fois par semaine et au moment de la mort; les modifications du poids doivent être calculées et enregistrées lorsque la survie dépasse une journée. Les animaux qui sont euthanasiés à cause des souffrances et de l'inconfort dus à la substance sont enregistrés comme s'ils étaient morts du fait du composé étudié. La DL50 doit être déterminée par application d'une méthode reconnue. L'évaluation des données doit inclure une évaluation de la relation, si elle existe, entre l'exposition des animaux à la substance à tester et l'apparition ainsi que la sévérité de toutes les anomalies, y compris les anomalies de comportement et les anomalies cliniques, les lésions macroscopiques, les modifications de poids corporel, la mortalité et tout autre effet toxique éventuel. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions expérimentales (y compris le procédé de nettoyage de la peau et le type de pansement: occlusif ou non), - doses (avec indication du véhicule le cas échéant, et des concentrations), - sexe des animaux sur lesquels l'essai a été réalisé, - tableau de données de réponses par sexe et par dose (à savoir, nombre d'animaux morts ou sacrifiés au cours de l'essai, nombre d'animaux présentant des symptômes d'intoxication, nombre d'animaux exposés), - moment de la mort après administration, raisons et critères justifiant l'euthanasie des animaux, - toutes les observations, - valeur de la DL50 pour le sexe soumis à une étude complète, déterminée à 14 jours (en précisant la méthode de calcul), - intervalle de confiance de 95 % pour la DL50, lorsque le calcul est possible, - courbe dose/mortalité et pente de cette courbe (lorsque la méthode de calcul le permet), - résultats d'autopsie, - toutes les constatations histopathologiques, - résultats de tout essai réalisé sur l'autre sexe, - discussion des résultats (en tenant compte, en particulier, de l'effet que peuvent avoir sur la valeur de la DL50 calculée les animaux euthanasiés au cours de l'essai), - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.4. TOXICITÉ AIGUË (irritation de la peau) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Considérations préliminaires Il convient de prendre en considération toutes les informations disponibles concernant la substance afin de limiter les essais susceptibles de provoquer des réactions sévères. Les informations suivantes peuvent être utiles pour juger s'il est approprié de pratiquer un essai complet, une étude sur un seul animal, ou de ne pas effectuer l'essai. i) Propriétés physico-chimiques et réactivité chimique. Il n'est pas nécessaire de soumettre les substances fortement acides ou alcalines (par exemple d'un pH connu inférieur ou égal à 2 ou supérieur ou égal à 11,5) à un essai d'irritation cutanée primaire si l'on suppose qu'elles ont des propriétés corrosives. Il convient de tenir également compte de la réserve alcaline ou acide. ii) Si des essais in vitro correctement validés ont montré d'une manière évidente qu'une substance provoque des effets sévères, il peut être inutile d'effectuer un essai complet. iii) Résultats d'études de toxicité aiguë. Si un essai de toxicité aiguë par administration de la substance à la dose de l'essai «limite» (2 000 mg/kg de poids corporel) par voie cutanée n'a provoqué aucune irritation de la peau, il peut être inutile de poursuivre les essais relatifs à l'irritation cutanée. Il est, en outre, inutile de soumettre à l'essai des substances qui se sont révélées très toxiques après administration par voie cutanée. La substance à étudier est appliquée en une dose unique sur la peau de plusieurs animaux d'expérience, chaque animal étant son propre témoin. L'importance de la réaction d'irritation est observée et cotée après un laps de temps déterminé; elle fait l'objet d'une description détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La période d'observation doit être suffisamment longue pour pouvoir évaluer le caractère complètement réversible des effets observés. Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Vingt-quatre heures environ avant l'essai, la région dorsale du tronc des animaux est tondue ou rasée. Lors de cette opération, il faut veiller à ne pas érafler la peau. Seuls des animaux présentant une peau intacte et saine doivent être utilisés. Certaines souches de lapin ont des touffes de poils denses qui sont plus volumineuses à certaines périodes de l'année. Les substances d'essai ne doivent pas être appliquées sur ces régions de forte croissance pileuse. Lorsque l'essai concerne des substances solides (qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées), la substance à étudier doit être suffisamment humectée au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à garantir un bon contact avec la peau. Si l'on utilise un véhicule, son influence doit être prise en compte lors de l'irritation de la peau par la substance à étudier. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Bien que plusieurs espèces de mammifères puissent être utilisées, le lapin albinos est l'espèce préférée.1.6.2.2. Nombre d'animaux 1.6.2.2. Nombre d'animaux Si les résultats de recherches in vitro ou d'autres informations suggèrent que la substance peut induire une nécrose (c'est-à-dire être corrosive), il faut envisager d'effectuer l'essai sur un seul animal. Si les résultats de cet essai ne mettent pas en évidence de propriétés corrosives, l'essai doit être complété à l'aide de deux animaux supplémentaires, au moins. Pour l'essai complet, on utilise au moins trois animaux adultes et sains. Il n'est pas nécessaire d'utiliser un lot d'animaux témoins non traités. L'utilisation d'un plus grand nombre d'animaux peut s'avérer nécessaire pour préciser des réponses douteuses. 1.6.2.3. Doses Sauf contre-indications, un volume de 0,5 ml de liquide, ou 0,5 g de substance solide ou semi-solide, est appliqué sur la région de l'essai. Les zones de peau adjacentes, non traitées, de chaque animal servent de témoin. 1.6.2.4. Période d'observation La période d'observation ne doit pas être limitée de façon rigide. Elle doit être suffisante pour évaluer totalement le caractère réversible ou non des effets observés mais il n'y a pas lieu normalement d'excéder 14 jours après l'application. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. La substance d'essai doit être appliquée sur une petite surface cutanée (environ 6 cm2) et recouverte d'un petit carré de gaze maintenu en place par du sparadrap non irritant. Dans le cas des liquides ou de certaines pâtes, il peut se révéler nécessaire d'étendre d'abord la substance d'essai sur le carré de gaze, puis d'appliquer celui-ci sur la peau. Le carré de gaze doit être maintenu sans serrer au contact de la peau à l'aide d'un pansement approprié occlusif ou semi-occlusif, pendant la durée de l'exposition. Il faut empêcher l'animal d'atteindre le pansement et d'ingérer/inhaler les substances d'essai. A la fin de la période d'exposition, la substance d'essai résiduelle doit être éliminée, si possible, à l'aide d'eau ou d'un solvant approprié, sans modifier la réponse due à la substance ni l'intégrité de l'épiderme. La durée d'exposition est normalement de quatre heures. Si l'on craint que la substance produise une nécrose (c'est-à-dire qu'elle soit corrosive), la durée de l'exposition doit être réduite (par exemple à 1 heure ou à trois minutes). Un tel essai peut aussi être, en premier lieu, réalisé sur un seul animal et, sauf contre-indication résultant de l'essai de toxicité aiguë par administration cutanée, trois applications de substances peuvent être réalisées simultanément sur le même animal. La première est enlevée après trois minutes. S'il n'apparaît aucune réaction cutanée grave, le second pansement est enlevé au bout d'une heure. Si les observations effectuées à ce moment-là indiquent qu'une exposition de quatre heures est nécessaire et que cela est possible sans souffrance inacceptable de l'animal, le troisième pansement est enlevé après quatre heures et les réponses sont cotées. Dans ce dernier cas (c'est-à-dire quand il a été possible d'effectuer l'exposition de quatre heures), l'essai doit être complété avec deux animaux supplémentaires au moins, sauf si l'on estime que ce serait inacceptable (par exemple si une nécrose est apparue à la suite de l'exposition de quatre heures). Si une réaction cutanée grave (par exemple une nécrose) est observée à trois minutes ou à une heure, l'essai est immédiatement interrompu. Des expositions plus longues peuvent être indiquées sous certaines conditions, par exemple en raison des modes d'utilisation et d'exposition prévus pour l'homme. 1.6.3.1 Observations et cotations L'observation d'érythèmes et d'oedèmes ainsi que leur cotation doivent être effectués 60 minutes, puis 24, 48 et 72 heures après l'enlèvement du pansement. L'irritation cutanée est cotée et enregistrée d'après le système décrit dans le tableau 1. Des observations ultérieures peuvent se révéler nécessaires si la réversibilité n'a pas été totalement établie au bout de 72 heures. Outre les observations concernant l'irritation, toute lésion grave, telle que la corrosion (destruction irréversible des tissus cutanés) et tout autres effet toxique doivent faire l'objet d'une description complète. On peut avoir recours à des techniques comme l'examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané pour clarifier des réactions douteuses ou des réponses masquées par une coloration de la peau par la substance d'essai. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque animal les cotations d'irritation pour l'érythème et l'oedème durant la période d'observation. Il y a lieu d'enregistrer toute lésion grave, une description de l'intensité et de la nature de l'irritation, la réversibilité ou la corrosion, ainsi que tout autre effet toxique observé. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions expérimentales (y compris les propriétés physico-chimiques pertinentes du produit, le procédé de préparation et de nettoyage de la peau et le type de pansement: occlusif ou semi-occlusif), - tableaux des données relatives aux réactions d'irritation chez chaque animal lors de chaque observation (par exemple 1, 24, 48 et 72 heures, etc., après enlèvement du pansement), - description de toute lésion grave observée, y compris la corrosion, - description de l'intensité et de la nature de l'irritation observée et toute observation histopathologique, - description de tout effet toxique autre qu'une irritation cutanée, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). Annexe >EMPLACEMENT TABLE> B.5. TOXICITÉ AIGUË (IRRITATION DES YEUX) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Considérations préliminaires Il convient de prendre en considération toutes les informations disponibles concernant la substance afin de limiter les essais susceptibles de provoquer des réactions graves. Les informations suivantes peuvent être utiles à ce propos. i) Propriétés physico-chimiques et réactivité chimique. Il peut ne pas être nécessaire de soumettre à un essai les substances fortement acides ou alcalines si l'on prévoit qu'elles pourraient provoquer des lésions graves, par exemple, en amenant le pH de l'oeil à une valeur inférieure ou égale à 2 ou bien supérieure ou égale à 11,5. Il convient de prendre également en considération la réserve alcaline ou acide. ii) Résultats de méthodes alternatives correctement validées: les produits qui se sont avérés posséder des propriétés potentiellement corrosives ou très irritantes dans ces études ne devront pas être soumis è l'essai d'irritation oculaire, car il est probable que de telles substances auront des effets sévères sur l'oeil. iii) Résultats d'études d'irritation cutanée. Les substances qui se sont clairement avérées corrosives ou très irritantes pour la peau ne doivent pas être soumises à un essai d'irritation oculaire, car il est probable qu'elles auront des effets graves sur les yeux. La substance à étudier est appliquée en une dose unique sur l'un des deux yeux de l'animal d'expérience; l'oeil non traité sert de témoin. L'importance de la réaction d'irritation est observée et cotée à des intervalles de temps déterminés; elle fait l'objet d'une description détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La durée de l'observation doit être suffisante pour permettre une évaluation du caractère totalement réversible des effets observés. Si des animaux montrent des signes de détresse et de douleur intenses et durables, il peut être nécessaire de les euthanasier. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les deux yeux de chaque animal d'expérience sélectionné pour l'essai doivent être examinés au cours des 24 heures qui précèdent l'expérience. Les animaux présentant une irritation oculaire, des défauts oculaires ou une lésion préexistante de la cornée ne doivent pas être utilisés. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Bien que plusieurs espèces aient été utilisées, il est recommandé d'effectuer l'essai sur des lapins albinos adultes et sains. 1.6.2.2. Nombre d'animaux Si l'on prévoit des effets marqués, il faut envisager d'effectuer un essai sur un seul animal. Si les résultats de ce test sur un lapin suggèrent que la substance est fortement irritante (effet réversible) ou corrosive (effet irréversible) pour l'oeil en suivant le mode opératoire décrit, il n'est pas nécessaire de poursuivre les essais d'irritation oculaire sur davantage d'animaux. Des essais supplémentaires sur un plus grand nombre d'animaux peuvent parfois être appropriés pour étudier des aspects particuliers. Pour les tests qui portent sur plusieurs animaux, on utilisera au moins trois animaux. Il peut s'avérer nécessaire d'en utiliser un plus grand nombre pour préciser des réponses équivoques. 1.6.2.3. Doses Si la substance à étudier est sous forme liquide, on utilise un volume de 0,1 ml. Pour les substances solides, les pâtes et les substances particulaires, la quantité utilisée doit avoir un volume de 0,1 ml ou un poids de 0,1 g environ (le poids doit toujours être noté). Si la substance d'essai est solide ou sous forme de grains, elle doit être broyée en fine poussière. La mesure du volume des substances particulaires doit être précédée d'un compactage léger, par exemple, en tapotant le récipient de mesure. Lorsque les substances sont contenues dans des vaporisateurs ou des flacons à aérosols pressurisés, il faut extraire le liquide de son récipient et en recueillir 0,1 ml que l'on instille dans l'oeil, conformément aux instructions concernant les liquides. 1.6.2.4. Période d'observation La durée de la période d'observation ne doit pas être limitée de façon rigide. Sa durée doit être suffisante pour permettre une évaluation du caractère réversible ou non des effets observés mais ne doit normalement pas excéder 21 jours. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. La substance d'essai doit être placée dans le cul-de-sac conjonctival de l'un des yeux de chaque animal, après avoir délicatement écarté la paupière inférieure du globe oculaire. Ensuite, on maintient doucement les paupières jointes, pendant une seconde environ, pour éviter la perte de substance. L'autre oeil, qui ne subit pas de traitement, sert de témoin. Si l'on pense ¹ue la substance pourrait provoquer une douleur intense, on peut utiliser un anesthésique local avant de l'instiller dans l'oeil. Le type d'anesthésique local, sa concentration et son temps d'application doivent être soigneusement choisis afin de ne pas modifier de manière significative la réaction à la substance à tester. L'oeil témoin doit être anesthésié de la même manière. Les yeux des animaux d'expérience ne doivent pas être rincés pendant les 24 heures qui suivent l'instillation de la substance à étudier. Un rinçage peut, au besoin, être effectué au bout de la vingt-quatrième heure si cela paraît approprié. Pour certaines substances, dont le caractère irritant a été mis en évidence par cet essai, il peut être indiqué de pratiquer des essais supplémentaires en utilisant des lapins dont on rince les yeux juste après l'instillation de la substance. Il est recommandé d'utiliser trois lapins dans ce cas. Les yeux des lapins sont rincés une demi-minute après l'instillation. Le rinçage dure une demi-minute en utilisant un volume et une vitesse d'écoulement qui ne soient pas responsables d'altération de l'oeil. 1.6.3.1. Observations et cotation Les yeux doivent être examinés après 1, 24, 48 et 72 heures. S'il n'y a pas de lésion oculaire au temps 72 heures, l'étude peut être terminée. Une observation prolongée peut se révéler nécessaire en cas de persistance de l'atteinte cornéenne ou de toute autre irritation oculaire, afin de déterminer l'évolution des lésions et leur caractère réversible ou irréversible. Outre les observations relatives à la cornée, à l'iris et à la conjonctive, il y a lieu d'enregistrer et de décrire toutes les autres lésions observées. La cotation de la réaction oculaire (voir tableau) doit être enregistrée lors de chaque examen. (La cotation des réponses oculaires peut donner lieu à diverses interprétations. Afin d'aider les laboratoires de recherche et les personnes chargées d'effectuer ou d'interpréter les observations, un guide illustré traitant des irritations oculaires peut être utilisé.) Pour faciliter l'examen des réactions, on peut utiliser une loupe binoculaire, une lampe à fente rotative, un ophtalmoscope pour animaux ou tout autre appareil approprié. Après enregistrement des observations effectuées à la vingt-quatrième heure, l'examen des yeux de certains ou de tous les lapins peut être approfondi à l'aide de fluorescéine. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque animal, la cotation de l'intensité de l'irritation aux temps d'observation spécifiés. Il faut décrire l'intensité et la nature de l'irritation, la présence de lésions importantes ainsi que tout autre effet non-oculaire observé. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - données concernant les animaux (espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.), - conditions expérimentales (y compris les propriétés physico-chimiques pertinentes de la substance à tester), - tableaux des données relatives à la réaction d'irritation/corrosion chez chaque animal lors de chaque observation (par exemple 1, 24, 48 et 72 heures), - description de toute lésion grave observée, - description détaillée de l'intensité et de la nature de l'irritation ou de la corrosion observée, y compris la région concernée de la cornée et la réversibilité, - description de la méthode utilisée pour évaluer l'intensité de l'irritation après 1, 24, 48 et 72 heures (par exemple lampe à fente rotative, biomicroscope, fluorescéine), - description de tout effet local non-oculaire, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). Annexe >EMPLACEMENT TABLE> B.6. SENSIBILISATION CUTANEE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Remarques: La sensibilité des essais et leur aptitude à détecter les produits potentiellement sensibilisants cutanés pour l'homme sont des éléments considérés comme importants pour établir un système de classement de toxicité adapté en matière de santé publique. Il n'existe pas de méthode d'essai unique qui permette d'identifier toutes les substances ayant un potentiel de sensibilisation cutanée pour l'homme. Lors du choix d'un essai, il faut prendre en considération certains facteurs tels que les caractéristiques physiques d'une substance, et y compris son pouvoir de pénétration cutanée. Les essais utilisant les cobayes peuvent être répartis en deux catégories: d'une part, les essais avec adjuvant, dans lesquels un état allergique est potentialisé en dissolvant ou en mettant en suspension, la substance à étudier dans l'Adjuvant Complet de Freund (ACF), et d'autre part les essais sans adjuvants. Les essais utilisant un adjuvant permettent en général de prévoir un effet de sensibilisation cutanée d'une substance chez l'homme avec plus de précision que les méthodes qui n'utilisent pas l'Adjuvant Complet de Freund. C'est pour cette raison que leur utilisation est préférable. L'essai de Maximilisation chez le Cobaye (EMC) est un essai de type adjuvant largement utilisé. Bien que plusieurs autres méthodes puissent être utilisées pour déceler l'aptitude d'une substance à provoquer une réaction de sensibilisation cutanée, l'EMC est considéré comme la technique employant un adjuvant à utiliser de préférence. Les essais sans adjuvant (l'essai de Buehler est utilisé de préférence) sont considérés comme étant moins sensibles vis-à-vis d'un grand nombre de classes de produits chimiques. Dans certains cas, il peut y avoir de bonnes raisons de choisir l'essai de Buehler qui comporte une application locale, plutôt que l'essai de Maximilisation chez le Cobaye pour lequel on pratique une injection intradermique. L'utilisation de l'essai de Buehler doit être justifiée par des raisons d'ordre scientifique. L'essai de Maximilisation chez le Cobaye (EMC) et l'essai de Buehler sont décrits dans cette méthode. D'autres méthodes, si elles sont correctement validées, peuvent être utilisées à condition d'apporter une justification scientifique. Quelle que soit la méthode utilisée, il convient de vérifier à intervalles réguliers (tous les six mois) que la souche de cobaye utilisée reste sensible, et qu'un sensibilisant faible à modéré connu conduit bien à un nombre satisfaisant de réponses positives. Voir également l'introduction générale Partie B (point A). 1.2. DÉFINITION Voir introduction générale partie B (B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Les substances suivantes, diluées si nécessaire, sont recommandées, de même que toute autre substance sensibilisante citée dans la littérature ou appartenant au groupe de la substance soumise à l'essai. - p-phénylènediamineCAS no 106-50-3 - dinitro-2,4-chlorobenzèneCAS no 97-00-7 - dichromate de potassiumCAS no 7778-50-9 - sulfate de néomycineCAS no 1405-10-3 - sulfate de nickelCAS no 7786-81-4 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Après une première exposition à une substance d'essai (période d'«induction») les animaux sont soumis, approximativement deux semaines après la dernière exposition d'induction, à une exposition de «déclenchement» à cette même substance en vue d'établir si un état d'hypersensibilité a été induit. La sensibilisation est déterminée par un examen de la réaction cutanée à l'exposition de déclenchement. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Essai de Maximalisation chez le Cobaye (EMC) 1.6.1.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont répartis selon les règles du hasard en lots traités et témoins. Avant d'administrer la substance, on tond ou l'on rase la région de l'épaule en évitant d'érafler la peau. 1.6.1.2. Conditions de l'essai 1.6.1.2.1. Animaux d'expérience On utilise des souches de laboratoire courantes de cobayes albinos; les animaux doivent peser moins de 500 g. 1.6.1.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, celles-ci doivent être nullipares et non gravides. Un minimum de 10 animaux sont utilisés pour le lot traité et au moins 5 pour le lot témoin. Si un plus petit nombre d'animaux est utilisé, il convient d'en justifier la raison. Si les résultats ne sont pas clairs, un examen histopathologique peut aider à décider si l'essai doit être répété sur un autre lot d'animaux. Quand il n'est pas possible de conclure que la substance a ou non un pouvoir sensibilisant, il est recommandé d'ajouter des animaux supplémentaires afin d'arriver à un total d'au moins 20 animaux d'essai et 10 animaux témoins. 1.6.1.2.3. Doses La concentration de la substance à étudier est fixée de manière à produire une irritation cutanée visible, tout en étant bien tolérée par les animaux lors de chaque phase d'induction. La concentration de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale qui n'induit aucune irritation cutanée primaire chez des animaux non sensibilisés. Ces concentrations peuvent être déterminées à l'aide d'une étude pilote réduite ( 2 ou 3 animaux). 1.6.1.2.4. Période d'observation Durant la période d'induction, on surveille les éventuels effets irritants. Après l'exposition déclenchante, les réactions cutanées sont notées 24 et 48 heures après avoir enlevé le pansement recouvrant. 1.6.1.3. Mode opératoire Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai. La région de l'épaule est rasée. La méthode comporte deux phases: 1.6.1.3.1. Induction Jour 0 - lot traité Les injections intradermiques suivantes, chacune d'un volume de 0,1 ml, sont effectuées, par paire, dans la région de l'épaule de telle sorte que chaque injection est effectuée de chaque côté de la ligne médiane: injection 1:0,1 ml d'Adjudant Complet de Freund (ACF) mélangé avec de l'eau ou une solution physiologique dans un rapport 1:1, injection 2:0,1 ml de la substance à étudier, si nécessaire dans un véhicule approprié, injection 3:0,1 ml de substance à étudier dans de l'ACF. Pour l'injection 3, les substances hydrosolubles sont dissoutes dans 0,05 ml d'eau et 0,05 ml d'ACF non dilué. Les substances liposolubles ou insolubles sont mélangées avec de l'ACF non dilué. Pour l'injection 3, la concentration finale de la substance à étudier devra être égale à celle de l'injection 2. Les injections 1 et 2 sont faites à proximité l'une de l'autre et le plus près possible de la tête, tandis que l'injection 3 est effectuée vers la partie caudale de la surface d'essai. Jour 0 - lot témoin Les injections intradermiques ci-après sont faites, par paires, aux mêmes emplacements que ci-dessus. injection 1:0,1 ml d'Adjudant Complet de Freund (ACF) mélangé avec de l'eau ou une solution physiologique dans un rapport 1:1, injection 2:0,1 ml de véhicule seul, injection 3:0,1 ml de véhicule dans de l'ACF. 6ème jour - lot traité et lot témoin Si la substance n'induit pas d'irritation cutanée, la zone d'essai, rasée et/ou tondue, est badigeonnée avec 0,5 ml d'une solution à 10 % de lauryl sulfate de sodium dans de la vaseline, afin de créer une irritation locale. 7ème jour - lot traité La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. La substance à étudier mélangée à un véhicule approprié (le choix du véhicule doit être justifié; les solides sont réduits en poudre fine et incorporés dans un véhicule approprié; au besoin, les liquides peuvent être appliqués directement) est placée sur un papier-filtre (2 × 4 cm) et appliquée sur la surface d'essai où elle est maintenue en contact avec la peau au moyen d'un pansement occlusif pendant 48 heures. 7ème jour - lot témoin La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Le véhicule seul est appliqué, de la même manière, sur la surface d'essai et maintenu en contact avec la peau pendant 48 heures à l'aide d'un pansement occlusif. 1.6.1.3.2. Déclenchement 21ème jour Les flancs des animaux traités et des animaux témoins sont débarrassés de leurs poils. Une petite compresse ou une cupule contenant la substance à étudier est appliquée sur l'un des flancs des animaux traités tandis qu'une petite compresse de gaze ou une cupule contenant uniquement le véhicule est appliquée sur l'autre flanc. Les petites compresses sont maintenues en contact avec la peau à l'aide d'un pansement occlusif pendant 24 heures. Le lot témoin est exposé d'une manière identique. 23 et 24èmes jours - 21 heures après avoir enlevé la compresse, la zone de déclenchement est nettoyée et débarrassée des poils, si nécessaire, - trois heures plus tard (soit 48 heures après le début de l'application de déclenchement) on observe et on enregistre la réaction cutanée, - 24 heures après cette observation, on procède à une seconde observation (soit après 72 heures) que l'on enregistre. Pour préciser les résultats obtenus lors du premier déclenchement, il y a lieu, si nécessaire, de prévoir un second déclenchement avec un nouveau lot témoin pour le véhicule, une semaine environ après le premier. 1.6.1.3.3. Observations et notations Toutes les réactions cutanées et toutes les réactions inhabituelles résultant des phases d'induction et de déclenchement doivent être enregistrées et consignées dans le rapport. Des techniques, comme l'examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser des réactions douteuses ou des réponses masquées par une coloration de la peau par la substance à étudier. 1.6.2. Essai de Buehler 1.6.2.1. Préparation Des cobayes albinos jeunes et en bonne santé sont répartis selon les règles du hasard en lots traités et témoins. Avant d'administrer la substance, on tond et/ou on rase la région d'un des flancs des animaux en évitant d'érafler la peau. 1.6.2.2. Conditions de l'essai 1.6.2.2.1. Animaux d'expérience On utilise des souches de laboratoire courantes de cobayes albinos; les animaux doivent peser moins de 500 g. 1.6.2.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou de l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, celles-ci doivent être nullipares et non gravides. Un minimum de 20 animaux est utilisé pour le lot traité et au moins 10 pour le lot témoin. Si un plus petit nombre d'animaux est utilisé, il convient d'en justifier la raison. Si les résultats sont douteux, un examen histopathologique peut aider à décider si l'essai doit être répété avec un autre lot d'animaux. 1.6.2.2.3. Dose Pour chaque phase d'induction, la concentration de la substance à étudier est la concentration maximale qui peut être bien tolérée et qui, pour les substances irritantes, provoque une irritation faible à modérée chez la majorité des animaux d'expérience. La concentration de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale qui ne produit pas d'irritation cutanée chez les animaux non sensibilisés. Ces concentrations peuvent être déterminées par une étude pilote (deux ou trois animaux). 1.6.2.2.4. Période d'observation Durant la période d'induction, on surveille la peau des animaux afin de rechercher les effets irritants. Après l'exposition de déclenchement, les réactions cutanées sont enregistrées 24 et 48 heures après avoir enlevé la compresse recouvrant la substance à étudier, c'est-à-dire 30 et 54 heures après le début de l'application. 1.6.2.3. Mode opératoire Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai. La méthode comporte deux phases: 1.6.2.3.1. Induction Jour 0 - lot traité Un des flancs est débarrassé de ses poils. Un volume de 0,5 ml de substance à étudier dans un véhicule approprié (le choix du véhicule doit être justifié; au besoin, les liquides peuvent être appliqués directement) est versé sur un tampon de coton. Celui-ci est appliqué sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau au moyen d'une compresse occlusive ou d'une cupule et d'un pansement approprié pendant 6 heures. Jour 0 - lot témoin Un des flancs est débarrassé de ses poils. Le véhicule seul est appliqué de la même manière sur la zone d'essai. Il est maintenu en contact avec la peau par une compresse occlusive ou une cupule et un pansement approprié pendant 6 heures. 7 et 14èmes jour La même application qu'au jour 0 est effectuée sur la même zone d'essai (débarrassée de ses poils si nécessaire), le 7ème et le 14ème jour. 1.6.2.3.2. Déclenchement 28ème jour L'autre flanc des animaux traités et témoins est débarrassé de ses poils. Une compresse occlusive ou une cupule contenant 0,5 ml de substance à étudier est appliquée, à la concentration maximale non-irritante, sur la partie postérieure du flanc des animaux traités. Une compresse occlusive ou une cupule contenant le véhicule seul est également appliquée sur le partie antérieure du flanc. Les compresses occlusives sont maintenues au contact de la peau au moyen d'un pansement approprié pendant 6 heures. Le groupe témoin est exposé de la même manière. 29 et 30èmes jour - 21 heures après avoir enlevé la compresse, la zone de déclenchement est nettoyée et débarrassée des poils, si nécessaire, - trois heures plus tard (soit 30 heures après le début de l'application de déclenchement) on observe et on note la réaction cutanée, - 24 heures après cette observation (54 heures), on procède à une seconde observation que l'on note. 1.6.2.3.3. Observations et notations Toutes les réactions cutanées et toutes les réactions inhabituelles résultant des procédés d'induction et de déclenchement doivent être notées et consignées dans le rapport. Des techniques, comme l'examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané, peuvent être utilisées pour préciser des réactions douteuses ou des réponses masquées par une coloration de la peau par la substance à étudier. 2. DONNÉES (EMC et essai de Buehler) Les données doivent être récapitulées dans un tableau indiquant, pour chaque animal les réactions cutanées pour chaque observation. 3. RÉSULTATS (EMC et essai de Buehler) 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI (EMC et essai de Buehler) Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - souche de cobayes utilisée, - conditions expérimentales, véhicule et concentrations de la substance à étudier utilisés pour inductions et déclenchements, - nombre, âge et sexe des animaux, - poids de chaque animal au début et à la fin de l'essai, - toute observation effectuée sur chaque animal, y compris le système de notation, le cas échéant, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION (EMC et essai de Buehler) Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.7. TOXICITÉ À DOSES REPÉTÉES (28 JOURS) (ORALE) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La substance d'essai est administrée quotidiennement, par voie orale, à doses croissantes, à plusieurs lots d'animaux d'expérience, à raison d'une dose par lot durant une période de 28 jours. Pendant la période d'administration, les animaux sont observés chaque jour afin de déceler des effets toxiques. Les animaux qui meurent pendant l'essai ainsi que ceux qui survivent jusqu'à la fin de l'essai sont autopsiés. 1.5. CRITERE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au moins pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots d'expérience. Les substances d'essai peuvent être administrées dans la nourriture, par gavage, dans des capsules ou dans l'eau de boisson. Lesdoses doivent être administrées aux animaux de la même façon durant toute la durée de l'expérience. Si, pour faciliter l'administration, on utilise un véhicule ou d'autres additifs, ceux-ci doivent être réputés non toxiques et cela peut être étayé par des données publiées, si nécessaire. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce utilisée de préférence. Il faut utiliser des animaux jeunes et sains et une souche d'obtention facile au laboratoire, dans les conditions idéales, la substance doit commencer à être administrée avant que les rats n'atteignent l'âge de six semaines; ils ne doivent en aucun cas être âgés de plus de huit semaines. Au début de l'expérience, l'intervalle de variation de poids entre les animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés pour chaque dose. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacrifices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux par sexe). 1.6.2.3. Doses On utilise au moins trois doses et un témoin. Excepté l'administration de substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les animaux des lots d'expérience. Si l'on utilise un véhicule pour faciliter l'administration, ce véhicule sera administré aux témoins de la même manière qu'aux lots traités et le volume reçu correspondra à celui employé avec la dose la plus élevée. La dose la plus élevée doit être suffisamment forte pour produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La dose la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'exposition de l'homme, la dose la plus faible doit être supérieure à cette valeur. Dans les conditions idéales, la dose moyenne doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs doses intermédiaires, celles-ci doivent être suffisamment espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En cas de mortalité dans les lots correspondant aux doses faibles et intermédiaires, ainsi que dans le lot témoin, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable. Lorsque la substance d'essai est administrée dans la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (ppm ou mg/kg d'aliments) soit une dose constante, en rapport avec le poids corporel des animaux; la méthode choisie doit être précisée. Dans le cas d'une substance administrée par gavage, les doses doivent être administrées chaque jour au même moment. Les quantités administrées doivent être ajustées régulièrement (hebdomadaire ou bihebdomadaire) afin de conserver une dose constante par rapport au poids corporel de l'animal. 1.6.2.4. Essai «limite» Si une expérience de 28 jours effectuée d'après la méthode décrite ci-dessous, à une dose unique de 1 000 milligrammes par kilo de poids corporel par jour ou à une dose plus élevée, en fonction de l'exposition possible pour l'homme (lorsqu'on la connaît) ne révèle aucun effet toxique, il peut s'avérer inutile de réaliser d'autres essais. Lorsqu'il s'agit de substances faiblement toxiques, administrées avec le régime alimentaire, il est important de s'assurer que leur quantité ou leurs propriétés n'interfèrent pas avec les exigences nutritionnelles normales. 1.6.2.5. Période d'observation Tous les animaux doivent faire l'objet d'une observation quotidienne; les signes de toxicité ainsi que le moment de leur apparition, leur intensité et leur durée doivent être consignés. Le moment de la mort et le moment où les symptômes de toxicité apparaissent et disparaissent doivent être consignés. 1.6.3. Mode opératoire Dans les conditions idéales, la substance d'essai est administrée aux animaux 7 jours sur 7 durant une période de 28 jours. Les animaux de lots satellites prévus pour des observations de réversibilité d'effet doivent être gardés pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de déceler la régression ou la persistance des effets toxiques. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, ainsi que des systèmes respiratoire, circulatoire et nerveux, autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Des mesures hebdomadaires sur la consommation alimentaire (et la consommation d'eau lorsque la substance est administrée dans l'eau de boisson) et du poids des animaux doivent être effectués. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse des tissus ou erreur au cours de la remise en cage. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants appartenant aux lots traités, non satellites, sont autopsiés. Les animaux trouvés moribonds ou dans un état de détresse ou de douleur intenses au cours de l'essai doivent être immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins): 1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la concentration en hémoglobine, le dénombrement des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation; 2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamopyruvique) aspartate aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamo oxalo-acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines sériques totales. D'autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglobine, l'activité cholinestérasique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés. 1.6.3.1. Autopsie Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales et les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus (foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, coeur et tout autre organe présentant des lésions macroscopiques ou des modifications de leur volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue d'un éventuel examen histopathologique ultérieur. 1.6.3.2. Examen histopathologique Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le lot témoin, il faut pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présentés des lésions induites par la substance à tester à la dose la plus élevée, devront être examinés dans tous les lots exposés à toutes les doses inférieures. Les animaux de tous les lots satellites devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées dans les lots traités. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion. Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions de l'essai, - doses (avec, le cas échéant, le véhicule) et concentrations, - données concernant la réponse toxique par sexe et par dose, - dose sans effet, lorsque c'est possible, - indication du moment de la mort en cours d'expérience ou des survies au terme de l'expérience, - effets toxiques ou autres, - moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution de celui-ci, - données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids corporel, - examens hématologiques pratiqués et résultats complets, - examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets, - description détaillée de toutes les observations histopathologiques, - traitement statistique des résultats, s'il y a lieu, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.8. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (INHALATION) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Il est utile de disposer d'informations préliminaires sur la distribution de la taille des particules, la pression de vapeur, le point de fusion, le point d'ébullition, le point d'éclair et l'explosivité (si applicables) de la substance. Voir également l'introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Plusieurs lots d'animaux d'expérience sont exposés quotidiennement, pendant une période déterminée, à des concentrations croissantes de la substance à tester, une seule concentration étant utilisée par lot et ce, pendant une durée de 28 jours. Lorsqu'on utilise un véhicule en vue d'obtenir une concentration adéquate de la substance d'essai dans l'atmosphère, il y a lieu de prévoir un lot témoin pour le véhicule. Durant la période d'administration, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler les symptômes de toxicité. Les animaux qui meurent en cours d'expérience sont autopsiés de même que ceux qui sont encore en vie à l'issue de l'expérience. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au moins pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots requis. Au besoin un véhicule approprié peut être utilisé pour obtenir une concentration adéquate de substance dans l'atmosphère. Si l'on utilise un véhicule ou un autre additif pour faciliter l'administration, celui-ci doit être réputé non toxique et cela peut être étayé par des données publiées, si nécessaire. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience Sauf contre-indication, le rat est l'espèce utilisée de préférence. Il faut utiliser des animaux jeunes et sains d'une souche courante d'animaux de laboratoire. Au début de l'expérience, l'intervalle de variation de poids entre les animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés pour chaque lot. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacrifices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux par sexe). 1.6.2.3. Concentration d'exposition On utilise au moins trois concentrations ainsi qu'un témoin ou un lot témoin pour le véhicule (correspondant à la concentration de véhicule présente dans l'atmosphère inhalé par le groupe de traitement le plus élevé). Excepté l'exposition à la substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les sujets des lots d'expérience. La concentration la plus élevée doit être suffisamment forte pour produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La concentration la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'exposition de l'homme, la concentration la plus faible doit être supérieure à cette valeur. Dans les conditions idéales, la concentration intermédiaire doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs concentrations intermédiaires, celles-ci doivent être espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En cas de mortalité dans les lots à concentrations faibles et intermédiaires, ainsi que dans les lots témoins, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable. 1.6.2.4. Durée d'exposition L'exposition quotidienne doit être de 6 heures, mais d'autres durées peuvent se révéler nécessaires pour répondre à certaines exigences particulières. 1.6.2.5. Dispositif expérimental Les animaux doivent être exposés à la substance d'essai au moyen d'un dispositif d'exposition dynamique capable de maintenir un flux d'air continu permettant au moins 12 renouvellements de l'atmosphère de l'enceinte d'exposition par heure, et assurant une teneur en oxygène suffisante et une répartition uniforme du produit à tester dans l'air. Si l'on utilise une chambre d'exposition, celle-ci doit être conçue de manière à éviter autant que possible l'entassement des animaux et à optimiser l'exposition par inhalation à la substance d'essai. En règle générale, pour assurer la stabilité de l'atmosphère d'une chambre, le «volume» total des animaux d'expérience ne doit pas dépasser 5 % du volume de la chambre d'essai. On peut aussi avoir recours à un système d'exposition soit oro-nasal, soit de la tête seule, soit du corps entier en chambre individuelle; les deux premiers types d'exposition présentent l'avantage de limiter la pénétration de la substance d'essai par d'autres voies. 1.6.2.6. Période d'observation Les animaux d'expérience devront être observés quotidiennement, en vue de déceler les symptômes de toxicité, durant toute la période de traitement et de récupération. Le moment de la mort ainsi que celui auquel les symptômes de toxicité apparaissent et disparaissent doivent être notées. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux sont quotidiennement exposés à la substance à tester à raison de 5 à 7 jours par semaine pendant une période de 28 jours. Les animaux de tout groupe satellite destiné à des observations de réversibilité d'effet doivent être gardés en vie pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de déceler la régression ou la persistance des effets toxiques. La température à laquelle s'effectue l'essai doit être maintenue à 22 C ±3 C. Dans les conditions idéales, l'humidité relative doit être maintenue entre 30 et 70 % mais, dans certains cas, cela peut se révéler impossible (par exemple, essai de certains aérosols). Le maintien d'une pression légèrement négative à l'intérieur de la chambre (≤ 5 mm d'eau) empêchera la fuite de substance d'essai vers l'extérieur. La nourriture et l'eau doivent être retirées pendant l'exposition. Il y a lieu d'utiliser un système d'inhalation qui fonctionne dans des conditions dynamiques comportant un dispositif approprié de contrôle analytique de la concentration. Pour établir les concentrations d'exposition appropriées, il est recommandé de procéder à un essai préliminaire. Le débit devra être réglé ajusté pour assurer des concentrations homogènes dans toute la chambre. Le système doit permettre d'obtenir des conditions d'exposition stables aussi rapidement que possible. Il y a lieu de mesurer ou de contrôler: a) le débit d'air (en permanence). b) la concentration réelle de la substance d'essai. Elle doit être mesurée dans la zone de respiration; pendant la période d'exposition quotidienne, la concentration ne doit pas varier de plus de ± 15 % par rapport à la valeur moyenne. Toutefois, dans le cas de certains aérosols, ce degré de contrôle peut ne pas être obtenu et un écart plus grand est alors acceptable. Durant toute la durée de l'étude, il faut garder les concentrations aussi constantes que possible d'un jour à l'autre. En ce qui concerne les aérosols, la taille des particules doit être analysée au moins une fois par semaine pour chaque groupe d'exposition. c) la température et l'humidité, en permanence si possible. Les observations ont lieu pendant et après l'exposition et sont notées systématiquement; une fiche individuelle doit être établie pour chaque animal. Tous les animaux doivent être observés quotidiennement et les signes de toxicité, y compris leur moment d'apparition, leur intensité et leur durée doivent être enregistrés. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Les animaux sont pesés toutes les semaines. Il est aussi recommandé d'effectuer des mesures hebdomadaires sur la consommation alimentaire. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse des tissus ou erreur au cours des remises en cage. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants, appartenant aux lots traités, non satellites, sont autopsiés. Les animaux trouvés moribonds ou dans un état de détresse ou de douleur intenses au cours de l'essai doivent être immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins): 1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la concentration en hémoglobine, le dénombrement des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation; 2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamopyruvique) aspartate aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamo oxalo-acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines sériques totales. Les autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglobine et l'activité cholinestérasique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés. 1.6.3.1. Autopsie Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie macroscopique. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales, les poumons et les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus (système respiratoire, foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, coeur et tout autre organe présentant des lésions macroscopiques ou des modifications de leur volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue éventuels d'examens histopathologiques ultérieurs. Les poumons doivent être prélevés entiers, pesés et traités au moyen d'un fixateur approprié permettant de conserver la structure pulmonaire intacte. 1.6.3.2. Examen histopathologique Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le(s) lot(s) témoin(s), il faut pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et des tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présenté des lésions induites par la substance à tester au niveau à la dose la plus élevée, devront être examinés dans tous les lots exposés à toutes les doses inférieures. Les animaux de tout lot satellite devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées dans les autres lots traités. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion. Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc., - conditions de l'essai: Description du dispositif d'inhalation, y compris conception, type, dimensions, source d'air, système de génération d'aérosols, méthode de conditionnement d'air, traitement de l'atmosphère rejetée hors de l'enceinte et, le cas échéant, modalités d'hébergement des animaux en chambre d'essai. L'équipement de mesure de température, d'humidité et, s'il y a lieu, de la stabilité des concentrations des aérosols ou de la distribution de taille des particules doit être décrit. Données relatives à l'exposition: elles doivent être représentées sous la forme de tableaux indiquant des valeurs moyennes ainsi qu'une mesure de la variabilité (par exemple, écart type); elles doivent, si possible, inclure: a) les débits d'air dans le dispositif d'inhalation, b) la température et l'humidité de l'air, c) les concentrations nominales (quantité totale de substance d'essai introduite dans le dispositif d'inhalation, divisée par le volume d'air), d) le cas échéant, nature du véhicule, e) concentrations réelles dans la zone de respiration, f) le diamètre aérodynamique médian en masse (DAMM) et l'écart-type géométrique (ETG), - données concernant la réponse toxique par sexe et par concentration, - moment de la mort en cours d'expérience ou indication que les animaux ont survécu à l'expérience, - description des effets toxiques ou autres; concentration sans effet, - moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution de celui-ci, - données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids corporel, - examens hématologiques pratiqués et résultats complets, - examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets, - résultats d'autopsie, - description détaillée de tous les résultats histopathologiques, - traitement statistique des résultats, si possible, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.9. TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES (28 JOURS) (ADMINISTRATION CUTANÉE) 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point B). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI La substance à tester est appliquée quotidiennement, à doses croissantes, sur la peau de plusieurs lots d'animaux d'expérience pendant une période déterminée, à raison d'une seule dose par lot, pendant une durée de 28 jours. Durant la période d'application, les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler les signes de toxicité. Les animaux qui meurent en cours d'expérience ainsi que ceux qui sont encore en vie à l'issue de l'expérience sont autopsiés. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparation Les animaux sont maintenus dans des conditions d'hébergement et d'alimentation propres à l'expérience au minimum pendant les 5 jours qui la précèdent. Avant l'expérience, des animaux jeunes et sains sont répartis selon les règles du hasard entre les différents lots témoins et traités. Peu de temps avant l'essai, on tond la région dorsale du tronc des animaux. On peut avoir recours au rasage mais, dans ce cas, l'opération doit être effectuée 24 heures environ avant l'essai. Il est en général nécessaire de répéter les opérations de tonte ou de rasage à des intervalles d'une semaine environ, en évitant toute lésion de la peau. La surface à préparer pour l'application de la substance ne doit pas être inférieure à 10 % de la surface corporelle. Le poids de l'animal doit être pris en considération pour décider de la taille de la zone à épiler, et de la dimension de la surface à traiter. Lorsque le test concerne des substances solides qui, le cas échéant, peuvent être pulvérisées, la substance à tester doit être humectée au moyen d'eau ou, au besoin, d'un véhicule approprié, de manière à garantir un bon contact avec la peau. Les substances liquides sont généralement appliquées non diluées. On procède à une application quotidienne à raison de 5 à 7 jours par semaine. 1.6.2. Conditions de l'essai 1.6.2.1. Animaux d'expérience On peut utiliser des rats, des lapins ou des cobayes adultes. On peut également utiliser d'autres espèces, mais il faut dans ce cas en justifier l'utilisation. Au début de l'essai, l'intervalle de variation du poids des animaux utilisés ne doit pas excéder ± 20 % de la valeur moyenne requise. 1.6.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (cinq femelles et cinq mâles), à la peau saine, sont utilisés pour chaque dose. Les femelles doivent être nullipares et non-gravides. S'il est prévu dans le protocole expérimental des sacrifices intermédiaires en cours d'expérience, il y a lieu d'ajouter la quantité d'animaux nécessaire pour ces sacrifices. De plus, un lot satellite de 10 animaux (5 par sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et faire l'objet d'une observation relative à la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive d'effets toxiques durant les 14 jours qui suivent l'arrêt du traitement. On utilise aussi un lot satellite témoin de 10 animaux (cinq animaux par sexe). 1.6.2.3. Doses On utilise au moins trois doses ainsi qu'un lot témoin ou, le cas échéant, un lot témoin traité avec le véhicule. La période d'exposition devra être d'au moins 6 heures par jour. La substance à tester doit être appliquée chaque jour au même moment et les quantités à administrer doivent faire l'objet d'une adaptation régulière (hebdomadaire ou bihebdomadaire) afin de conserver un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux. Excepté l'administration de substance d'essai, les animaux du lot témoin doivent être traités de la même manière que les animaux des lots d'expérience. Lorsqu'un véhicule est utilisé pour faciliter l'administration, celui-ci sera administré au lot témoin dans les mêmes conditions qu'aux lots traités et la quantité de véhicule correspondra à celle reçue par le groupe traité avec la dose de substance d'essai la plus élevée. La dose la plus élevée doit être suffisamment forte pour produire des effets toxiques mais sans toutefois entraîner la mort (ou rarement). La dose la plus faible ne doit faire apparaître aucun effet toxique. Lorsque l'on dispose d'une estimation concernant l'exposition de l'homme, la dose la plus faible doit être supérieure à cette valeur. Dans les conditions idéales, la concentration intermédiaire doit produire des effets toxiques minimaux observables. Si l'on utilise plusieurs concentrations intermédiaires, celles-ci doivent être espacées de façon à entraîner une gradation des effets toxiques. En cas de mortalité dans les lots recevant les doses faibles et intermédiaires, ainsi que dans les lots témoins, celle-ci devra être minime pour que l'évaluation des résultats soit valable. Si l'application de la substance d'essai provoque une irritation cutanée grave, les concentrations doivent être réduites, ce qui peut entraîner une diminution, voire une disparition, des autres effets toxiques à la dose la plus élevée. De plus, si les lésions cutanées sont très graves, il peut se révéler nécessaire d'arrêter l'expérience et de la recommencer avec des concentrations plus faibles. 1.6.2.4. Essai «limite» Si une expérience préliminaire réalisée avec une dose de 1 000 mg/kg de poids corporel ou avec une dose plus élevée en fonction de l'exposition possible pour l'homme, n'a provoqué aucun effet toxique, il peut s'avérer inutile de poursuivre l'expérience. 1.6.2.5. Période d'observation Les animaux d'expérience doivent faire l'objet d'une observation quotidienne afin de déceler les symptômes d'intoxication. Le moment où les symptômes d'intoxication apparaissent et disparaissent ainsi que le moment de la mort doivent être consignés. 1.6.3. Mode opératoire Les animaux doivent être placés dans des cages individuelles. Dans les conditions idéales, la substance d'essai est administrée aux animaux 7 jours sur 7, pendant une période de 28 jours. Les animaux de tous les lots satellites destinés à des observations complémentaires doivent être gardés en vie pendant 14 jours encore, sans traitement, afin de constater la régression ou la persistance des effets toxiques. La durée de l'exposition doit être au moins de 6 heures par jour. La substance d'essai doit être appliquée uniformément sur une surface représentant environ 10 % de la surface corporelle totale mais lorsqu'il s'agit de substances hautement toxiques, la surface couverte peut être réduite. La couche de substance doit être aussi mince et uniforme que possible. Durant l'exposition, la substance d'essai est maintenue en contact avec la peau au moyen d'une compresse de gaze poreuse et d'un sparadrap non irritant. La surface traitée doit, en outre, être convenablement couverte de manière à maintenir en place le pansement de gaze et la substance d'essai et de manière à éviter que les animaux puissent ingérer la substance à tester. Des appareils de contention peuvent être utilisés pour empêcher l'ingestion de la substance mais une immobilisation complète n'est pas recommandée. Il est également possible d'utiliser la technique du «collier de protection». A l'issue de la période d'exposition, il faut, si possible, éliminer la substance résiduelle avec de l'eau ou par tout autre procédé adéquat de nettoyage de la peau. Tous les animaux doivent être observés quotidiennement et les signes de toxicité ainsi que le moment de leur apparition, leur intensité et leur durée doivent être notés. Les observations doivent concerner les modifications de la peau et des poils, des yeux, des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire ainsi que des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Les animaux doivent être pesés chaque semaine. Il est également recommandé d'effectuer des mesures hebdomadaires sur la consommation alimentaire des animaux. Il est nécessaire d'observer régulièrement les animaux afin de veiller à ce que, dans la mesure du possible, ceux-ci ne soient pas perdus pour l'expérience pour des raisons telles que cannibalisme, autolyse des tissus au cours des remises en cages. A l'issue de l'expérience, tous les animaux survivants appartenant aux lots traités, non satellites, sont autopsiés. Les animaux moribonds et les animaux dans un état de détresse ou de douleur intenses doivent être immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés. Les examens figurant ci-après seront effectués à l'issue de la période d'essai sur tous les animaux (y compris les témoins): 1. examen hématologique comprenant au moins l'hématocrite, la concentration en hémoglobine, le dénombrement des érythrocytes et des leucocytes, la formule leucocytaire ainsi qu'une étude de la coagulation; 2. examen biochimique clinique du sang comprenant au moins un paramètre des fonctions hépatiques et rénales: alanine aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutamopyruvique), aspartate aminotransférase sérique (anciennement connue sous le nom de transaminase glutano oxalo-acétique), urée, albumine, créatinine, bilirubine totale et protéines sériques totales. D'autres déterminations éventuellement nécessaires à une évaluation toxicologique adéquate concernent le calcium, le phosphore, les chlorures, le sodium, le potassium, la glycémie à jeun, l'analyse des lipides, les hormones, l'équilibre acido-basique, la méthémoglobine, l'activité cholinestérasique. D'autres analyses biochimiques cliniques peuvent, si nécessaire, être effectuées pour approfondir l'étude des effets observés. 1.6.4. Autopsie Tous les animaux soumis à l'essai doivent faire l'objet d'une autopsie macroscopique. Au moins le foie, les reins, les glandes surrénales et les testicules doivent être pesés à l'état humide le plus rapidement possible après la dissection afin d'éviter le dessèchement. Organes et tissus, à savoir, peau normale et traitée, foie, reins, rate, testicules, glandes surrénales, coeur et les organes-cibles (c'est-à-dire ceux qui présentent des lésions importantes ou des modifications de leur volume) doivent être conservés dans un milieu approprié en vue d'éventuels examens histopathologiques ultérieurs. 1.6.5. Examen histopathologique Pour le lot exposé à la dose la plus élevée et le lot témoin, il faut pratiquer un examen histologique systématique de tous les organes et des tissus conservés. Les organes et tissus qui auront présenté des lésions attribuables à la substance à tester à la dose la plus élevée devront être examinés dans tous les lots ayant été exposés à des doses plus faibles. Les animaux de tout lot satellite devront faire l'objet d'un examen histologique particulièrement axé sur les organes et les tissus pour lesquels les lésions ont été constatées dans les lots traités. 2. DONNÉES Les données doivent être récapitulées sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux au début de l'essai et le nombre d'animaux présentant chaque type de lésion. Tous les résultats observés doivent être évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée. Toute méthode statistique reconnue peut être utilisée. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - données concernant les animaux (espèce, souche, origine, conditions ambiantes, régime alimentaire, etc.), - conditions de l'essai, (y compris le type de pansement: occlusif ou non-occlusif), - doses (avec, le cas échéant, le véhicule) et concentrations, - dose sans effet, lorsque c'est possible, - données relatives à la réponse toxique par sexe et par dose, - indication du moment de la mort en cours d'expérience ou des survies au terme de l'expérience, - effets toxiques ou autres, - moment de l'observation de tout symptôme anormal et évolution de celui-ci, - données relatives à la prise de nourriture et à l'évolution du poids corporel, - examens hématologiques pratiqués et résultats complets, - examens biochimiques cliniques pratiqués et résultats complets, - résultats d'autopsie, - description détaillée de tous les résultats histopathologiques, - traitement statistique des résultats, si possible, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.10. ESSAI DE CYTOGÉNÉTIQUE «IN VITRO» SUR MAMMIFÈRE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point C). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI L'essai de cytogénétique in vitro est un essai de mutagénicité à court terme destiné à déceler des aberrations chromosomiques structurales dans des cellules mammifères en culture. Des cultures de lignées cellulaires établies ainsi que des cultures de cellules primaires peuvent être utilisées. Après exposition aux produits chimiques à tester, en présence et en absence d'un système d'activation métabolique approprié, les cultures cellulaires sont traitées par des inhibiteurs du fuseau mitotique, comme la colchicine afin de bloquer les cellules dans une phase de la mitose de type métaphase (c-métaphase). Les cellules sont récoltées à des moments adéquats et des préparations de chromosomes sont effectuées. Ces dernières sont colorées et les anomalies chromosomiques sont recherchées dans les cellules en métaphase. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI 1.6.1. Préparations 1.6.1.1. Cellules On utilise des lignées cellulaires établies ou des cultures de cellules primaires, par exemple des cellules de hamster chinois ou des lymphocytes humains. Les produits chimiques à étudier sont préparés dans un milieu de culture ou dissous dans des véhicules appropriés avant le traitement des cellules. 1.6.1.2. Système d'activation métabolique Des cellules doivent être exposées à la substance à étudier à la fois en présence et en l'absence d'un système d'activation métabolique approprié. Le système le plus couramment utilisé est la fraction postmitochondriale enrichie en cofacteurs, préparée à partir de foie de rongeurs traités avec des agents inducteurs enzymatiques. 1.6.2. Conditions expérimentales Nombre de cultures: Deux cultures au moins sont utilisées pour chaque point expérimental. Utilisation de témoins négatifs et positifs: Le solvant (lorsque le solvant n'est pas le milieu de culture ou l'eau), le mélange d'activation d'enzymes hépatiques, le mélange d'activation d'enzymes hépatiques avec le solvant, ainsi que les témoins non traités sont utilisés comme témoins négatifs. Un témoin positif est inclus dans chaque expérience. Lorsque le mélange d'activation métabolique est employé, une substance dont on sait qu'elle nécessite une activation métabolique est utilisée comme témoin positif. Concentration: On utilise au moins 3 concentrations de la substance à étudier sur un intervalle d'un logarithme au moins. La concentration la plus élevée doit réduire l'activité mitotique d'environ 50 % ou présenter un autre signe de cytotoxicité. Si la substance à étudier n'est pas toxique, il convient de pratiquer des essais jusqu'à la limite de solubilité ou jusqu'à une concentration maximale de 5 mg/ml. Conditions de culture: Un milieu de culture et des conditions d'incubation (par exemple, température, flacon de culture, concentration en CO2 et humidité) appropriés sont utilisés. 1.6.3. Mode opératoire 1.6.3.1. Préparation des cultures Lignées cellulaires établies: les cellules sont obtenues à partir de cultures mères (par exemple par trypsinisation ou par agitation vigoureuse), ensemencées dans des flacons de culture à une densité adéquate et incubées à 37 C. Lymphocytes humains: le sang total hépariné est ajouté au milieu de culture contenant de la phytohémagglutinine, du sérum de veau foetal et des antibiotiques, puis incubé à 37 C. 1.6.3.2. Traitement des cultures avec la substance à étudier (i) traitement sans mélange d'activation métabolique hépatique Tous les traitements doivent, si possible, couvrir au moins la durée d'un cycle cellulaire complet, et les schémas de fixation doivent garantir l'analyse des cellules de première mitose après le traitement à différents stades du cycle. Lorsque le traitement ne couvre pas la durée d'un cycle cellulaire complet, on choisit des temps de fixation de manière à prélever des échantillons de cellules qui se trouvaient à différents stades du cycle au moment du traitement, c'est-à-dire en phase G1, S et G2. Le produit à tester est ajouté aux cultures de lignées cellulaires établies lorsque celles-ci se trouvent en phase de croissance exponentielle. Les cultures de lymphocytes humains sont traitées alors qu'elles sont dans un état semi-synchrone. (ii) Traitement avec le mélange d'activation métabolique hépatique Le mélange substance à étudier-système d'activation doit être présent aussi longtemps que possible sans exercer un effet toxique sur les cellules. Si, pour des raisons de toxicité, ce traitement ne couvre pas la durée d'un cycle cellulaire complet, on choisit des temps de fixation permettant de prélever des cellules qui se trouvaient à des stades différents du cycle cellulaire au moment du traitement, c'est-à-dire en phase G1, S et G2. Récolte des cellules Les cultures cellulaires sont traitées avec un inhibiteur du fuseau mitotique pendant une période appropriée avant leur récolte. Chaque culture est récoltée et traitée séparément pour la préparation des chromosomes. Il faut au moins deux temps de récolte, et il est conseillé d'en choisir un correspondant à la fin du premier cycle cellulaire et un autre plus tard. On est sûr de couvrir ainsi tous les stades du cycle cellulaire et on tient compte du retard du cycle cellulaire. 1.6.3.3. Préparation des chromosomes Les préparations de chromosomes comportent: traitement hypotonique des cellules, fixation, étalement sur lames et coloration. Analyse: Pour chaque culture, au moins 100 métaphases correctement étalées sont analysées pour déceler les aberrations chromosomiques. Les lames sont codées avant l'analyse. Pour les lymphocytes humains, seules les métaphases contenant 46 centromères sont analysées. Pour les lignées cellulaires continues, seules les métaphases contenant le nombre modal de centromères ± 2 sont analysées. De plus, l'indice mitotique ou un autre signe de cytotoxicité, s'il y a lieu, doit être estimé au cours de l'essai, pour chaque concentration. 2. DONNÉES Les données sont présentées sous forme de tableau. Les aberrations de type chromatidien (lacunes, cassures, échanges), les aberrations de type chromosomique (par exemple lacunes, cassures, minutes, anneaux, dicentriques, polycentriques) ainsi que le nombre de métaphases anormales (lacunes comprises et exclues) sont notées séparément pour toutes les cultures traitées et témoins. Les données sont évaluées à l'aide de méthodes statistiques appropriées. Les résultats des essais doivent être comparés avec les témoins négatifs effectués parallèlement. Au moins deux expériences indépendantes sont réalisées. Toutefois, une seule expérience peut être suffisante, à condition de pouvoir le justifier scientifiquement. Il n'est pas nécessaire d'effectuer la seconde expérience de la même manière que la première. Il peut même être préférable de modifier certains paramètres de l'essai afin d'obtenir davantage de données utiles. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - cellules utilisées, - conditions expérimentales: composition du milieu, concentration en CO2, température d'incubation, durée d'incubation, doses, moment du traitement, durée du traitement avec l'inhibiteur du fuseau mitotique et concentration de celui-ci, type du mélange d'activation d'enzymes hépatiques utilisé, témoins positifs et négatifs, - nombre de cultures cellulaires, - nombre de métaphases analysées (données indiquées séparément pour chaque culture), - indice mitotique ou autre signe de cytotoxicité, - type et nombre d'aberrations indiquées séparément pour chaque culture traitée et témoin, nombre modal de chromosomes dans les lignées cellulaires établies utilisées, - évaluation statistique, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.11. ESSAI DE CYTOGÉNÉTIQUE IN VIVO SUR LA MOELLE OSSEUSE DE MAMMIFÈRE - ANALYSE CHROMOSOMIQUE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point C). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'essai de cytogénétique in vivo est un essai de mutagénicité à court terme destiné à déceler les aberrations chromosomiques structurales. Celles-ci sont généralement évaluées au cours de la première mitose consécutive au traitement. Avec les agents mutagènes chimiques, la plupart des aberrations induites sont de type chromatidien. Dans cette méthode, on utilise la moelle osseuse de mammifères exposés, par des voies appropriées, aux substances d'essai et sacrifiés à des intervalles successifs. Avant d'être sacrifiés, les animaux sont traités avec un inhibiteur de la formation du fuseau, tel que la colchicine, afin de bloquer les cellules en phase mitotique de type métaphase (c-métaphase). A partir de ces cellules, des préparations de chromosomes sont effectuées, sèchées à l'air, puis colorées; les métaphases sont ensuite analysées au microscope afin de déceler les aberrations chromosomiques. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Néant 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparations Les produits à étudier sont dissous dans une solution physiologique. S'il s'agit de substances insolubles, elles sont dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. Des solutions de la substance d'essai fraîchement préparées sont utilisées. Si un véhicule est utilisé pour faciliter l'administration, il ne doit ni interférer avec la substance d'essai ni produire des effets toxiques. 1.6.2. Conditions expérimentales 1.6.2.1. Animaux On utilise des rongeurs tels que le rat, la souris ou le hamster chinois. Des animaux adultes, jeunes et sains, sont répartis au hasard en lots traités et lots témoins. 1.6.2.2. Nombre et sexe Au moins cinq femelles et cinq mâles sont utilisés pour chaque lot expérimental et chaque lot témoin. Dix animaux seront donc sacrifiés par intervalle de temps et par lot, si le protocole expérimental comporte plusieurs temps de récolte après le traitement. Pour le lot témoin positif, un seul temps suffit. 1.6.2.3. Voie d'administration En général, les substances à étudier doivent être administrées en une seule fois. En fonction des informations toxicologiques dont on dispose, un schéma d'administration répétée peut être utilisé. Toutefois, il ne peut l'être que si la substance soumise à l'essai n'a pas d'effet cytotoxique sur la moelle osseuse. L'administration se fait généralement par voie orale ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies d'administration peuvent être appropriées. 1.6.2.4. Utilisation de témoins positifs et négatifs Une substance qui est connue pour produire des aberrations chromosomiques in vivo est utilisée comme témoin positif et un lot témoin négatif (solvant) est généralement inclus dans le schéma de chaque expérience. 1.6.2.5. Doses Pour le dossier de base, on utilise une dose de la substance d'essai, à savoir la dose maximale tolérée ou celle faisant apparaître des signes de cytotoxicité (par exemple une inhibition partielle de mitoses). Pour les substances «non toxiques», la dose maximale (limite) à étudier est la dose unique de 2 000 mg/kg de poids corporel. Si l'on suit un schéma d'administration répétée, la dose limite est de 1 000 mg/kg de poids corporel par jour. Des doses supplémentaires peuvent être utilisées lorsqu'elles sont indiquées pour des raisons scientifiques. Si l'essai sert de méthode de vérification, il y a lieu d'utiliser au moins deux doses supplémentaires. 1.6.3. Mode opératoire L'essai peut être réalisé de deux manières: (i) La substance est administrée une fois aux animaux, à la dose maximale tolérée. Dans un premier temps, des échantillons sont prélevés 24 heures après le traitement. Si, à ce stade, les résultats sont clairement positifs il peut être inutile de poursuivre l'essai. Par contre, si les résultats sont négatifs ou douteux, il y a lieu d'effectuer un prélèvement antérieur et un prélèvement postérieur, à intervalles appropriés, dans l'intervalle de 6 à 48 heures suivant l'administration, puisque la cinétique du cycle cellulaire peut être influencée par la substance d'essai. Lorsque des doses supplémentaires sont utilisées, il faut prélever les échantillons à la période de sensibilité maximale ou, si celle-ci n'est pas connue, 24 heures après le traitement. (ii) Si les données pharmaco-cinétiques et métaboliques indiquent un programme de traitement répété, une administration répétée peut être utilisée; les échantillons doivent être prélevés 6 et 24 heures après le dernier traitement. Préparation de la moelle osseuse Avant de sacrifier les animaux, on leur injecte, par voie intrapéritonéale, une dose appropriée d'un inhibiteur du fuseau afin d'obtenir un nombre de cellules adéquat en c-métaphase. La moelle osseuse est prélevée, par rinçage à l'aide d'une solution isotonique, à partir des deux fémurs des animaux récemment sacrifiés. Après un traitement hypotonique approprié, les cellules sont fixées puis étalées sur des lames. Après séchage à l'air, les lames sont colorées. Analyse Les lames sont codées avant d'être analysées au microscope. Au moins 50 métaphases correctement étalées comportant le nombre complet de centromères sont analysées par animal en vue de déceler les aberrations chromosomiques structurales. En outre, les indices mitotiques peuvent être établis pour chaque animal. 2. DONNÉES Les données sont présentées sous forme de tableau. Les aberrations de type chromatidien, et de type isochromatidien (lacunes, cassures, échanges) ainsi que les indices mitotiques, lorsqu'ils sont établis, sont consignés séparément pour toutes les cultures traitées et témoins. Les valeurs moyennes et les écarts types sont également enregistrés pour chaque lot expérimental et chaque lot témoin. Les données sont évaluées à l'aide de méthodes statistiques appropriées. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche et âge des animaux utilisés - nombre d'animaux de chaque sexe dans les lots traités et les lots témoins, - conditions expérimentales: description détaillée du programme de traitement et de prélèvement, doses, durée du traitement avec l'inhibiteur du fuseau et concentration de celui-ci, - nombre de métaphases analysées par animal, - indices mitotiques, lorsqu'ils sont établis, - type et nombre d'aberrations indiquées séparément pour chaque animal traité et témoin, - signes d'intoxication au cours de l'étude, - évaluation statistique, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.12. ESSAI DU MICRONOYAU 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point C). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'essai du micronoyau est un essai in vivo à court terme sur mammifère destiné à déceler des lésions chromosomiques ou de l'appareil mitotique induites par des substances chimiques. Cet essai est basé sur une augmentation du nombre de micronoyaux dans les érythrocytes polychromatophiles des animaux traités par rapport aux animaux témoins. Les micronoyaux sont formés de fragments de chromosomes ou de chromosomes entiers perdus lors de la mitose. Lorsque les érythroblastes se transforment en érythrocytes, le noyau principal est expulsé tandis que le micronoyau peut rester dans le cytoplasme. Pour cet essai, on utilise des érythrocytes polychromatophiles jeunes provenant de la moelle osseuse de mammifères de laboratoire ayant été exposés, par des voies appropriées, à la substance d'essai. Après extraction de la moelle osseuse, des frottis sont préparés et colorés. On compte au microscope le nombre de micronoyaux présents dans les érythrocytes polychromatophiles et on établit le rapport entre érythrocytes polychromatophiles et normophiles. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparation Les produits chimiques à étudier sont dissous dans une solution isotonique. S'il s'agit de substances insolubles, elles sont dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. Si un véhicule est utilisé, il ne doit pas interférer avec la substance à étudier ni produire des effets toxiques. Normalement, des solutions de la substance d'essai fraîchement préparées sont utilisées. 1.6.2. Conditions expérimentales 1.6.2.1. Animaux d'expérience Il est recommandé d'utiliser des souris, mais d'autres mammifères peuvent être utilisés. Des animaux adultes, jeunes et sains sont répartis au hasard en lots traités et lots témoins. 1.6.2.2. Nombre et sexe Au moins cinq femelles et cinq mâles sont utilisés pour chaque lot expérimental et chaque lot témoin. Dix animaux seront donc sacrifiés par temps et par lot, si le protocole expérimental comporte plusieurs temps de prélèvement après le traitement. Pour le groupe témoin positif, un seul temps de prélèvement suffit. 1.6.2.3. Voie d'administration En général, les substances à étudier ne doivent être administrées qu'une fois. En fonction des informations toxicologiques dont on dispose, un programme d'administration répétée peut être utilisé. Toutefois, il ne peut l'être que si la substance à étudier n'a pas d'effet cytotoxique sur la moelle osseuse. L'administration se fait généralement par voie orale ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies d'administration peuvent être appropriées. 1.6.2.4. Utilisation de témoins négatifs et positifs Des témoins positifs, de même que des témoins négatifs (solvants) doivent être utilisés pour chaque expérience. 1.6.2.5. Doses Pour le dossier de base, on utilise une dose de la substance d'essai, à savoir la dose maximale tolérée ou celle faisant apparaître certains signes de cytotoxicité, par exemple une modification du rapport entre érythrocytes polychromatophiles et érythrocytes normophiles. Pour les substances «non-toxiques», la dose maximale (limite) à étudier par administration d'une dose unique est de 2 000 mg/kg de poids corporel. Si l'on suit un programme d'administration répétée, la dose limite est de 1 000 mg/kg de poids corporel par jour. D'autres doses peuvent être utilisées lorsqu'elles sont indiquées pour des raisons scientifiques. Si l'essai sert de méthode de vérification, il y a lieu d'utiliser au moins deux doses supplémentaires. 1.6.3. Mode opératoire L'essai peut être réalisé de deux manières: (i) La substance est administrée en une seule fois aux animaux. Les prélèvements d'échantillons doivent être effectués au moment correspondant à la réponse maximale de l'essai qui varie selon la substance d'essai. C'est pourquoi les prélèvements de moelle osseuse sont effectués à deux reprises au moins, au moins 12 heures après le traitement sans aller au-delà de 48 heures. Lorsque des doses supplémentaires sont utilisées, il convient de prélever les échantillons à la période de sensibilité maximale ou, si celle-ci n'est pas connue, 24 heures après le traitement. (ii) Si des informations pharmaco-cinétiques et métaboliques nécessitent un schéma de traitement répété, une administration répétée peut être employée et les échantillons doivent être prélevés une fois, au moins 12 heures après le dernier traitement. Préparation de la moelle osseuse La moelle osseuse est prélevée dans les deux fémurs d'animaux récemment sacrifiés, par rinçage, à l'aide de sérum de veau foetal. Les cellules sont centrifugées et le surnageant est éliminé. Des gouttes de la suspension cellulaire homogènes sont déposées et étalées en frottis sur des lames. Après séchage à l'air, les lames sont colorées. Analyse Les lames sont codées avant d'être analysées au microscope. On recherche la présence de micronoyaux dans au moins 1 000 érythrocytes polychromatophiles par animal. Le rapport entre érythrocytes normophiles et polychromatophiles est déterminé, pour chaque animal, par comptage d'un nombre total de 1 000 érythrocytes. 2. DONNÉES Les données sont présentées sous forme de tableau. Le nombre d'érythrocytes polychromatophiles, le nombre d'érythrocytes polychromatophiles comportant des micronoyaux ainsi que le pourcentage de cellules micronuclées sont enregistrés séparément pour chaque animal traité et chaque animal témoin ainsi que le rapport entre érythrocytes normophiles et polychromatophiles. Les moyennes et les écart-types sont également consignées pour chaque lot expérimental et chaque lot témoin. Les données sont évaluées à l'aide de méthodes statistiques appropriées. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - espèce, souche et âge des animaux utilisés, - nombre d'animaux de chaque sexe dans les lots traités et les lots témoins, - conditions expérimentales: description détaillée du programme de traitement et de prélèvement, doses, données relatives à la toxicité, témoins négatifs et positifs, - critères de dénombrement des micronoyaux, - relation dose-effet, si possible, - évaluation statistique, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.13. ESSAI DE MUTATION RÉVERSÉ SUR ESCHERICHIA COLI 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point C). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Néant. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le système de réversion du tryptophane (trp) d'Escherichia Coli est un essai microbien permettant de mesurer la réversion trp . trp+ due à des substances chimiques responsables de substitutions de bases au niveau du génome bactérien. Les bactéries sont exposées aux substances d'essai avec ou sans activation métabolique. Après une période d'incubation adéquate sur milieu minimal, on compte les colonies révertantes et on compare le nombre obtenu à celui des révertants spontanés observés dans une culture témoin non traitée et/ou en présence du solvant. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Néant. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE L'essai peut être réalisé par les méthodes suivantes: 1) la méthode de préincubation et 2) la méthode d'incorporation directe où les bactéries et la substance d'essai sont mélangées à la gélose de surface et réparties à la surface d'une boîte de gélose sélective. 1.6.1. Préparation 1.6.1.1. Bactéries Les bactéries sont cultivées à 37 C jusqu'à la fin de la phase exponentielle ou jusqu'au début de la phase stationnaire de croissance. La densité cellulaire approximative doit être de 108-109 cellules par millilitre. 1.6.1.2. Activation métabolique Les bactéries doivent être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un mélange d'activation adéquat.Le système le plus fréquemment utilisé est la fraction post-mitochondriale supplée de cofacteurs préparée à partir de foie de rongeurs traités avec des inducteurs enzymatiques. 1.6.2. Conditions expérimentales 1.6.2.1. Souches bactériennes Trois souches, à savoir WP2, WP2 uvr A et WP2 uvr A pKM 101, doivent être utilisées. Il y a lieu d'utiliser des méthodes reconnues pour la préparation et la conservation des cultures. Les exigences de la croissance et l'identité génétique des souches, leur sensibilité aux rayons UV ou à la mytomycine C ainsi que la résistance à l'ampicilline dans le cas de la souche WP2 uvr A pKM 101 doivent être vérifiées. Les souches doivent également produire des révertants dans les gammes de fréquence escomptées. 1.6.2.2. Milieux On utilise un milieu approprié à l'expression et la sélection des mutants ainsi qu'une gélose de surface adéquate. 1.6.2.3. Utilisation de témoins négatifs et positifs On doit utiliser en parallèle des témoins non traités et des témoins en présence de solvants. Des témoins positifs doivent également être réalisés dans les deux buts suivants: i) confirmer la sensibilité des souches bactériennes. Le méthanesulfonate de méthyl, l'oxyde de nitro-4-quinoléine ou l'éthylnitrosourée peuvent être utilisés comme témoins positifs pour les essais sans activation métabolique, ii) garantir l'activité du système métabolisant adéquat. L'amino-2-anthracène constitue un témoin positif de l'activité du système métabolisant pour toutes les souches. Il convient, si possible, d'utiliser un témoin positif appartenant à la même classe chimique que la substance soumise à l'essai. 1.6.2.4. Quantité de substance à tester par boîte Au moins cinq quantités différentes de la substance à tester doivent être soumises à l'essai avec des écarts semi-logarithmiques entre les doses. Les substances sont testées jusqu'aux limites de solubilité ou de toxicité. La toxicité est mise en évidence par une réduction du nombre de révertants spontanés, un éclaircissement du tapis bactérien, ou par le taux de survie des cultures traitées. Les substances chimiques non toxiques doivent être testées jusqu'à cinq milligrammes par boîte avant que l'on puisse considérer la substance comme négative. 1.6.2.5. Conditions d'incubation Les boîtes sont incubées pendant 48 à 72 heures à 37 C. 1.6.3. Mode opératoire Dans la méthode d'incorporation directe sur boîte sans activation enzymatique, la substance à tester est ajoutée à 0,1 millilitre de culture bactérienne fraîche et à 2,0 millilitres de gélose de surface. Pour les essais avec activation métabolique, on ajoute à la gélose de surface 0,5 millilitre de mélange d'activation d'enzymes hépatiques contenant une quantité adéquate de fraction post-mitochondriale, après addition de la substance d'essai et des bactéries. Le contenu de chaque tube est mélangé et versé à la surface d'une boîte de gélose sélective. La gélose de surface doit se solidifier et les boîtes sont incubées à 37 C pendant 48 à 72 heures. Au terme de la période d'incubation, les colonies révertantes par boîte sont dénombrées. Pour la méthode de préincubation, un mélange contenant la substance d'essai, 0,1 millilitre de culture bactérienne fraîche et une quantité adéquate de mélange d'activation métabolique hépatiques, ou la même quantité de solution tampon, est préincubé avant addition de 2,0 millilitres de gélose de surface. Le reste du mode opératoire est identique à celui utilisé pour la méthode d'incorporation directe sur boîte. Toutes les boîtes préparées par ces deux méthodes le sont au moins en trois exemplaires. 2. DONNÉES Le nombre de colonies révertantes par boîte est indiqué pour les séries témoins et les séries traitées. Les dénombrements par boîte, le nombre moyen de colonies révertantes par boîte et les écarts types doivent être indiqués pour la substance testée et les témoins. Les données doivent être évaluées à l'aide de méthodes statistiques adéquates. Au moins deux expériences indépendantes sont réalisées. Il n'est pas nécessaire d'effectuer la seconde de la même manière que la première. Il peut même être préférable de modifier certaines conditions expérimentales afin d'obtenir davantage de données utiles. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - bactéries, souche utilisée, - conditions expérimentales: doses, toxicité, composition des milieux, méthodes de traitement (préincubation, incubation), système d'activation métabolique, substances de référence, témoins négatifs, - comptage par boîte, nombre moyen de colonies révertantes par boîte, écart-type, relation effet/dose si possible, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). B.14. ESSAI DE MUTATION RÉVERSÉ SUR SALMONELLA TYPHIMURIUM 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Voir introduction générale, partie B (point A). 1.2. DÉFINITIONS Voir introduction générale partie B (point C). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Aucune. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Le système de réversion à l'histidine (his) de Salmonella typhimurium est un essai microbien permettant de mesurer la réversion his . his+ induite par des substances chimiques responsables de substitutions de bases ou de mutations déplaçant le cadre de lecture au niveau du génome bactérien. Les bactéries sont exposées aux substances d'essai avec et sans activation métabolique et réparties sur la surface d'un milieu minimal. Après une période d'incubation adéquate, on dénombre les colonies révertantes et on compare au nombre de révertants spontanés observés dans une culture témoin non traitée et/ou en présence du solvant. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Aucun. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Préparation 1.6.1.1. Bactéries Les cultures fraîches de bactéries sont incubées à 37 C jusqu'à la fin de la phase exponentielle ou jusqu'au début de la phase stationnaire de croissance. La densité cellulaire approximative doit être de 108 à 109 cellules par millilitre. 1.6.1.2. Activation métabolique Les bactéries doivent être exposées à la substance d'essai en présence et en l'absence d'un mélange d'activation métabolique adéquat. Le système le plus fréquemment utilisé est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteurs, préparée à partir de foie de rongeurs traités avec des inducteurs enzymatiques. 1.6.2. Conditions expérimentales 1.6.2.1. Souches bactériennes Au moins quatre souches, à savoir TA 1535, TA 1537 ou TA 97, TA 98 et TA 100, doivent être utilisées. D'autres souches, telles que TA 1538 et TA 102 peuvent être utilisées en supplément. Il y a lieu d'utiliser des méthodes reconnues pour la préparation et la conservation des cultures de départ. Les exigences de croissance et l'identité génétique des souches, leur sensibilité aux rayons UV et au cristal violet ainsi que leur résistance à l'ampicilline doivent être vérifiées. Les souches doivent également produire des révertants spontanés dans les gammes de fréquence attendues. 1.6.2.2. Milieux On utilise un milieu sélectif approprié ainsi qu'une gélose de surface adéquate. 1.6.2.3. Utilisation de témoins négatifs et positifs On doit utiliser en parallèle des témoins non traités et des témoins en présence du solvant. Des témoins positifs doivent également être réalisés dans les deux buts suivants: i) confirmer la sensibilité des souches bactériennes. Les composés suivants peuvent être utilisés pour les essais sans activation métabolique: Souche:Réversion avec: TA 1535, TA 100Azide de sodium TA 1538, TA 98, TA 97Nitro-2-fluorène TA 1537Amino-9-acridine TA 102Hydroperoxide de cumène ii) garantir l'activité du système de métabolisation adéquat. L'amino-2-anthracène constitue un témoin positif de l'activité du système pour toutes les souches. Il convient, s'il en existe, d'utiliser un témoin positif appartenant à la même classe chimique que la substance soumise à l'essai. 1.6.2.4. Quantité de substance à tester par boîte Au moins cinq quantités différentes de la substance doivent être soumises à l'essai avec des écarts semi-logarithmiques entre les doses. Les substances sont testées jusqu'à la limite de solubilité ou de toxicité. La toxicité est mise en évidence par une réduction du nombre de révertants spontanés, un éclaircissement du tapis bactérien, ou par le taux de survie des cultures traitées. Les substances chimiques non toxiques doivent être testées jusqu'à cinq milligrammes par boîte avant que l'on puisse les considérer comme négatives. 1.6.2.5. Conditions d'incubation Les boîtes sont incubées pendant 48 à 72 heures à 37 C. 1.6.3. Mode opératoire Pour la méthode d'incorporation directe sur boîte sans activation métabolique, on ajoute la substance à tester et 0,1 millilitres de culture bactérienne fraîche à 2,0 millilitre de gélose de surface. Pour les essais avec activation métabolique, on ajoute à la gélose de recouvrement 0,5 millilitre de mélange d'activation d'enzymes hépatiques contenant une quantité adéquate de fraction post-mitochondriale, après addition de la substance d'essai et des bactéries. Le contenu de chaque tube est mélangé et versé à la surface d'une boîte de gélose sélective. On laisse la gélose de surface se solidifier et les boîtes sont incubées à 37 C pendant 48 à 72 heures. Au terme de la période d'incubation, on compte les colonies révertantes par boîte. Pour la méthode avec préincubation, un mélange contenant la substance d'essai, 0,1 millilitre de culture bactérienne fraîche et une quantité adéquate de mélange d'activation d'enzymes hépatiques ou la même quantité de solution tampon est préincubé avant addition de 2,0 millilitres de gélose de recouvrement. Le reste du mode opératoire est identique à celui utilisé pour la méthode d'incorporation directe sur boîte. Toutes les boîtes préparées par ces deux méthodes le sont au moins en trois exemplaires. 2. DONNÉES Le nombre de colonies révertantes par boîte, est indiqué pour les séries témoins et les séries traitées. Le nombre de colonies pour chaque boîte, le nombre moyen de colonies révertantes par boîte et les écarts-types doivent être indiqués pour la substance testée et les témoins. Les données doivent être évaluées à l'aide de méthodes statistiques adéquates. Au moins deux expériences indépendantes sont réalisées. Il n'est pas nécessaire d'effectuer la seconde de la même manière que la première. Il peut même être préférable de modifier certaines conditions expérimentales afin d'obtenir des données plus utiles. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - bactéries, souche utilisée, - conditions expérimentales: doses, toxicité, composition des milieux, méthodes de traitement (préincubation, incubation), système d'activation métabolique, substances de référence, témoins négatifs, - dénombrement par boîte, nombre moyen de colonies révertantes par boîte, écart-type, relation effet/dose si possible, - discussion des résultats, - interprétation des résultats. 3.2. ÉVALUATION ET INTERPRÉTATION Voir introduction générale partie B (point D). 4. RÉFÉRENCES Voir introduction générale partie B (point E). C: MÉTHODES DE DÉTERMINATION DE L'ÉCOTOXICITÉ C.1. TOXICITÉ AIGUË VIS-À-VIS DES POISSONS 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cet essai a pour objet de déterminer la toxicité aiguë létale d'une substance vis-à-vis des poissons en eau douce. Dans la mesure du possible, il est souhaitable de disposer, d'informations sur l'hydrosolubilité, la pression de vapeur, la stabilité chimique, les constantes de dissociation et la biodégradabilité de la substance d'essai en vue du choix de la méthode d'essai la plus appropriée (statique, semi-statique ou dynamique), permettant d'assurer des concentrations constantes satisfaisantes de la substance d'essai pendant la période expérimentale. Des informations supplémentaires (par exemple, la formule développée, le degré de pureté, la nature et le pourcentage des impuretés significatives, la présence et la quantité d'additifs, le coefficient de partage n-octanol/eau) doivent être prises en considération lors de la conception de l'essai et de l'interprétation des résultats. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La toxicité aiguë est l'effet préjudiciable et observable provoqué dans un organisme pendant une courte durée (jours) d'exposition à une substance donnée. Dans le présent essai, la toxicité aiguë est exprimée comme la concentration létale médiane (CL50), c'est-à-dire la concentration qui, dans l'eau, est responsable de la mort de 50 % des poissons d'un lot soumis aux essais pendant une période d'exposition continue qui est à indiquer. Toutes les concentrations de la substance d'essai sont indiquées en poids par volume (mg/l). Elles peuvent également être exprimées en poids par poids (mg/kg). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE On pourra soumettre à essai une substance de référence afin de démontrer que, dans les conditions d'essai en laboratoire, la réponse de l'espèce utilisée pour l'essai n'a pas varié de façon significative. Aucune substance de référence n'est indiquée pour cet essai. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Un essai limite peut être effectué à 100 mg/l afin de démontrer que la CL50 est supérieure à cette concentration. Les poissons sont exposés à la substance d'essai ajoutée à l'eau, dans une série de concentrations pendant une période de 96 heures. Les mortalités sont notées au moins toutes les 24 heures et les concentrations responsables de la mort de 50 % des poissons (CL50) sont calculées si possible à chaque moment d'observation. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Les critères de qualité doivent s'appliquer à l'essai limite aussi bien qu'à l'essai complet. La mortalité des témoins ne doit pas dépasser 10 % (ou un poisson, si le nombre d'animaux utilisés pour l'essai est inférieur à 10) à la fin de l'essai. La concentration en oxygène doit être supérieure à 60 % de la concentration saturante pendant toute la durée de l'essai. La concentration de la substance d'essai sera maintenue au moins à 80 % de la concentration initiale pendant toute la durée de l'essai. Pour les substances qui se dissolvent facilement dans le milieu d'essai et qui donnent des solutions stables, c'est-à-dire les substances qui ne se volatilisent pas, ne se dégradent pas, ne s'hydrolysent pas ou ne s'adsorbent pas en quantité significative, on peut considérer que la concentration initiale est la même que la concentration nominale. Il faudra prouver que la concentration a été maintenue constante pendant la durée de l'essai et que les critères de qualité ont été respectés. Pour les substances qui sont: i) peu solubles dans le milieu d'essai, ou ii) susceptibles de former des émulsions ou des dispersions stables, ou iii) instables en solution aqueuse, la concentration initiale retenue sera la concentration mesurée dans la solution (ou si cela s'avère techniquement impossible, mesurée dans la colonne d'eau) au début de l'essai. La concentration doit être mesurée après une période d'équilibrage mais avant l'introduction des organismes d'essai. Dans tous les cas cités ci-dessus, il y a lieu d'effectuer des mesures supplémentaires au cours de l'essai pour confirmer les concentrations réelles d'exposition et que les critères de qualité ont été respectés. Le pH ne doit pas varier de plus d'une unité. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE Trois types de systèmes peuvent être utilisés: Essai en statique: Essai de toxicité au cours duquel n'intervient pas de renouvellement de la solution à étudier (les solutions restent inchangées pendant toute la durée de l'essai.) Essai en semi-statique: Essai sans renouvellement continu de la solution, mais avec un renouvellement régulier de la solution d'essai après des périodes prolongées (par exemple toutes les 24 heures). Essai en dynamique: Essai de toxicité au cours duquel l'eau est constamment renouvelée dans les récipients d'essai, le produit chimique soumis à essai étant transporté par l'eau utilisée pour renouveler le milieu d'essai. 1.6.1. Réactifs 1.6.1.1. Solutions de substance à tester Les solutions mères de concentration requise sont préparées par dissolution de la substance dans de l'eau déionisée, ou dans de l'eau répondant aux conditions fixées au point 1.6.1.2. Les concentrations choisies pour l'essai sont préparées par dilution de la solution mère. Si l'on procède à des essais à concentrations élevées, la substance peut être dissoute directement dans l'eau de dilution. Les substances ne doivent normalement être testées que jusqu'à la limite de solubilité. Pour certaines substances (par exemple, les substances qui sont peu hydrosolubles, ou qui ont un Pow élevé, ou qui forment dans l'eau une dispersion stable plutôt qu'une véritable solution) il est possible d'utiliser une concentration supérieure à la limite de solubilité de la substance pour être sûr que la concentration soluble/stable maximale a bien été atteinte. Il est toutefois important que cette concentration ne perturbe pas, par ailleurs, les conditions de l'essai (par exemple, formation d'un film de substance à la surface de l'eau empêchant l'oxygénation de l'eau, etc.). Dans le cas de substances à faible hydrosolubilité, on peut avoir recours à la dispersion ultrasonique, à des solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants, pour préparer les solutions-mères ou également pour faciliter la dispersion de ces substances dans le milieu d'essai. Quand des substances auxiliaires de ce type sont utilisées, toutes les concentrations d'essai doivent contenir la même quantité de substance auxiliaire, et un lot témoin supplémentaire de poissons doit être exposé à la même concentration de substance auxiliaire que celle qui est utilisée dans les séries d'essais. La concentration de tels auxiliaires doit être limitée et ne doit en aucun cas excéder 100 mg/l dans le milieu d'essai. L'essai doit être effectué sans ajustement du pH. S'il apparaît un changement significatif du pH, il est souhaitable de répéter l'essai avec ajustement du pH et d'en consigner les résultats. Dans ce cas, la valeur du pH de la solution mère doit être ajustée à la valeur du pH de l'eau de dilution à moins que des raisons particulières ne s'y opposent. Pour ce faire, on utilisera de préférence HCl et NaOH. Cet ajustement doit être effectué de manière à ce que la concentration de la substance d'essai dans la solution mère ne soit pas sensiblement modifiée. Si l'ajustement entraîne une réaction chimique ou une précipitation de la substance d'essai, il faut consigner ces observations dans le procès-verbal. 1.6.1.2. Eau d'élevage et de dilution On peut utiliser de l'eau potable (non contaminée par des concentrations potentiellement nocives de chlore, de métaux lourds ou d'autres substances), de l'eau naturelle de bonne qualité ou de l'eau reconstituée (voir annexe I). On utilisera de préférence des eaux dont la dureté totale est comprise entre 10 et 250 milligrammes par litre (en CaCO3), et dont le pH est compris entre 6,0 et 8,5. 1.6.2. Appareillage Tout l'appareillage doit être en matériau chimiquement inerte: - système de dilution automatique (pour essai en dynamique), - dispositif de mesure de l'oxygène, - équipement pour la détermination de la dureté de l'eau, - appareillage approprié pour le contrôle de la température, - pHmètre. 1.6.3. Poissons soumis à l'essai Les poissons doivent être en bonne santé et ne présenter aucune malformation apparente. Les espèces utilisées doivent être choisies sur la base de critères pratiques, tels que leur disponibilité toute l'année, leur facilité d'entretien, leur commodité pour l'essai, leur sensibilité relative aux produits chimiques et tous facteurs significatifs sur le plan économique, biologique ou écologique. Dans le choix des espèces de poissons, il faut également prendre en considération la nécessité de pouvoir comparer les résultats et l'harmonisation internationale existante (référence 1). Une liste des espèces de poissons recommandées pour la réalisation de cet essai figure à l'annexe 2; le poisson zèbre et la truite arc-en-ciel sont les espèces à utiliser de préférence. 1.6.3.1. Elevage Les poissons soumis à l'essai doivent provenir de préférence d'un seul et même lot, dont les individus ont la même longueur et le même âge. Ils doivent être conservés pendant au moins 12 jours dans les conditions suivantes: charge biologique: appropriée au système utilisé (avec recirculation ou en dynamique) et aux espèces de poissons, eau: voir point 1.6.1.2, lumière: photopériode de 12 à 16 heures par jour, concentration en oxygène dissous: au moins 80 % de la saturation en air, alimentation: quotidienne ou trois fois par semaine, avec arrêt 24 heures avant le début de l'essai. 1.6.3.2. Mortalité Après une période d'adaptation de 48 heures, enregistrer les morts et appliquer les critères suivants: - mortalité en 7 jours supérieure à 10 % de la population: rejet de l'ensemble du lot, - mortalité en 7 jours comprise entre 5 et 10 % de la population: prolonger la période d'observation pendant 7 jours. Si l'on ne constate aucun autre cas de mortalité, le lot est acceptable, sinon, il doit être rejeté. - mortalité en 7 jours inférieure à 5 % de la population: acceptation du lot. 1.6.4. Adaptation Les poissons doivent être maintenus pendant au moins 7 jours avant leur utilisation dans les mêmes conditions que celles de l'essai (eau et température). 1.6.5. Mode opératoire Avant l'essai définitif, on pourra procéder à un essai visant à déterminer l'intervalle de concentrations à utiliser lors de l'essai définitif. Procéder, en plus de la série d'essais, à un essai témoin sans substance à étudier, et, le cas échéant, à un essai témoin contenant le produit auxiliaire. En fonction des propriétés physiques et chimiques de la substance à étudier, on choisira une méthode appropriée statique, semi-statique ou dynamique, qui réponde aux critères de qualité. Les poissons sont exposés à la substance d'essai dans les conditions suivantes: - durée: 96 heures, - nombre d'animaux: au moins 7 par concentration, - récipients: d'une capacité appropriée, en fonction de la charge biologique recommandée, - charge biologique: charge maximale recommandée pour l'essai statique ou semi-statique: 1,0 gramme par litre; pour les essais dynamiques, une charge plus élevée peut être acceptable, - concentrations d'essai: au moins cinq concentrations qui diffèrent d'un facteur constant n'excédant pas 2,2 et couvrent, dans la mesure du possible, l'intervalle de mortalité de 0 à 100 %. - eau: voir point 1.6.1.2. - lumière: photopériode de 12 à 16 heures par jour, - température: convenant à l'espèce choisie (annexe 2), mais constante à ± 1 C près, quel que soit le système d'essai, - concentration en oxygène dissous: au moins 60 % de la concentration saturante en air à la température choisie, - nourriture: aucune. Les poissons sont examinés après les 2 à 4 premières heures et au moins à intervalles de 24 heures. Ils sont considérés comme morts si le fait de toucher le pédoncule caudal ne produit aucune réaction et si aucun mouvement respiratoire n'est visible. Les poissons morts sont éliminés à chaque observation et les mortalités enregistrées. Les anomalies visibles (par exemple: perte d'équilibre, perturbations au niveau de la nage, des fonctions respiratoires, de la pigmentation, etc.) seront consignées. Les mesures du pH, de l'oxygène dissous et de la température doivent être effectuées quotidiennement. Essai limite Un essai limite peut être effectué à une concentration de 100 mg/l, en suivant les procédures décrites dans cette méthode d'essai, afin de montrer que la CL50 est supérieure à cette concentration. Si la nature de la substance est telle qu'il est impossible d'obtenir une concentration de 100 mg/l dans l'eau d'essai, l'essai limite doit être effectué à une concentration égale à la solubilité de la substance (ou à la concentration maximale formant une dispersion stable) dans le milieu utilisé (voir également le point 1.6.1.1.). L'essai limite doit être effectué avec 7 à 10 poissons, et avec un nombre identique dans le(s) lot(s) témoin(s). (Selon la théorie binomiale, lorsque l'on utilise 10 poissons avec une mortalité nulle, il y a 99,9 % de chance que la CL50 soit supérieure à la concentration utilisée dans l'essai limite. Avec 7, 8 ou 9 poissons et une mortalité nulle, il y a 99 % de chance que la CL50 soit supérieure à la concentration utilisée. En cas de mortalité, il convient d'effectuer un essai complet. Si des effets sub-létaux sont observés, ceux-ci doivent être consignés. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES Reporter, sur un papier log-probit, le pourcentage de mortalité pour chaque période d'exposition recommandée (24, 48, 72 et 96 heures) en fonction de la concentration. Pour chaque temps d'observation, estimer, lorsque cela est possible, la CL50 et l'intervalle de confiance (p = 0,05) par les méthodes classiques; les valeurs obtenues doivent être arrondies à un ou deux (maximum) chiffres significatifs (exemples de nombres arrondis à deux chiffres: 170 pour 173,5; 0,13 pour 0,127; 1,2 pour 1,21). Dans le cas où la pente de la courbe de pourcentage en fonction de la concentration est trop forte pour permettre de calculer la CL50, il suffit de procéder à une estimation graphique de cette valeur. Lorsque deux concentrations consécutives dans un rapport de 2,2 donnent 0 et 100 % de mortalité, ces deux valeurs suffisent à indiquer l'intervalle dans lequel se situe la CL50. Si l'on constate que la stabilité ou l'homogénéité de la substance d'essai ne peut pas être maintenue, cette observation doit être mentionnée et les résultats seront interprétés avec prudence. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - des informations sur les poissons soumis à essai (nom scientifique, souche, fournisseur, tout prétraitement, taille et nombre utilisé pour chaque concentration d'essai), - origine et principales caractéristiques de l'eau de dilution (pH, dureté, température), - dans le cas de substances faiblement hydrosolubles, méthode de préparation de la solution mère et de la solution d'essai, - dans le cas de substances faiblement hydrosolubles, méthode de préparation de la solution mère et de la solution d'essai, - concentration de tout produit auxiliaire, - liste des concentrations utilisées et toute information disponible sur la stabilité de la substance d'essai dans la solution d'essai à ces concentrations, - si on procède à des analyses chimiques, méthodes utilisées et résultats, - éventuellement, résultats de l'essai limite, - motifs du choix et description détaillée de la méthode utilisée (par exemple système statique, semi-statique, taux d'administration, taux de renouvellement, aération ou non, charge en poisson, etc.) - description du matériel d'essai, - régime d'éclairement, - concentration en oxygène dissous, pH et température des solutions d'essai toutes les 24 heures, - preuves que les critères de qualité ont été respectés, - tableau contenant la mortalité cumulée pour chaque concentration et pour le témoin (et, au besoin, le témoin contenant la substance auxiliaire) à chaque temps d'observation recommandé, - représentation graphique du pourcentage de mortalité en fonction de la concentration à la fin de l'essai; - si possible, valeurs de la CL50 pour chacun des temps d'observation recommandés (avec l'intervalle de confiance à 95 %), - méthodes statistiques employées pour déterminer les valeurs de la CL50, - si une substance de référence est utilisée, les résultats obtenus, - la concentration d'essai la plus élevée qui ne cause pas de mortalité pendant la durée de l'essai, - la concentration d'essai la plus basse qui cause une mortalité de 100 % des poissons pendant la durée de l'essai. 4. RÉFÉRENCES 1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 203, Décision du Conseil C(81) 30 Final et mises à jours. 2) AFNOR - NFT 90,303 juin 1985 - Détermination de la toxicité aiguë d'une substance vis-à-vis du Brachydanio rerio - Méthode statique et dynamique. 3) AFNOR - NFT 90,305 juin 1985 - Détermination de la toxicité aiguë d'une substance vis-à-vis du Salmo gairdneri - Méthode statique et dynamique. 4) ISO 7346/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method. 5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974. 6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L(15). 7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. 8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980. 9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978. 11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979. 12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. 13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979. 14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. 15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. and Exp. Therap., 1949, vol 96, 99. 16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K, 1978. 17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821 18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32. 19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hasard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84. 20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA. Annexe I Eau reconstituée Exemple d'eau de dilution appropriée Tous les produits chimiques doivent être de qualité analytique. L'eau doit être une eau distillée de bonne qualité, ou de l'eau déionisée d'une conductivité inférieure à 5 ìScm-1. L'appareillage pour la distillation de l'eau ne doit contenir aucun élément en cuivre. Solutions mères CaCl2 . 2 H2O (chlorure de calcium dihydraté): 11,76 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre MgSO4 . 7 H2O (sulfate de magnésium heptahydraté): 4,93 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre NaHCO3 (hydrogénocarbonate de sodium): 2,59 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre KCl (chlorure de potassium): 0,23 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre Eau de dilution reconstituée Mélanger 25 ml de chacune des quatre solutions mères et compléter à 1 litre avec de l'eau. Aérer jusqu'à saturation en oxygène dissous1qy. Le pH doit être de 7,8 ± 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH avec NaOH (hydroxyde de sodium) ou HCl (acide chlorhydrique). L'eau de dilution ainsi préparée est laissée au repos pendant environ 12 heures et ne doit pas être aérée ultérieurement. Le rapport des ions Ca:Mg est de 4:1, celui des ions Na:K de 10:1. L'alcalinité totale de cette solution est égale à 0,8 mmol/l. Les déviations éventuelles dans la préparation de l'eau de dilution ne doivent pas modifier la composition ou les propriétés de cette eau. Annexe 2 >EMPLACEMENT TABLE> Approvisionnement Les poissons mentionnés ci-avant sont faciles à élever et/ou largement disponibles pendant toute l'année. Ils peuvent se reproduire et se développer soit dans des exploitations piscicoles, soit en laboratoire, dans des conditions sanitaires contrôlées. L'animal soumis à essai doit être sain et d'origine connue. Ces poissons sont disponibles partout dans le monde. Annexe 3 Exemple de courbe de pourcentage de mortalité en fonction de la concentration >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Exemple de détermination de la CL50 sur papier log-probit C.2. TOXICITÉ AIGUË VIS-À-VIS DES DAPHNIÈS 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cet essai a pour objet de déterminer la concentration médiane effective (CE50) d'une substance qui immobilise les daphnies en eau douce. Il est souhaitable de disposer, autant que possible, d'informations sur l'hydrosolubilité, la pression de vapeur, la stabilité chimique, les constantes de dissociation et la biodégradabilité de la substance à étudier avant de procéder à l'essai. Des informations supplémentaires (par exemple, la formule développée, le degré de pureté, la nature et le pourcentage d'impuretés significatives, la présence et la quantité d'additifs, le coefficient de partage n-octanol/eau) doivent être prises en considération lors de la conception de l'essai et de l'interprétation des résultats. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La détermination de la CE50 telle qu'elle est décrite dans la présente méthode d'essai répond à l'exigence de la directive concernant la CL50 vis-à-vis des daphnies. Dans cet essai, la toxicité aiguë est exprimée par la concentration médiane effective (CE50) d'immobilisation, c'est-à-dire la concentration, en termes de valeur initiale, qui immobilise 50 % des daphnies, dans un lot d'essai, au cours d'une période d'exposition continue qui doit être définie. Immobilisation: Les animaux qui sont incapables de nager pendant les 15 secondes qui suivent une légère agitation du récipient d'essai sont considérés comme immobiles. Toutes les concentrations de la substance à étudier sont indiquées en poids par volume (mg/l). Elles peuvent aussi être exprimées en poids par poids (mg/kg). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Une substance de référence peut être soumise à essai afin de démontrer que, dans les conditions d'essai en laboratoire, la sensibilité de la souche utilisée pour l'essai n'est pas significativement modifiée. Un tableau récapitulatif des résultats d'un essai circulaire de la CEE portant sur quatre substances différentes est donné à l'annexe 2. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Un essai limite peut être effectué à 100 mg/l afin de démontrer que la CE50 est supérieure à cette concentration. Les daphnies sont exposées à la substance à étudier ajoutée à l'eau, dans une série de concentrations donnée, pendant une période de 48 heures. Si l'essai effectué est plus court, il conviendra d'en mentionner la justification dans le procès-verbal. Dans des conditions d'essai identiques et pour une gamme de concentrations adéquates, des concentrations différentes en substance d'essai ont des effets différents sur la capacité de nage des daphnies. En conséquence, en fin d'essai, à chaque concentration correspond un pourcentage différent d'immobilisation des daphnies. Les concentrations provoquant 0 ou 100 % d'immobilisation sont déterminées directement par l'observation, tandis que la CE50 48 heures est, si possible, déterminée par calcul. Pour cette méthode, on utilise un système statique, sans renouvellement des solutions d'essai pendant la période d'exposition. 1.5. CRITERES DE QUALITÉ Les critères de qualité doivent s'appliquer à l'essai limite aussi bien qu'à l'essai complet. L'immobilisation des témoins ne doit pas dépasser 10 % à la fin de l'essai. Les daphnies des lots témoins ne doivent pas se trouver engluées à la surface de l'eau. Il est souhaitable que la concentration en oxygène dissous dans les récipients d'essai reste supérieure à 3 mg/l pendant le déroulement de l'essai. Elle ne doit, en aucun cas, descendre en dessous de 2 mg/l. La concentration de la substance d'essai doit être maintenue dans la limite de 80 % de la concentration initiale pendant toute la durée de l'essai. Pour les substances qui se dissolvent facilement dans le milieu d'essai et qui produisent des solutions stables, c'est-à-dire qui ne se volatilisent pas, ne se dégradent pas, ne s'hydrolysent pas ou ne s'adsorbent pas d'une manière significative, on peut considérer que la concentration initiale est équivalente à la concentration nominale. Il faudra prouver que la concentration a été maintenue constante pendant la durée de l'essai et que les critères de qualité ont été respectés. Pour les substances qui sont: (i) peu solubles dans le milieu d'essai, ou (ii) susceptibles de former des émulsions ou des dispersions stables, ou (iii) instables en solution aqueuse, la concentration initiale retenue sera la concentration mesurée dans la solution (ou si cela s'avère techniquement impossible, mesurée dans la colonne d'eau) au début de l'essai. La concentration sera déterminée après une période d'équilibrage mais avant l'introduction des organismes d'essai. Dans tous les cas cités ci-dessus, il y a lieu d'effectuer des mesures supplémentaires au cours de l'essai, pour confirmer les concentrations réelles d'exposition et que les critères de qualité ont été respectés. Le pH ne doit pas varier de plus d'une unité. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Réactifs 1.6.1.1. Solutions de substance d'essai Des solutions mères de concentration requise sont préparées en dissolvant la substance dans de l'eau déionisée ou dans de l'eau répondant aux conditions fixées au point 1.6.1.2. Les concentrations choisies pour l'essai sont préparées par dilution de la solution mère. Si les essais portent sur des concentrations élevées, la substance peut être dissoute directement dans l'eau de dilution. Les substances ne doivent normalement être testées que jusqu'à la limite de solubilité. Pour certaines substances (par exemple les substances faiblement hydrosolubles, ou dont le Pow est élevé, ou encore pour celles qui forment une dispersion stable plutôt qu'une vraie solution dans l'eau), on peut effectuer un essai à une concentration supérieure à la limite de solubilité de la substance afin de garantir qu'une concentration maximale soluble/stable a été obtenue. Il est toutefois important que cette concentration ne modifie pas, par ailleurs, les conditions de l'essai (par exemple par formation d'un film de substance à la surface de l'eau empêchant l'oxygénation de l'eau, etc.). Dans le cas de substances à faible hydrosolubilité, on peut avoir recours à la dispersion ultrasonique, à des solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants, pour préparer les solutions mères ou également pour faciliter la dispersion de ces substances dans le milieu. Si on fait appel à ce type de substances auxiliaires, toutes les concentrations de l'essai doivent en contenir une quantité identique et des daphnies témoins supplémentaires doivent être exposées à une concentration en produit auxiliaire identique à celle utilisée dans la série d'essais. La concentration de ces auxiliaires doit être limitée et ne doit en aucun cas dépasser 100 mg/l dans le milieu d'essai. L'essai doit être effectué sans ajustement de pH. En cas de modification significative du pH, il est souhaitable de répéter l'essai en ajustant le pH et de noter les résultats. Dans ce cas, la valeur du pH de la solution mère doit être ajustée à la valeur du pH de l'eau de dilution à moins que des raisons particulières ne s'y opposent. On utilisera à cet effet de préférence HCl ou NaOH. Cet ajustement du pH doit être effectué de manière à ne pas modifier sensiblement la concentration en substance d'essai de la solution mère. Si l'ajustement provoquait une réaction chimique ou une précipitation de la substance d'essai, il conviendrait de consigner ces observations au procès-verbal. 1.6.1.2. Eau pour l'essai Pour cet essai, on utilise de l'eau reconstituée (voir annexe 1 et référence (2): ISO 6341). Afin d'éviter de devoir procéder à des adaptations avant essai, il est recommandé d'utiliser pour l'élevage une eau de même qualité (pH, dureté) que celle utilisée pour l'essai. 1.6.2. Appareillage On utilise l'appareillage et le matériel courant de laboratoire. Le matériel destiné à être en contact avec les solutions d'essai doit de préférence être en verre: - appareil pour mesurer l'oxygène (avec micro-électrode ou tout autre équipement convenant pour mesurer l'oxygène dans des échantillons de petit volume), - appareil approprié pour le contrôle de la température, - pHmètre, - appareil permettant de déterminer la dureté de l'eau. 1.6.3. Organisme soumis à l'essai Daphnia magna est l'espèce utilisée de préférence, bien qu'il soit aussi permis d'utiliser Daphnia pulex. Les organismes utilisés pour l'essai seront âgés de moins de 24 heures au début de l'essai, élevés en laboratoire, exempts de toute maladie, et d'origine connue (par exemple élevage, prétraitements éventuels, etc.). 1.6.4. Mode opératoire Un essai préliminaire peut précéder l'essai définitif. Il fournit des informations sur la gamme des concentrations à utiliser pour l'essai définitif. Un essai témoin sans la substance d'essai et, si besoin est, un essai témoin avec la substance auxiliaire sont effectués en plus des séries d'essai. Les daphnies sont exposées à la substance d'essai dans les conditions suivantes: - durée: de préférence 48 heures, - nombre d'organismes: au moins 20 organismes par concentration d'essai, répartis de préférence en quatre lots de cinq ou en deux lots de dix, - charge biologique: un minimum de 2 ml de la solution d'essai doit être fourni à chaque organisme, - concentration d'essai: la solution d'essai doit être préparée immédiatement avant l'introduction des daphnies, de préférence sans utiliser d'autres solvants que l'eau. Les concentrations sont choisies selon une série géométrique, avec un facteur n'excédant pas 2,2. En même temps que les témoins, on doit soumettre à l'essai des concentrations suffisantes pour obtenir 0 et 100 % d'immobilisation après 48 heures et une série de degrés d'immobilisations intermédiaires permettant de calculer la CE50 48 heures. - eau: voir point 1.6.1.2, - lumière: un cycle lumière-obscurité est optionnel, - température: la température d'essai doit se situer entre 18 et 22 C, mais elle doit, pour chaque essai, être constante à ± 1 C près, - aération: les solutions d'essai ne doivent pas être aérée par barbotage, - nourriture: néant. Le pH et la concentration en oxygène des témoins et de toutes les concentrations d'essai doivent être mesurées en fin d'essai; le pH des solutions d'essai ne devrait pas être modifié. Les substances volatiles doivent être soumises à l'essai dans des récipients remplis et hermétiquement clos, suffisamment grands pour éviter tout manque en oxygène. Les daphnies sont examinées au moins après 24 heures d'exposition et à nouveau après 48 heures. Essai limite Un essai limite peut être effectué avec 100 mg/l, en suivant les procédures décrites dans cette méthode, afin de montrer que la CE50 est supérieure à cette concentration. Si la nature de la substance est telle qu'il est impossible d'obtenir une concentration de 100 mg/l dans l'eau d'essai, l'essai limite doit être effectué à une concentration égale à la solubilité de la substance (ou à la concentration maximale formant une dispersion stable) dans le milieu utilisé (voir également le point 1.6.1.1). L'essai limite doit être effectué en utilisant 20 daphnies, réparties en deux ou en quatre lots et un nombre identique dans le(s) témoin(s). S'il y a immobilisation, une étude complète doit être effectuée. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES Reporter sur un papier log-probit, le pourcentage d'immobilisation pour chaque période d'exposition à laquelle des observations ont été faites (24 et 48 heures), en fonction de la concentration. Pour chaque temps d'observation, estimer, lorsque cela est possible, la CE50 et l'intervalle de confiance (p = 0,05) par les méthodes classiques; les valeurs obtenues doivent être arrondies à un ou deux (maximum) chiffres significatifs (exemples de nombres arrondis à deux chiffres: 170 pour 173,5; 0,13 pour 0,127; 1,2 pour 1,21). Dans le cas où la pente de la courbe est trop forte pour permettre le calcul de la CE50, il suffit de procéder à une estimation graphique de cette valeur. Lorsque deux concentrations immédiatement consécutives, dans un rapport de 2,2, donnent 0 et 100 % d'immobilisation, ces deux valeurs suffisent à indiquer l'intervalle dans lequel se situe la CE50. Si l'on constate que la stabilité ou l'homogénéité de la substance à étudier ne peut pas être maintenue, cette observation doit être mentionnée et les résultats seront interprétés avec prudence. 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - des informations sur l'organisme d'essai (nom scientifique, souche, fournisseur ou origine, tout prétraitement, méthode d'élevage, y compris origine, nature, quantité de nourriture et fréquence de l'alimentation), - origine et principales caractéristiques (à savoir, pH, dureté, température) de l'eau de dilution, - dans le cas de substances faiblement hydrosolubles, méthode de préparation de la solution mère et de la solution d'essai, - concentrations de tout produit auxiliaire utilisé, - liste des concentrations utilisées et toute information disponible sur la stabilité de la substance d'essai en solution à ces concentrations, - si on procède à des analyses chimiques, méthodes utilisées et résultats, - éventuellement, résultats de l'essai limite, - description du matériel d'essai, - régime d'éclairement, - concentration en oxygène dissous, valeur du pH et de la température des solutions d'essai, - preuves que les critères de qualité ont été respectés, - tableau contenant les immobilisations cumulées pour chaque concentration et pour le témoin (et, au besoin, le témoin contenant la substance auxiliaire) à chaque temps d'observation recommandé (24 et 48 heures), - représentation graphique du pourcentage de daphnies immobilisées en fonction de la concentration à la fin de l'essai; - si possible, valeurs de la CE50 pour chacun des temps d'observation recommandés (avec l'intervalle de confiance à 95 %), - méthodes statistiques employées pour déterminer les valeurs de la CE50, - si une substance de référence est utilisée, les résultats obtenus, - la concentration d'essai la plus élevée qui ne cause pas d'immobilisation pendant la durée de l'essai, - la concentration d'essai la plus basse qui cause une immobilisation de 100 % durant l'essai. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 202, Décision du Conseil C(81) 30 Final et mises à jour. (2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989. (3) AFNOR NFT 90 301 janvier 1983 - Inhibition de la mobilité de Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) (4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen fur die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. (5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11). (6) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, UK. (7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effects experiments, J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, p. 99-113. (8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. (9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32. (10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, p. 65-84, 1978. (11) Stephan, C. E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA. Annexe I Eau reconstituée Exemple d'eau de dilution appropriée (selon ISO 6341) Tous les produits chimiques doivent être de qualité analytique. L'eau doit être une eau distillée de bonne qualité, ou de l'eau déionisée d'une conductivité inférieure à 5 ìScm 1. L'appareillage pour la distillation de l'eau ne doit contenir aucun élément en cuivre. Solutions mères CaCl2 . 2 H2O (chlorure de calcium dihydraté): 11,76 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre MgSO4 . 7 H2O (sulfate de magnésium heptahydraté): 4,93 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre NaHCO3 (hydrogénocarbonate de sodium): 2,59 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre KCl (chlorure de potassium): 0,23 g dissoudre dans de l'eau, compléter à un litre Eau de dilution reconstituée Mélanger 25 ml de chacune des quatre solutions mères et compléter à 1 litre avec de l'eau. Aérer jusqu'à saturation en oxygène dissous. Le pH doit être de 7,8 ± 0,2. Si nécessaire, ajuster le pH avec NaOH (hydroxyde de sodium) ou HCl (acide chlorhydrique). L'eau de dilution ainsi préparée est laissée au repos pendant environ 12 heures et ne doit pas être aérée ultérieurement. La somme des ions Ca et Mg dans cette solution est égale à 2,5 mmol/l. Le rapport des ions Ca:Mg est de 4:1, celui des ions Na:K de 10:1. L'alcalinité totale de cette solution est égale à 0,8 mmol/l. Les changements éventuels dans la préparation de l'eau de dilution ne doivent pas modifier la composition ou les propriétés de cette eau. Annexe 2 Tableau récapitulatif des résultats d'un essai circulaire de la CEE réalisé en 1978 (cité également dans la référence (2)) Attention: L'objectif de cet essai circulaire était de déterminer la CE50 24 heures. Substances utilisées: 1) Bichromate de potassium 2) Acide tétrapropylbenzènesulfonique 3) Acide tétrapropylbenzènesulfonique, sel de sodium 4) Acide trichloro-2,4,5-phénoxyacétique, sel de potassium >EMPLACEMENT TABLE> Appendice 3 Exemple de courbe de pourcentage d'immobilisation en fonction de la concentration >DEBUT DE GRAPHIQUE> >FIN DE GRAPHIQUE> Exemple de détermination de la CE50 à l'aide de papier log-probit C.3. ESSAI D'INHIBITION DES ALGUES 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION Cet essai a pour objectif de déterminer les effets d'une substance sur la croissance d'algues vertes unicellulaires. Des essais de relativement courte durée (72 heures) peuvent permettre de mesurer les effets sur plusieurs générations. Cette méthode peut être adaptée de manière à être applicable à plusieurs espèces d'algues unicellulaires; dans ce cas une description de la méthode utilisée doit figurer dans le procès-verbal d'essai. Cette méthode est extrêmement facile à appliquer aux substances hydrosolubles, qui, dans les conditions de l'essai, sont susceptibles de rester dans l'eau. Elle peut être utilisée pour des substances n'interférant pas directement avec la mesure de la croissance des algues. Il est souhaitable de disposer, si possible, d'informations sur l'hydrosolubilité, la pression de vapeur, la stabilité chimique, les constantes de dissociation et la biodégradabilité de la substance à étudier avant de procéder à l'essai. D'autres informations (par exemple, la formule développée, le degré de pureté, la nature et le pourcentage d'impuretés significatives, la présence et la quantité d'additifs, le coefficient de partage n-octanol/eau) doivent être prises en considération lors de la conception de l'essai et de l'interprétation des résultats. 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS Densité cellulaire: nombre de cellules par millilitre, Croissance: augmentation de la densité cellulaire pendant la durée de l'essai, Taux de croissance: augmentation de la densité cellulaire par unité de temps, CE50: dans cette méthode, la concentration de la substance à étudier qui provoque une réduction de 50 %, soit de la croissance (CE50b), soit du taux de croissance (CE50r) par rapport au témoin, CSEO (concentration sans effet observé): dans cette méthode, la concentration d'essai la plus élevée ne provoquant pas d'inhibition de croissance significative par rapport au témoin. Toutes les concentrations de la substance à étudier sont données en poids par volume (mg/l). Elles peuvent aussi être exprimées en poids par poids (mg/kg). 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE On peut soumettre à essai une substance de référence afin de démontrer que, dans les conditions d'essai en laboratoire, la sensibilité de l'espèce utilisée pour l'essai n'est pas sensiblement modifiée. Si une substance de référence est utilisée, les résultats doivent être consignés dans le procès-verbal. Le bichromate de potassium peut être utilisé comme substance de référence, mais sa coloration peut affecter la qualité et l'intensité de la lumière parvenant aux cellules ainsi que les éventuelles mesures spectrophotomètriques. Le bichromate de potassium a été utilisé pour un essai inter-laboratoires effectué à l'échelle internationale (voir réf. (3) et Annexe 2). 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Un essai limite peut être effectué à 100 mg/l afin de démontrer que la CE50 est supérieure à cette concentration. Des cultures d'une espèce choisie d'algues vertes en phase de croissance exponentielle sont exposées à différentes concentrations de la substance à étudier pendant plusieurs générations dans des conditions définies. Les solutions d'essai sont incubées pendant une période de 72 heures, au cours de laquelle on mesure la densité cellulaire dans chaque solution au moins toutes les 24 heures. L'inhibition de la croissance est déterminée par rapport à une culture témoin. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ Les critères de qualité doivent s'appliquer à l'essai limite aussi bien qu'à l'essai complet. La densité cellulaire doit avoir augmenté d'au moins un facteur 16 en trois jours dans les cultures témoins. La concentration de la substance à étudier doit être maintenue à 80 % au moins de la concentration initiale pendant la période correspondant à la durée de l'essai. Pour les substances qui se dissolvent facilement dans le milieu d'essai et qui produisent des solutions stables, c'est-à-dire qui ne se volatilisent pas, ne se dégradent pas, ne s'hydrolysent pas ou ne s'adsorbent pas d'une manière significative, on peut considérer que la concentration initiale est équivalente à la concentration nominale. Il faudra montrer que la concentration a été maintenue pendant la durée de l'essai et que les critères de qualité ont été respectés. Pour les substances qui sont: (i) peu solubles dans le milieu d'essai, ou (ii) susceptibles de former des émulsions ou des dispersions stables, ou (iii) instables en solution aqueuse, la concentration initiale sera la concentration mesurée dans la solution au début de l'essai. Elle devra être déterminée après une période d'équilibrage. Dans tous les cas cités ci-dessus, il y a lieu d'effectuer des mesures supplémentaires au cours de l'essai pour confirmer les concentrations réelles d'exposition et que les critères de qualité ont été respectés. Il est admis que des quantités significatives de la substance à étudier peuvent être incorporées dans la biomasse d'algues pendant la durée de l'essai. C'est pourquoi il convient, pour montrer que les critères de qualité cités ci-dessus sont respectés, de prendre en compte la substance incorporée dans la biomasse d'algues ainsi que la substance en solution (ou, en cas d'impossibilité technique, mesurée dans la colonne d'eau). La mesure de la concentration de la substance dans la biomasse d'algues pouvant, cependant, poser des problèmes techniques importants, on peut montrer que les critères de qualité sont respectés en effectuant un essai avec la concentration de la substance à étudier la plus élevée, mais en absence d'algues, et en mesurant les concentrations dans la solution (ou, en cas d'impossibilité technique, mesurée dans la colonne d'eau) au début et à la fin de la période de l'essai. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Réactifs 1.6.1.1. Solutions de substance d'essai Des solutions mères de concentration requise sont préparées en dissolvant la substance dans de l'eau déionisée ou dans de l'eau répondant aux conditions fixées au point 1.6.1.2. Les concentrations d'essai choisies sont préparées en ajoutant la quantité appropriée de solution mère à des pré-cultures d'algues (voir annexe 1). Les substances ne doivent normalement pas être testées au delà de leur limite de solubilité. Pour certaines substances (par exemple les substances faiblement hydrosolubles, ou dont le pow est élevé, ou encore pour celles qui forment une dispersion stable plutôt qu'une vraie solution dans l'eau), on peut effectuer un essai à une concentration supérieure à la limite de solubilité de la substance afin de s'assurer que la concentration soluble/stable maximale a été atteinte. Il est toutefois important que cette concentration ne modifie pas, par ailleurs, les conditions de l'essai (par exemple par formation d'un film de substance à la surface de l'eau empêchant l'oxygénation de l'eau, etc.). Dans le cas de substances à faible hydrosolubilité, on peut avoir recours à la dispersion ultrasonique, à des solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants, pour préparer les solutions mères ou également pour faciliter la dispersion de ces substances dans le milieu d'essai. Si on fait appel à ces substances auxiliaires, toutes les concentrations d'essai doivent contenir la même quantité de substances auxiliaires et des témoins supplémentaires doivent être exposés à une concentration de produit auxiliaire identique à celle utilisée pour les séries d'essais. La concentration de ces auxiliaires doit être limitée et ne doit en aucun cas dépasser 100 mg/l de milieu d'essai. L'essai doit être effectué sans ajustement de pH. En cas de modification significative du pH, il est souhaitable de répéter l'essai en ajustant le pH et d'enregistrer les résultats. Dans ce cas, la valeur du pH de la solution mère doit être ajustée à la valeur du pH de l'eau de dilution à moins que des raisons particulières ne s'y opposent. Pour ce faire, on utilisera de préférence HCl ou NaOH. Cet ajustement du pH doit être effectué de manière à ne pas modifier sensiblement la concentration en substance d'essai de la solution mère. Si l'ajustement provoquait une réaction chimique ou une précipitation de la substance d'essai, il conviendrait de consigner ces observations au procès-verbal. 1.6.1.2 Milieu d'essai L'eau doit être de l'eau distillée de bonne qualité, ou de l'eau déionisée d'une conductivité inférieure à 5 ìS cm 1. L'appareil servant à la distillation de l'eau ne doit contenir aucun élément de cuivre. Le milieu suivant est recommandé: On prépare quatre solutions mères, conformément au tableau ci-après. Les solutions mères sont stérilisées par filtration sur membrane ou par autoclavage et stockées dans l'obscurité à 4 C. La solution mère n 4 doit être stérilisée uniquement par filtration sur membrane. Ces solutions mères sont diluées pour atteindre les concentrations finales en substances nutritives dans les solutions d'essai. >EMPLACEMENT TABLE> Après équilibrage avec l'air, le pH du milieu est environ de 8. 1.6.2. Appareillage - matériel courant de laboratoire, - flacons d'essai d'un volume approprié (on peut, par exemple utiliser des flacons coniques de 250 ml pour un volume de solution d'essai de 100 ml). Tous les flacons d'essai doivent être identiques en ce qui concerne la matière et les dimensions, - matériel de culture: une enceinte ou une pièce dans laquelle la température peut être maintenue dans un intervalle compris entre 21 et 25 C avec une précision de ± 2 C et munie d'un dispositif d'éclairage continu et uniforme dont le spectre d'émission est compris entre 400 et 700 nm. Si les algues des cultures témoins atteignent le taux de croissance recommandé, on peut estimer que les conditions de croissance, y compris l'intensité lumineuse, sont appropriées. Il est recommandé d'utiliser, au niveau moyen des solutions d'essai, une intensité lumineuse comprise entre 60 et 120 ìE m 2 s 1 (de 35 à 70 × 1018 photons m 2 s 1) mesurée dans la gamme de 400 à 700 nm à l'aide d'un récepteur approprié. Pour les appareils de mesure de la lumière étalonnés en lux, un intervalle équivalent, de 6 000 à 10 000 lux, est acceptable. Cette intensité lumineuse peut être fournie par quatre à sept ampoules fluorescentes de 30 W, du type blanc classique (température de couleur d'environ 4 300 K), placées à une distance de 0,35 m de la culture d'algues. - les mesures de la densité cellulaire doivent être effectuées par comptage direct des cellules vivantes, par exemple à l'aide d'un microscope et de cellules de comptage. Toutefois, on peut utiliser d'autres méthodes (photométrie, turbidimétrie, ...) à condition qu'elles soient suffisamment sensibles et s'il est montré qu'elles donnent une bonne corrélation avec la densité cellulaire. 1.6.3. Organismes soumis à l'essai Il est conseillé d'utiliser des espèces d'algues vertes à croissance rapide qui soient commodes, tant pour la culture que pour l'essai. On utilise de préférence les espèces suivantes: - Selenastrum capricornutum, par ex. ATCC 22662 ou CCAP 278/4, - Scenedesmus subspicatus, par ex. 86.81 SAG. Note: ATCC = American Type Culture Collection (Etats-Unis) CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (R.U.) SAG = Collection de cultures d'algues (Göttingen, RFA). Si d'autres espèces sont utilisées, la souche doit être mentionnée. 1.6.4. Mode opératoire Des essais sont effectués afin de déterminer la gamme de concentrations dans laquelle des effets sont susceptibles de se produire. Les deux mesures de la croissance (biomasse et taux de croissance) peuvent fournir des valeurs très différentes de l'inhibition de la croissance; ces deux types de mesure devraient être utilisés dans les essais de recherche de l'intervalle de concentrations afin de s'assurer que la progression géométrique des concentrations permettra d'estimer à la fois la CE50b et la CE50r. Densité cellulaire initiale La densité cellulaire initiale recommandée dans les cultures d'essai est de 104 cellules/ml environ pour Selenastrum capricornutum et Scenedesmus subspicatus. Si l'on utilise d'autres espèces, la biomasse doit être comparable. Concentrations de la substance à tester Pour l'essai, on choisit au moins cinq concentrations en série géométrique avec un facteur n'excédant pas 2,2. La concentration la plus faible testée ne doit avoir aucun effet visible sur la croissance des algues. La concentration la plus élevée doit inhiber la croissance d'au moins 50 % par rapport au témoin et de préférence l'arrêter complètement. Répétitions et témoins Le protocole d'essai doit comporter trois répétitions de chaque concentration d'essai. Trois témoins sans substance à étudier doivent être soumis à l'essai ainsi que, s'il y a lieu, trois témoins contenant la substance auxiliaire. Le protocole d'essai peut, si cela se justifie, être modifié afin d'augmenter le nombre de concentrations et de réduire le nombre de répétitions par concentration. Mode opératoire Des cultures d'essai contenant les concentrations choisies de substance à étudier et la quantité désirée d'inoculum d'algues sont préparées par addition de quantités déterminées de solutions mères de substance d'essai à des quantités appropriées de précultures d'algues (voir Annexe 1). Les flacons de culture sont agités et placés dans l'appareil de culture. Les algues sont maintenues en suspension par agitation, en les remuant ou par barbotage d'air, afin d'augmenter les échanges gazeux et de réduire les variations de pH dans les solutions d'essai. Les cultures doivent être maintenues à une température se situant entre 21 et 25 C, avec une précision de ± 2 C. La densité cellulaire est mesurée dans chaque flacon au moins 24, 48 et 72 heures après le début de l'essai. Lorsque la densité cellulaire est estimée à l'aide d'une méthode autre que le comptage direct, on mesure le bruit de fond à l'aide d'un milieu de culture d'algues filtré contenant la concentration appropriée du produit chimique à étudier. Le pH est mesuré au début de l'essai et 72 heures plus tard. Le pH des témoins ne devrait normalement pas varier de plus de 1,5 unité au cours de l'essai. Essais concernant des substances volatiles A l'heure actuelle il n'existe aucune méthode généralement reconnue pour étudier les substances volatiles. Lorsque l'on sait qu'une substance a tendance à s'évaporer, on peut utiliser des flacons d'essai fermés avec un volume mort plus important. La possibilité d'un manque de CO2 doit être prise en considération lorsqu'on calcule le volume mort des flacons fermés. Des variantes de cette méthode ont été proposées (voir référence (4)). Il convient d'essayer de mesurer la quantité de substance qui reste en solution et d'interpréter les résultats des essais réalisés avec les substances volatiles à l'aide de systèmes clos avec la plus grande prudence. Essai limite Un essai limite peut être effectué avec 100 mg/l, en suivant les procédures décrites dans cette méthode d'essai, afin de montrer que la CE50 est supérieure à cette concentration. Si la nature de la substance est telle qu'il est impossible d'obtenir une concentration de 100 mg/l dans l'eau d'essai, l'essai limite doit être effectué à une concentration égale à la solubilité de la substance (ou à la concentration maximale formant une dispersion stable) dans le milieu utilisé (voir également le point 1.6.1.1.). L'essai limite doit être effectué au moins avec trois répétitions, avec le même nombre de témoins. Les deux mesures de la croissance (biomasse et taux de croissance) doivent être utilisées pour l'essai limite. Si, dans un essai limite, on trouve une diminution moyenne de 25 % ou plus de la biomasse ou du taux de croissance par rapport au témoin, il convient d'effectuer un essai complet. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES Les densités cellulaires mesurées dans les cultures d'essai et les cultures témoins sont regroupées dans un tableau en même temps que les concentrations de la substance à étudier et les temps de mesures. La valeur moyenne de la densité cellulaire pour chaque concentration de substance à étudier et pour les témoins est reportée sur un graphique en fonction du temps (0-72 h) afin d'obtenir des courbes de croissance. Pour déterminer la relation concentration/effet, on peut utiliser les deux méthodes suivantes. Certaines substances peuvent stimuler la croissance à de faibles concentrations. Seuls les points expérimentaux indiquant une inhibition comprise entre 0 et 100 % doivent être pris en considération. 2.1. COMPARAISON DES SURFACES DÉLIMITÉES PAR LES COURBES DE CROISSANCE La surface qui est comprise entre la courbe de croissance et la ligne horizontale N = N0 peut être calculée à l'aide de la formule suivante: A =N1N02 × t1 +N1 + N22N02 × (t2t1) + . . +Nn 1 + Nn 2N02× (tn tn 1) où: A = Surface N0 = nombre de cellules/ml mesuré au temps t0 (début de l'essai), N1 = nombre de cellules/ml mesuré au temps t1, Nn = nombre de cellules/ml mesuré au temps tn, t1 = temps de la première mesure après le début de l'essai, tn = temps de la nième mesure depuis le début de l'essai, n = nombre de mesures effectuées depuis le début de l'essai. Le pourcentage d'inhibition de la croissance cellulaire est calculé, pour chaque concentration de substance à étudier (IA), à l'aide de la formule suivante: IA = Ac AtAc × 100 où Ac = surface comprise entre la courbe de croissance témoin et la ligne horizontale N = N0. At = surface comprise entre la courbe de croissance à une concentration t et la ligne horizontale N = N0. Les valeurs de IA sont portées sur du papier semi-logarithmique ou sur du papier semi-logarithmique-probit en fonction des concentrations correspondantes. Si l'on utilise du papier probit, on relie les points entre eux par une ligne droite, soit à l'oeil soit par une régression calculée. La CE50 est estimée à partir de la droite de régression par la concentration qui correspond à une inhibition de 50 % (IA = 50 %). Afin d'éviter toute ambigu¨ uté, il est proposé de désigner la valeur de la CE50 obtenue avec cette méthode de calcul par le symbole CE50b. Il est important que la durée de l'exposition soit précisée avec la CE50b : CE50b (0-72 h). 2.2. COMPARAISON DES TAUX DE CROISSANCE Le taux de croissance spécifique moyen (ì) pour des cultures en croissance exponentielle peut être calculé comme suit: m = ln Nn ln N0tn t0 où t0 correspond au début de l'essai. Le taux de croissance spécifique moyen peut également être déduit de la pente de la droite de régression dans un graphe de lnN en fonction de temps. Le pourcentage d'inhibition du taux de croissance spécifique pour chaque concentration de substance d'essai (Iìt) est calculé à l'aide de la formule suivante: Imt = mc mtmc × 100 où ìc = taux de croissance spécifique moyen des témoins ìt = taux de croissance spécifique moyen à la concentration d'essai t. Le pourcentage de réduction du taux de croissance spécifique moyen pour chaque concentration de substance d'essai comparé à la valeur du témoin est porté sur un graphique en fonction du logarithme de la concentration. La CE50 peut être lue sur le graphique ainsi établi. Afin d'éviter toute ambigu¨ uté, il est proposé de désigner la valeur de la CE50 obtenue avec cette méthode par le symbole CEr50. Les temps où sont effectuées les mesures doivent être précisés; par exemple, si la valeur se rapporte aux temps 0 et 72 heures, le symbole s'écrira CEr50 (0-72 h). Note: Le taux de croissance spécifique est un terme logarithmique et de faibles variations du taux de croissance peuvent donner lieu à des changements importants dans la biomasse. Les valeurs de CEb et de CEr ne sont donc pas comparables numériquement. 2.3. CALCUL DE LA CSEO La Concentration Sans Effet Observé est déterminée à l'aide d'une méthode statistique appropriée à la comparaison d'échantillons multiples (par exemple l'analyse de la variance et le test de Dunnett) en utilisant les valeurs individuelles des surfaces délimitées par les courbes de croissance A (voir point 2.1) ou par les taux de croissance spécifiques ì (voir point 2.2). 3. RÉSULTATS Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - substance à étudier: données concernant son identification chimique, - organismes utilisés pour l'essai: origine, culture en laboratoire, numéro de la souche, méthode de culture, - conditions d'essai: - date du début et de la fin de l'essai, et sa durée, - température, - composition du milieu, - matériel de culture, - pH des solutions au début et à la fin de l'essai (des variations du pH supérieures à 1,5 unité doivent faire l'objet d'une explication), - adjuvant et méthode utilisée pour solubiliser la substance à étudier, et concentrations de l'adjuvant dans les solutions d'essai, - intensité et qualité de la lumière, - concentrations étudiées (mesurées ou nominales), - résultats: - densité cellulaire pour chaque flacon à chaque point de mesure et méthode de mesure de la densité cellulaire, - valeurs moyennes de la densité cellulaire, - courbes de croissance, - représentation graphique de la relation concentration/effet, - valeurs de la CE et méthode de calcul, - CSEO, - autres effets observés. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne Directrice n 201, Décision du Conseil C(81) 30 Final. (2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subpicatus», in: Rodolph/Boje: Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986. (3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum. (4) S. Galassi and M. Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126. ANNEXE 1 Exemple de méthode de culture des algues Observations générales La présente méthode de culture a pour objectif de fournir des cultures d'algues permettant d'effectuer des essais de toxicité. Il faut s'assurer, à l'aide de méthodes appropriées, que les cultures d'algues ne sont pas infectées par des bactéries (ISO 4833). Il peut être souhaitable d'utiliser des cultures axéniques mais il est essentiel de disposer de cultures unialguales. Toutes les opérations doivent être effectuées dans des conditions stériles, afin d'éviter toute contamination aussi bien par des bactéries que par d'autres algues. Les cultures contaminées doivent être écartées. Mode opératoire pour l'obtention de cultures d'algues Préparation de solutions nutritives (milieux): Le milieu peut être préparé par dilution de solutions mères concentrées de substances nutritives. Pour les milieux solides, ajouter 0,8 % de gélose. Le milieu utilisé doit être stérile. La stérilisation par autoclavage peut provoquer une perte de NH3. Cultures mères: Les cultures mères sont de petites cultures d'algues régulièrement transférées dans du milieu frais destinées à servir de matériel d'essai initial. Si les cultures ne sont pas utilisées régulièrement, elles sont étalées sur des tubes de gélose inclinés. Ces dernières sont transférées dans un milieu frais au moins tous les deux mois. Les cultures mères sont cultivées dans des fioles coniques contenant le milieu approprié (volume de 100 ml environ). Lorsque les algues sont incubées à 20 C et éclairées en permanence, il est nécessaire de les repiquer toutes les semaines. Le transfert d'un prélèvement d'une «vieille» culture dans une fiole de milieu frais est effectué à l'aide de pipettes stériles, et de telle manière qu'avec les espèces à croissance rapide, la concentration initiale soit environ 100 fois plus faible que celle de la «vieille» culture. Le taux de croissance d'une espèce, qui peut être déterminé à partir de la courbe de croissance, permet d'estimer la densité à laquelle il convient de transférer la culture dans un nouveau milieu. Ceci doit être fait avant que la culture n'atteigne la phase létale. Pré-culture: La pré-culture sert à fournir une quantité d'algues appropriée pour l'inoculation des cultures d'essai. La pré-culture est incubée dans les conditions de l'essai et elle est utilisée alors qu'elle est encore en croissance exponentielle, généralement après une période d'incubation de trois jours environ. Il faut écarter les cultures d'algues qui contiennent des cellules déformées ou anormales. Annexe 2 La norme ISO 8692 - Qualité de l'eau - essai d'inhibition de la croissance des algues en eau douce effectué avec Scenedesmus subspicatus et Selenastrum capricornutum a permis d'obtenir les résultats suivants lors d'un essai inter-laboratoires portant sur le bichromate de potassium auquel ont participé 16 laboratoires: >EMPLACEMENT TABLE> C.4. DÉTERMINATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ «FACILE» PARTIE I. GÉNÉRALITÉS I.1. INTRODUCTION Six méthodes d'essai permettant d'évaluer la biodégradabilité facile de produits chimiques en milieu aqueux en aérobiose sont décrites: (a) Disparition du carbone organique dissout (COD) (Méthode C.4-A) (b) Essai de screening modifié de l'OCDE - Disparition du COD - (Méthode C.4-B) (c) Dégagement de dioxyde de carbone (CO2) (Essai Sturm modifié) (Méthode C.4-C) (d) Respirométrie manométrique (Méthode C.4-D) (e) Fiole Fermée (Méthode C.4-E) (f) MITI (Ministère de l'Industrie et du Commerce International - Japon) (Méthode C.4-F) La Partie I contient des considérations d'ordre général ainsi que des considérations communes aux six essais. Les particularités propres à chaque méthode sont décrites dans les parties II à VII. Les annexes contiennent définitions, formules et données de référence. Un exercice comparatif inter-laboratoires de l'OCDE, réalisé en 1988, a montré que ces méthodes donnent des résultats comparables. Toutefois, l'une ou l'autre de ces méthodes peut être préférable en fonction des caractéristiques physiques de la substance. I.2. CHOIX DE LA MÉTHODE APPROPRIÉE Il est essentiel, pour choisir la méthode la mieux appropriée, de disposer d'informations concernant la solubilité, la pression de vapeur et les caractéristiques d'adsorption de la substance à étudier. Pour calculer la valeur théorique et/ou vérifier les valeurs mesurées d'un paramètre tel que la DThO, le CO2Th, le COD, le COT et la DCO (voir annexes I et II), il est nécessaire de connaître la structure chimique ou la formule brute du produit. Toutes ces méthodes sont applicables aux substances d'essai qui peuvent être dissoutes dans l'eau à des concentrations de 100 mg/l au moins, pourvu qu'elles ne soient ni volatiles ni adsorbables. Dans le cas de produits peu hydrosolubles, volatiles ou adsorbables, les méthodes appropriées sont indiquées dans le tableau I. La manière de procéder avec les produits faiblement hydrosolubles et les substances volatiles est décrite à l'annexe III. Les substances modérément volatiles peuvent être étudiées à l'aide de la méthode de disparition du COD pourvu que les récipients d'essai contiennent un volume gazeux suffisant et qu'ils soient fermés de manière appropriée. Dans ce cas, un contrôle abiotique doit toutefois être prévu afin de tenir compte de toute perte physique. >EMPLACEMENT TABLE> L'interprétation des résultats obtenus nécessite des informations sur la pureté de la substance à étudier ou sur les proportions relatives de ses principaux composants, en particulier lorsque ces résultats sont faibles ou marginaux. Il peut être extrêmement utile de disposer d'informations sur la toxicité du produit à étudier vis-à-vis des bactéries (Annexe IV) pour choisir les concentrations d'essai appropriées et interpréter les résultats de biodégradation, notamment lorsque les valeurs sont peu élevées. I.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE La procédure est contrôlée à l'aide de substances de référence répondant aux critères de biodégradabilité facile. Ces substances sont étudiées parallèlement aux substances d'essai en ajoutant une fiole appropriée à la série normale d'essais. Les produits chimiques adéquats sont l'aniline (fraîchement distillée), l'acétate de sodium et le benzoate de sodium. Ces produits de référence sont tous dégradés dans les conditions de ces méthodes, même si aucun inoculum n'est délibérément ajouté. Il avait été suggéré de retenir un produit de référence qui soit facilement biodégradable, mais qui nécessite l'addition d'un inoculum. L'hydrogéno-phtalate de potassium a été proposé mais le bien-fondé de son utilisation reste à démontrer, avant de l'accepter comme substance de référence. Dans le cas des essais respirométriques, les composés azotés peuvent influencer la consommation d'oxygène du fait de la nitrification (voir les annexes II et V). I.4. PRINCIPE DES MÉTHODES D'ESSAI Une solution ou une suspension de la substance à étudier dans un milieu minéral est ensemencée et incubée en aérobiose, dans l'obscurité ou sous lumière diffuse. La quantité de COD due à l'inoculum, présente dans la solution d'essai doit être aussi faible que possible par rapport à la quantité de COD provenant de la substance à étudier. L'activité endogène de l'inoculum est estimée en effectuant parallèlement des essais à blanc avec l'inoculum mais sans addition de substance à étudier, quoique l'activité endogène des cellules en présence de la substance ne correspond pas exactement à celle de ce contrôle endogène. Un essai avec une substance de référence est effectué en parallèle pour vérifier le fonctionnement de ces procédures. La dégradation est en général suivie par la détermination de paramètres comme le COD, la production de CO2 ou la consommation d'oxygène et les mesures sont effectuées avec une fréquence suffisante pour permettre l'identification du commencement et de la fin de la biodégradation. Les respiromètres automatiques permettent d'effectuer des mesures en continu. Le COD est parfois mesuré en plus d'un autre paramètre, mais ceci n'est généralement le cas qu'au début et à la fin de l'essai. Une analyse chimique spécifique peut également servir à évaluer la dégradation primaire de la substance à étudier et à déterminer la concentration de toutes les substances intermédiaires formées (obligatoire dans l'essai MITI). L'essai dure normalement 28 jours. Un essai peut cependant être interrompu avant, dès lors que la courbe de biodégradation atteint un plateau qui se prolonge au moins sur trois mesures. Un essai peut également être prolongé au-delà de 28 jours si la courbe montre que la biodégradation a manifestement commencé sans toutefois avoir atteint un palier le 28ème jour. I.5. CRITÈRES DE QUALITÉ I.5.1. Reproductibilité En raison de la nature de la biodégradation et de l'hétérogénéité des populations bactériennes utilisées comme inoculum, les mesures doivent être effectuées au moins en double. On observe souvent que plus la concentration initiale des micro-organismes ajoutés au milieu d'essai est élevée, plus la variation entre les répétitions est faible. Des essais d'intercomparaison ont également montré que des variations importantes peuvent apparaître entre les résultats obtenus dans différents laboratoires, mais les résultats relatifs aux produits de référence facilement biodégradables sont généralement en bonne harmonie. I.5.2. Validité de l'essai Un essai est considéré comme valable si la différence entre les valeurs extrêmes en double de la mesure de la disparition du produit à étudier, au niveau du plateau, à la fin de l'essai ou à la fin de la fenêtre de 10 jours, est inférieure à 20 % et si le pourcentage de dégradation du produit de référence a atteint le niveau correspondant à une biodégradabilité facile en 14 jours. Si l'une de ces conditions n'est pas remplie, l'essai devra être recommencé. En raison du caractère rigoureux de ces méthodes, un résultat peu élevé ne signifie pas nécessairement que la substance soumise à l'essai n'est pas biodégradable dans les conditions de l'environnement; il indique seulement que d'autres études seront nécessaires pour en faire la preuve. Si, lors d'un essai de toxicité effectué avec une solution contenant à la fois la substance à étudier et un produit de référence, la dégradation est inférieure à 35 % (établie d'après le COD) ou à 25 % (établie d'après la DThO ou le CO2Th) au cours des 14 premiers jours, on peut estimer que le produit a un effet inhibiteur (voir également l'annexe IV). La série d'essais doit être recommencée, si possible en utilisant une concentration de substance à étudier plus faible et/ou une concentration d'inoculum plus élevée, sans toutefois dépasser 30 mg/l de matière en suspension. I.6. PROCÉDURES ET PRÉPARATIONS GÉNÉRALES Les conditions générales qui s'appliquent aux essais sont résumées dans le tableau 2. Les appareils et les conditions expérimentales spécifiques d'un essai particulier sont décrits ci-après dans les chapitres consacrés à chaque essai. >EMPLACEMENT TABLE> I.6.1. Eau de dilution De l'eau déionisée ou distillée, exempte de substances toxiques à des concentrations inhibitrices (tels que des ions Cu++), est utilisée. Elle ne contient pas plus de 10 % de la quantité de carbone organique introduite par la substance à étudier. L'eau d'essai doit être d'un haut degré de pureté afin d'éviter des valeurs élevées dans les essais à blanc. Des contaminations peuvent provenir non seulement des impuretés inhérentes mais également des résines échangeuses d'ions et de matières provenant de la lyse des bactéries et des algues. Pour chaque série d'essais, n'utiliser qu'un même lot d'eau dont la teneur en COD doit être analysée au préalable. Une telle analyse n'est pas nécessaire pour l'essai en fiole fermée, mais la consommation en oxygène à partir de l'eau doit être faible. I.6.2. Solutions mères de sels minéraux Les solutions de sels minéraux utilisées pour l'essai sont préparées à partir de solutions mères de concentration appropriée. Les solutions mères décrites ci-après peuvent être utilisées (avec différents facteurs de dilution) dans les méthodes de disparition du COD, de screening modifié de l'OCDE, de dégagement de CO2, de respirométrie manométrique et dans l'essai en fiole fermée. Les facteurs de dilution et, pour l'essai MITI, la préparation spécifique du milieu minéral sont mentionnés dans les chapitres consacrés à chaque essai. Solutions mères: Les solutions mères suivantes sont préparées en utilisant des réactifs de qualité analytique: (a) Dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO48,50 g Monohydrogénophosphate de potassium, K2HPO421,75 g Monohydrogénophosphate de sodium dihydraté Na2HPO4, 2H2033,40 g Chlorure d'ammonium, NH4Cl0,50 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre. Le pH de la solution doit être égal à 7,4. (b) Chlorure de calcium, anhydre CaCl227,50 g ou chlorure de calcium dihydraté, CaCl2, 2 H2O36,40 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre (c) Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4, 7 H2O22,50 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre (d) Chlorure de fer (III) hexahydraté, FeCl3, 6 H2O0,25 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre Note: Afin d'éviter d'avoir à préparer cette solution immédiatement avant usage, ajouter une goutte d'HCl concentré ou 0,4 g/l de sel disodique d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA). I.6.3. Solutions mères de produits chimiques Dissoudre, si la solubilité excède 1 g/l, par exemple, entre 1 et 10 g, selon les cas, de substance à étudier ou de substance de référence dans de l'eau déionisée et compléter le volume à 1 litre. Dans le cas contraire, préparer des solutions mères dans du milieu minéral ou ajouter directement le produit au milieu minéral. Dans le cas de substances de plus faible solubilité, se référer à l'annexe III, mais noter que, dans l'essai MITI (Méthode C.4-F), aucun solvant ni émulsifiant ne doit être utilisé. I.6.4. Inoculums L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées, effluents non chlorés, eaux de surface, sols, ou encore un mélange de ceux-ci. Pour les essais de disparition du COD, de dégagement de CO2 et de respirométrie manométrique, si des boues activées sont utilisées, elles doivent provenir d'une station d'épuration ou d'une unité pilote traitant principalement des eaux ménagères. Il a été montré que les inoculums provenant d'autres sources donnent des résultats plus dispersés. Pour l'essai de screening modifié de l'OCDE et l'essai en fiole fermée, il convient d'utiliser un inoculum plus dilué ne contenant pas de flocs de boue et la source la plus appropriée consiste en un effluent secondaire d'une station d'épuration des eaux résiduaires urbaines ou d'une installation à l'échelle du laboratoire. Pour l'essai MITI, l'inoculum, qui provient d'un mélange de plusieurs origines, est décrit dans le chapitre consacré à cet essai. I.6.4.1. Inoculum provenant de boues activées Recueillir un échantillon de boue activée dans le compartiment d'aération d'une station d'épuration traitant des eaux résiduaires ou d'une installation à l'échelle du laboratoire traitant principalement les eaux ménagères. Eliminer, si nécessaire, les grosses particules par filtration à travers un tamis fin et conserver ensuite la boue en aérobiose. Une autre possibilité consiste à laisser la boue sédimenter ou à la centrifuger (par exemple à 1 100 g pendant 10 mn) après avoir éliminé toutes les grosses particules. Ecarter le surnageant. La boue peut être lavée dans le milieu minéral. Mettre la boue concentrée en suspension dans un milieu minéral de telle sorte que la concentration soit comprise entre 3 et 5 g/l de matière en suspension. Aérer la suspension jusqu'à son utilisation. Les boues doivent provenir d'une station conventionnelle fonctionnant bien. Si elles proviennent d'une station d'épuration dont le débit est important ou si elles sont susceptibles de contenir des inhibiteurs, elles doivent être lavées. Laisser sédimenter ou centrifuger la boue remise en suspension par une agitation vigoureuse, écarter le surnageant et remettre la boue lavée en suspension dans un milieu minéral frais. Répéter cette opération jusqu'à ce que l'on puisse considèrer que la boue est exempte d'inhibiteur et de substrat en excès. Prélever un échantillon de boue remise en suspension ou de boue non traitée juste avant son utilisation afin de déterminer le poids sec des matières solides en suspension. Une autre possibilité consiste à homogénéiser la boue activée (entre 3 et 5 g/l de matière solide en suspension) à l'aide d'un agitateur mécanique pendant 2 minutes à vitesse moyenne. Laisser décanter la boue homogénéisée pendant 30 minutes ou plus si besoin est, et prélever la phase liquide, qui sera utilisée comme inoculum à raison de 10 ml/l de milieu minéral. I.6.4.2. Autres sources d'inoculum L'inoculum peut provenir de l'effluent secondaire d'une station d'épuration ou d'une installation à l'échelle du laboratoire qui reçoit principalement des eaux ménagères. Recueillir un échantillon frais qui doit être maintenu en aérobiose pendant le transport. Laisser reposer pendant une heure ou filtrer à l'aide d'un papier filtre grossier et conserver le surnageant transvasé ou le filtrat en aérobiose jusqu'au moment de son utilisation. On peut utiliser jusqu'à 100 ml de ce type d'inoculum par litre de milieu. L'eau de surface peut constituer une autre source d'inoculum. Dans ce cas, recueillir un échantillon d'une eau de surface appropriée, par exemple de rivière ou de lac, et le maintenir en aérobiose jusqu'au moment de son utilisation. Si nécessaire, concentrer l'inoculum par filtration ou par centrifugation. I.6.5. Préconditionnement des inoculums Les inoculums peuvent être préconditionnés aux conditions expérimentales, mais non pré-adaptés au produit à étudier. Le préconditionnement consiste à aérer la boue activée dans un milieu minéral, ou l'effluent secondaire pendant une durée de 5 à 7 jours à la température de l'essai. Le préconditionnement permet parfois d'améliorer la précision des méthodes d'essai en réduisant les valeurs dans les essais à blanc. Il est inutile de préconditionner les inoculums destinés à l'essai MITI. I.6.6. Contrôles abiotiques Rechercher, si nécessaire, une dégradation abiotique éventuelle de la substance à étudier en déterminant la disparition du COD, la consommation d'oxygène ou le dégagement de dioxyde de carbone dans des témoins stériles ne contenant pas d'inoculum. La stérilisation est effectuée par filtration à travers une membrane (0,2 à 0,45 ìm) ou par addition d'une substance toxique adéquate à une concentration appropriée. Si la filtration sur membrane est utilisée, prélever les échantillons de façon aseptique pour maintenir la stérilité. A moins que l'adsorption de la substance à étudier ait pu être exclue a priori, des essais où la biodégradation est mesurée par l'élimination de COD doivent comporter, particulièrement lorsqu'il s'agit d'inoculums provenant de boues activées, un témoin abiotique qui sera inoculé et additionné de l'agent stérilisant. I.6.7. Nombre de fioles Le nombre de fioles d'une série type est précisé dans les chapitres consacrés à ces essais. Des fioles de type suivant peuvent être utilisées: pour la suspension d'essai:contenant la substance à étudier et l'inoculum pour le blanc inoculum:ne contenant que l'inoculum pour le contrôle de la procédure:contenant la substance de référence et l'inoculum pour le témoin abiotique stérile:stérile et ne contenant que le produit à étudier pour le contrôle de l'adsorption:contenant la substance à étudier, l'inoculum et l'agent stérilisant pour le contrôle de toxicité:contenant le produit à étudier, le produit de référence et l'inoculum. Il est obligatoire de suivre le COD et/ou les autres paramètres parallèlement dans la suspension d'essai et dans l'essai à blanc contenant l'inoculum. Il est souhaitable de suivre également le COD en parallèle dans les autres fioles. Toutefois, il se peut que ceci ne soit pas toujours possible. S'assurer que le nombre d'échantillons ou de lectures est suffisant pour permettre de déterminer le pourcentage de disparition au cours de l'intervalle de temps de 10 jours. I.7. ÉVALUATION DES DONNÉES Le pourcentage de dégradation, Dt, est calculé à l'aide des valeurs moyennes des doubles déterminations du paramètre dans le récipient d'essai et dans le blanc contenant l'inoculum. Les formules sont décrites dans les chapitres consacrés à chaque essai. L'évolution de la dégradation est représentée graphiquement sur un diagramme indiquant l'intervalle de temps de 10 jours. Calculer et mentionner dans le rapport le pourcentage de disparition au terme de l'intervalle de temps de 10 jours et la valeur obtenue au plateau ou à la fin de l'essai, selon les cas. Dans les essais de respirométrie, des composés contenant de l'azote peuvent affecter la consommation d'oxygène en raison de la nitrification (voir Annexes II et V). I.7.1. Estimation de la dégradation à l'aide de la détermination du COD Pour pouvoir vérifier la validité de l'essai (voir I.5.2), le pourcentage de dégradation (Dt) à chaque instant t de prise d'un échantillon doit être calculé séparément pour les fioles contenant la substance à étudier en utilisant les valeurs moyennes de mesures en double du COD. Il se calcule à l'aide de la formule suivante: Dt = (1CtCbtCoCbo) × 100 où: Dt = % de dégradation au temps t, Co = concentration initiale moyenne de COD dans le milieu de culture ensemencé contenant la substance à étudier (mg COD/l), Ct = concentration moyenne de COD dans le milieu de culture ensemencé contenant la substance à étudier, au temps t (mg COD/l), Cbo = concentration initiale moyenne de COD dans l'essai à blanc (milieu minéral ensemencé) (mg COD/l), Cbt = concentration moyenne de COD dans l'essai à blanc (milieu minéral ensemencé) au temps t (mg COD/l). Toutes les concentrations sont mesurées expérimentalement. I.7.2. Estimation de la dégradation à l'aide d'analyses spécifiques Lorsque l'on dispose de données analytiques spécifiques, la biodégradation primaire est calculée grâce à la formule suivante: Dt = Sb SaSb × 100 où: Dt = % de dégradation au temps t, soit normalement le 28ème jour, Sa = quantité résiduelle de produit soumis à l'essai dans le milieu ensemencé à l'issue de l'essai (mg), Sb = quantité résiduelle de produit à étudier dans l'essai à blanc constitué d'eau/milieu auquel on aura uniquement ajouté le produit à étudier (mg). I.7.3 Dégradation abiotique Lorsqu'on utilise un témoin abiotique stérile, le pourcentage de dégradation abiotique se calcule par la formule: % de dégradation abiotique = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100 où: Cs(o) = concentration en COD dans le témoin stérile au temps 0, Cs(t) = concentration en COD dans le témoin stérile au temps t. I.8. RAPPORT Le procès verbal d'essai devra, si possible, comporter les renseignements suivants: - produits à étudier et produits de référence ainsi que leur degré de pureté, - conditions de l'essai, - inoculum: nature et lieu(x) de prélèvement, concentration ainsi que tout traitement de préconditionnement, - proportion et nature des déchets industriels présents dans les eaux d'égout, si elles sont connues, - durée et température de l'essai, - dans le cas où les produits à étudier sont faiblement solubles, le traitement appliqué, - méthode d'essai appliquée; il convient de fournir les raisons scientifiques et l'explication de toute modification du mode opératoire, - fiche de données, - tout phénomène d'inhibition observé, - toute dégradation abiotique observée, - les données concernant les analyses chimiques spécifiques, si elles sont disponibles, - les données concernant les analyses de substances intermédiaires, si elles sont disponibles, - la courbe représentant le pourcentage de dégradation en fonction du temps pour les substances soumises à l'essai et les substances de référence; la phase de latence, la phase de dégradation, l'intervalle de temps de 10 jours et la pente doivent être clairement indiqués (Annexe I). Si l'essai a satisfait les critères de validité, on peut utiliser la moyenne des pourcentages de dégradation des fioles contenant la substance à étudier pour la courbe, - le pourcentage de disparition à l'issue de l'intervalle de temps de 10 jours et au plateau ou à la fin de l'essai. PARTIE II. ESSAI DE DISPARITION DU COD (Méthode C.4.-A) II.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une concentration connue de substance à étudier (10 à 40 mg/l de COD) comme seule source de carbone organique, est aéré dans l'obscurité ou sous une lumière diffuse, à 22 ± 2 C. La dégradation est suivie en analysant le COD à des intervalles fréquents pendant une durée de 28 jours. Le degré de biodégradation est calculé en exprimant la concentration de COD disparu (à laquelle on apportera une correction correspondant à la concentration de COD disparu dans l'essai à blanc contenant l'inoculum) en pourcentage de la concentration initiale. Le taux de biodégradation primaire peut également être calculé à partir d'analyses chimiques supplémentaires effectuées au début et à la fin de l'incubation. II.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE II.2.1 Appareillage a) des fioles coniques, d'une contenance comprise, par exemple, entre 250 ml et 2 l, selon le volume requis pour l'analyse du COD, b) un dispositif d'agitation adapté aux fioles coniques, soit muni d'un système automatique de contrôle de température, soit placé dans une pièce thermostatée, et permettant de maintenir des conditions d'aérobiose dans toutes les fioles, c) un dispositif de filtration équipé des membranes adéquates, d) un analyseur du carbone organique dissous, e) un appareil de mesure de l'oxygène dissous, f) une centrifugeuse. II.2.2. Préparation du milieu minéral Pour la préparation de la solution mère, voir I.6.2. Mélanger 10 ml de solution a) avec 800 ml d'eau de dilution, ajouter 1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 l avec l'eau de dilution. II.2.3. Préparation et préconditionnement de l'inoculum L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées, effluents, eaux de surface, sols ou d'un mélange de celles-ci. Voir I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. et I.6.5. II.2.4. Préparation des fioles Exemple: verser un volume de 800 ml de milieu minéral par fiole conique de 2 l et ajouter dans des fioles distinctes un volume suffisant de solution mère de substance d'essai ou de substance de référence pour que la concentration de la substance corresponde à une concentration en COD comprise entre 10 et 40 mg/l. Vérifier le pH et l'ajuster, si nécessaire, à une valeur de 7,4. Ensemencer les flacons avec de la boue activée ou avec un inoculum provenant d'une autre source (voir I.6.4.), de telle sorte que la concentration finale n'excède pas 30 mg/l de matière solide en suspension. Préparer également des témoins constitués de milieu minéral contenant l'inoculum mais sans substance d'essai ni substance de référence. Ajouter, si nécessaire, une fiole pour la détection d'un éventuel effet inhibiteur de la substance d'essai. Pour cela, ensemencer une solution contenant des concentrations, à la fois de produit à étudier et de produit de référence, identiques à celles des autres fioles. Ajouter, si besoin est, une fiole supplémentaire stérile, contenant une solution de produit non ensemencée afin de vérifier si la substance soumise à l'essai subit une dégradation abiotique (voir 1.6,6.). De surcroît, si le produit à étudier est suspecté de s'adsorber de manière importante sur le verre, la boue, etc., il convient d'effectuer des mesures préliminaires permettant d'évaluer l'importance probable de cette adsorption et par conséquent de déterminer si l'essai convient pour la substance concernée (voir Tableau 1). Préparer une fiole contenant la substance à étudier, l'inoculum et l'agent stérilisant. Compléter le volume à 1 l dans toutes les fioles, avec le milieu minéral, mélanger, puis prélever un échantillon dans chaque fiole afin de déterminer la concentration initiale de COD (voir Annexe II.4). Couvrir l'ouverture des fioles, par exemple avec du papier d'aluminium, de telle sorte que les échanges gazeux puissent s'effectuer librement entre la fiole et l'atmosphère environnante. Commencer ensuite l'essai en plaçant les fioles dans le dispositif d'agitation. II.2.5. Nombre de fioles d'une série type Fioles 1 et 2: suspension d'essai Fioles 3 et 4: blanc inoculum Fiole 5: contrôle de la procédure et de préférence et si nécessaire: Fiole 6: témoin abiotique stérile Fiole 7: contrôle de l'adsorption Fiole 8: témoin de toxicité Voir également I.6.7. II.2.6. Déroulement de l'essai Pendant l'essai, les concentrations de COD font l'objet de doubles déterminations à des intervalles de temps définis, suffisamment fréquents pour permettre de déterminer le début de l'intervalle de temps de 10 jours et le pourcentage de disparition au terme de cette période. Pour chaque détermination, il ne faut prélever que le volume de suspension d'essai strictement nécessaire. Avant chaque prélèvement, le cas échéant, compenser les pertes dues à l'évaporation dans les fioles par ajout de la quantité nécessaire d'eau de dilution (I.6.1.). Avant de prélever un échantillon, le milieu de culture est soigneusement mélangé et les substances adhérant aux parois du récipient doivent être dissoutes ou mises en suspension. Les échantillons sont immédiatement filtrés à travers une membrane ou centrifugés (voir annexe II.4); ils sont analysés le jour même; si tel n'est pas le cas il faut les conserver entre 2 et 4 C pendant un maximum de 48 heures, ou au-dessous de 18 C au-delà de 48 heures. II.3. RÉSULTATS ET RAPPORT II.3.1. Traitement des résultats Calculer le pourcentage de dégradation au temps t, selon les indications figurant au paragraphe I.7.1. (détermination du COD) et, éventuellement, au paragraphe I.7.2. (analyse spécifique facultative). Reporter tous les résultats sur les fiches de données fournies. II.3.2. Validité des résultats Voir I.5.2. II.3.3. Rapport Voir I.8. II.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est fourni ci-dessous. ESSAI DE DISPARITION DU COD 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: ...mg/l produit Concentration initiale dans le milieu, to: ..mg/l produit 4. INOCULUM Origine: Traitement: Préconditionnement éventuel: Concentration des matières solides en suspension dans le mélange réactionnel: mg/l 5. DÉTERMINATION DU CARBONE Analyseur de carbone: >EMPLACEMENT TABLE> 6. ÉVALUATION DES DONNÉES BRUTES >EMPLACEMENT TABLE> 7. CONTRÔLE ABIOTIQUE (facultatif) >EMPLACEMENT TABLE> % de dégradation abiotique = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100 8. ANALYSE SPÉCIFIQUE (facultative) >EMPLACEMENT TABLE> PARTIE III. ESSAI DE SCREENING MODIFIÉ DE L'OCDE (Méthode C.4-B) III.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Un volume mesuré de milieu minéral contenant une concentration connue de substance à étudier (de 10 à 40 mg/l COD) comme unique source de carbone organique, est ensemencé avec un volume de 0,5 ml d'effluent par litre de milieu. Le mélange est aéré à 22 ± 2 C dans l'obscurité ou sous une lumière diffuse. La dégradation est suivie grâce à l'analyse du COD à des intervalles rapprochés pendant une période de 28 jours. Le taux de biodégradation est calculé en exprimant la concentration en COD disparu (corrigé en fonction de la quantité de COD disparu dans l'essai à blanc avec l'inoculum) en pourcentage de la concentration initiale. Le taux de dégradation primaire peut également être calculé à partir d'analyses chimiques supplémentaires effectuées au début et à la fin de l'incubation. III.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE III.2.1. Appareillage a) des fioles coniques, d'une contenance comprise, par exemple, entre 250 ml et 2 l, selon le volume requis pour l'analyse du COD, b) un dispositif d'agitation adapté aux fioles coniques, soit muni d'un système automatique de contrôle de température, soit placé dans une pièce thermostatée, et permettant de maintenir des conditions d'aérobiose dans toutes les fioles, c) un appareillage de filtration, accompagné des membranes adéquates, d) un analyseur du carbone organique dissous, e) un appareil de mesure de l'oxygène dissous, f) une centrifugeuse. III.2.2. Préparation du milieu minéral Pour la préparation de la solution mère, voir I.6.2. Mélanger 10 ml de solution a) avec 800 ml d'eau de dilution, ajouter 1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 l avec de l'eau de dilution. Cette méthode ne nécessitant que 0,5 ml/l d'effluent comme inoculum, le milieu doit par conséquent être enrichi en oligo-éléments et facteurs de croissance. On ajoute pour cela 1 ml de chacune des solutions ci-après par litre de milieu final. Solution d'oligo-éléments: Sulfate de manganèse tétrahydraté, MnSO4. 4H2O 39,9 mg Acide borique, H3BO3 57,2 mg Sulfate de zinc heptahydraté, ZnSO4. 7H2O 42,8 mg Heptamolybdate d'ammonium, (NH4)6 MO7O24 34,7 mg Fer-chélaté, (FeCl3, EDTA) 100,0 mg Dissoudre et compléter le volume à 1 l avec l'eau de dilution. Solution de vitamines: Extrait de levure 15,0 mg Dissoudre l'extrait de levure dans 100 ml d'eau. Stériliser par passage à travers une membrane de porosité 0,2 ìm ou préparer une solution fraîche. III.2.3. Préparation et préconditionnement de l'inoculum L'inoculum provient de l'effluent secondaire d'une station d'épuration ou d'une unité pilote qui reçoit essentiellement des eaux ménagères. Voir I.6.4.2. et I.6.5. On en utilise 0,5 ml par litre de milieu minéral. III.2.4. Préparation des fioles Exemple: verser un volume de 800 ml de milieu minéral par fiole conique de 2 l et ajouter dans des fioles distinctes des volumes de solution mère de substance à étudier et de substance de référence tels que la concentration du produit soit comprise entre 10 et 40 mg/l de COD. Vérifier le pH et l'ajuster, si nécessaire, à une valeur de 7,4. Ensemencer les fioles avec un volume de 0,5 ml/l d'effluent d'eau d'égout (voir I.6.4.2.). Préparer également des témoins en ajoutant l'inoculum au milieu minéral, mais sans addition de substance d'essai ou de substance de référence. Ajouter, si nécessaire, une fiole pour mesurer un éventuel effet inhibiteur de la substance à étudier. Pour cela, ensemencer une solution contenant des concentrations de produit à étudier et de produit de référence identiques à celles des autres fioles. Ajouter également, si besoin est, une fiole supplémentaire, stérile, contenant une solution de substance non ensemencée afin de vérifier si la substance à étudier subit une dégradation abiotique (voir 1.6.6.). De surcroît, si le produit à étudier est suspecté de s'adsorber de manière importante sur le verre, la boue, etc., il convient d'effectuer des mesures préliminaires permettant de déterminer l'importance vraisemblable de l'adsorption et d'évaluer par conséquent si l'essai convient pour la substance concernée (voir Tableau 1). Préparer une fiole contenant la substance à étudier, l'inoculum et l'agent stérilisant. Compléter le volume à 1 l dans toutes les fioles, avec le milieu minéral, mélanger, puis prélever un échantillon dans chaque flacon afin de déterminer la concentration initiale de COD (voir Annexe II.4). Recouvrir les fioles avec une feuille d'aluminium, par exemple, de telle sorte que les échanges gazeux puissent s'effectuer librement entre la fiole et l'atmosphère environnante. Commencer ensuite l'essai en plaçant les récipients dans le dispositif d'agitation. III.2.5. Nombre de fioles d'une série type Fioles 1 et 2: suspension d'essai Fioles 3 et 4: blanc inoculum Fiole 5: contrôle de la procédure et de préférence et si besoin est: Fiole 6: témoin abiotique stérile Fiole 7: contrôle de l'adsorption Fiole 8: témoin de toxicité Voir également I.6.7. III.2.6. Déroulement de l'essai Au cours de l'essai, les concentrations de COD dans chaque fiole font l'objet d'une double détermination à des intervalles de temps définis, suffisamment fréquents pour permettre de déterminer le début de l'intervalle de temps de 10 jours et le pourcentage de disparition au terme de cette période. Pour chaque détermination, il ne faut prélever que le volume strictement nécessaire. Avant chaque prélèvement, le cas échéant compenser les pertes dues à l'évaporation dans les fioles par ajout de la quantité nécessaire d'eau de dilution (I.6.1.). Avant de prélever un échantillon, le milieu de culture est soigneusement mélangé et les substances adhérant aux parois des récipients sont dissoutes ou mises en suspension. Les échantillons sont immédiatement filtrés à travers une membrane ou centrifugés (voir annexe II.4). Ils sont analysés le jour même, si tel n'est pas le cas il faut les conserver entre 2 et 4 C pendant un maximum de 48 heures, ou au-dessous de 18 C au-delà de 48 heures. III.3. RÉSULTATS ET RAPPORT III.3.1. Traitement des résultats Calculer le pourcentage de dégradation au temps t, selon les indications figurant au paragraphe I.7.1. (détermination du COD) et, éventuellement, au paragraphe I.7.2. (analyse spécifique facultative). Reporter tous les résultats sur les fiches de données fournies. III.3.2. Validité des résultats Voir I.5.2. III.3.3. Rapport Voir I.8. III.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est présenté ci-après. ESSAI DE TRIAGE DE L'OCDE MODIFIÉ 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: mg/l produit Concentration initiale dans le milieu, to: mg/l produit 4. INOCULUM Origine: Traitement: Préconditionnement éventuel: Concentration des matières solides en suspension dans le mélange réactionnel: mg/l 5. DÉTERMINATION DU CARBONE Analyseur de carbone: >EMPLACEMENT TABLE> 6. ÉVALUATION DES DONNÉES BRUTES >EMPLACEMENT TABLE> 7. CONTRÔLE ABIOTIQUE (facultatif) >EMPLACEMENT TABLE> % de dégradation abiotique = Cs(o) Cs(t)Cs(o) × 100 8. ANALYSE SPÉCIFIQUE (facultative) >EMPLACEMENT TABLE> PARTIE IV. ESSAI DE DÉGAGEMENT DE CO2 (Méthode C.4-C) IV.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une concentration connue de la substance à étudier (correspondant à 10 à 20 mg/l de COD ou de COT) comme seule source de carbone organique, est aéré par le passage d'air exempt de dioxyde de carbone, à un débit contrôlé et dans l'obscurité ou en lumière diffuse. La dégradation est suivie pendant une durée de 28 jours en déterminant le dioxyde de carbone produit, qui est piégé par de l'hydroxyde de sodium ou de baryum et mesuré par titration de l'hydroxyde résiduel ou en tant que carbone inorganique. La quantité de dioxyde de carbone produite à partir de la substance à étudier (corrigée en fonction de la quantité produite dans l'essai à blanc avec l'inoculum) est exprimée en pourcentage du CO2Th. Le taux de biodégradation peut également être calculé à partir d'analyses supplémentaires du COD effectuées au début et à la fin de l'incubation. IV.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE IV.2.1. Appareillage a) des fioles d'une contenance de 2 à 5 litres, munies d'un tube d'aération atteignant presque le fond du récipient et d'un orifice de sortie; b) des agitateurs magnétiques pour les essais avec des substances peu solubles; c) des flacons absorbeurs de gaz; d) un dispositif de contrôle et de mesure du débit d'air; e) un appareil de lavage du dioxyde de carbone, permettant d'obtenir de l'air exempt de dioxyde de carbone; une autre possibilité consiste à utiliser un mélange d'oxygène et d'azote exempts de CO2, provenant de bouteilles de gaz, dans des proportions adéquates (20 % O2, 80 % N2); f) un dispositif de mesure du dioxyde de carbone, soit par titrimétrie, soit à l'aide d'un analyseur de carbone inorganique quelconque; g) un dispositif de filtration sur membrane (facultatif); h) un analyseur de COD (facultatif). IV.2.2. Préparation du milieu minéral Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2. Mélanger 10 ml de solution a) et 800 ml d'eau de dilution, ajouter 1 ml des solutions b) à d) et compléter le volume à 1 l avec l'eau de dilution. IV.2.3. Préparation et préconditionnement de l'inoculum L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées - effluents - eaux de surface - sols - ou d'un mélange de celles-ci. Voir I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. et I.6.5. IV.2.4. Préparation des fioles Les volumes et poids cités ci-après à titre d'exemple indiquent des valeurs correspondant à des fioles de 5 l contenant 3 l de suspension. Si de plus petits volumes sont utilisés, il convient de modifier les valeurs en conséquence, mais en s'assurant que le dioxyde de carbone formé peut être mesuré avec précision. Verser 2 400 ml de milieu minéral dans chaque fiole de 5 l. Ajouter un volume approprié de boue activée préparée au préalable (voir I.6.4.1. et I.6.5.) tel que la concentration des matières en suspension n'excède pas 30 mg/l dans le volume final de 3 l de mélange ensemencé. Une autre possibilité consiste à diluer d'abord la boue préparée jusqu'à obtention d'une suspension de 500 à 1 000 mg/l dans le milieu minéral, puis à ajouter une partie aliquote de cette suspension dans la fiole de 5 l, de manière à atteindre une concentration de 30 mg/l; cette méthode permet une plus grande précision. On peut utiliser des inoculums d'origines différentes (voir I.6.4.2.). Eliminer le dioxyde de carbone du mélange ensemencé par barbotage d'air exempt de CO2, pendant une nuit. Ajouter séparément des volumes connus de solutions mères de la substance d'essai et de la substance de référence dans des fioles préparées en double, de telle sorte que la concentration de COD ou de COT, provenant des substances ajoutées, soit comprise entre 10 et 20 mg/l; conserver quelques fioles sans addition de substance comme témoins d'ensemencement. Si la substance à étudier est peu soluble, il convient d'ajouter directement un poids ou un volume défini, ou de procéder selon les indications données à l'Annexe III. Ajouter, si nécessaire, une fiole pour mesurer un éventuel effet inhibiteur de la substance à étudier. Pour cela, ensemencer une solution contenant des concentrations du produit à étudier et du produit de référence identiques à celles des autres fioles. Ajouter également, si besoin est, une fiole supplémentaire stérile, contenant une solution de produit non ensemencée afin de vérifier si la substance d'essai subit une dégradation abiotique (voir 1.6.6.). Stériliser par addition d'une substance toxique à une concentration appropriée. Compléter le volume des suspensions à 3 litres, dans toutes les fioles, avec le milieu minéral aéré au préalable au moyen d'air exempt de CO2. Des échantillons peuvent (facultatif) être prélevés afin d'analyser le COD (voir annexe II.4.) et/ou d'effectuer une analyse spécifique. Relier les flacons absorbeurs à l'orifice de sortie d'air des fioles. Si l'on utilise de l'hydroxyde de baryum, à chacune des fioles de 5 litres, relier en série trois flacons absorbeurs, contenant chacun 100 ml d'une solution 0,0125 M d'hydroxyde de baryum. La solution ne doit contenir ni sulfate ni carbonate précipité et il convient d'en déterminer la teneur juste avant son utilisation. Si l'on utilise de l'hydroxyde de sodium, relier deux pièges, le second servant de contrôle pour montrer que tout le dioxyde de carbone a été absorbé dans le premier. On pourra utiliser des flacons absorbeurs munis de systèmes de fermeture pour flacons de sérum. Ajouter dans chaque flacon 200 ml d'hydroxyde de sodium 0,05 M, ce qui suffit à absorber la totalité du dioxyde de carbone dégagé lors de la dégradation complète de la substance à étudier. La solution d'hydroxyde de sodium, même fraîchement préparée, contiendra des traces de carbonate; il convient donc d'effectuer une correction en déduisant la quantité de carbonate présente dans le témoin. IV.2.5. Nombre de fioles d'une série type Fioles 1 et 2: suspension d'essai Fioles 3 et 4: blanc inoculum Fiole 5: contrôle de la procédure et de préférence et si nécessaire: Fiole 6: témoin abiotique stérile Fiole 7: témoin de toxicité Voir également I.6.7. IV.2.6. Déroulement de l'essai Commencer l'essai en faisant barboter de l'air exempt de CO2 dans les suspensions à un débit de 30-100 ml/min. Prélever régulièrement des échantillons de l'absorbant de dioxyde de carbone pour en analyser la teneur en CO2. Il est conseillé d'effectuer des analyses tous les deux ou trois jours pendant les dix premiers jours, puis ensuite tous les cinq jours jusqu'au 28ème jour de telle sorte que l'intervalle de temps de 10 jours puisse être identifié. Le 28ème jour, prélever des échantillons (facultatif) pour analyser le COD et/ou effectuer une analyse spécifique, mesurer le pH des suspensions et ajouter 1 ml d'acide chlorhydrique concentré à chaque fiole; aérer la fiole pendant une nuit pour éliminer le dioxyde de carbone présent dans la suspension d'essai. Le 29ème jour, analyser pour la dernière fois le dégagement de dioxyde de carbone. Les jours où l'on effectue les mesures de CO2, détacher le flacon absorbeur contenant de l'hydroxyde de baryum le plus proche de la fiole d'essai et titrer la solution d'hydroxyde de baryum à l'aide d'HCl 0,05 M en utilisant la phénolphtaléine comme indicateur. Rapprocher les autres flacons absorbeurs en les décalant d'une place et introduire un nouveau flacon absorbeur contenant 100 ml d'hydroxyde de baryum 0,0125 M frais à l'extrémité de la série. Effectuer les titrations nécessaires, par exemple lorsqu'une précipitation importante se produit dans le premier piège et avant qu'elle n'apparaisse dans le second, ou au moins une fois par semaine. Une autre possibilité consiste à utiliser le NaOH comme absorbant et à prélever à l'aide d'une seringue un échantillon de faible volume (en fonction du type d'analyseur de carbone utilisé) de la solution d'hydroxyde de sodium qui se trouve dans le flacon absorbeur le plus proche de la fiole. Injecter l'échantillon dans la partie CI de l'analyseur de carbone pour analyser directement le dioxyde de carbone dégagé. N'analyser le contenu du second piège qu'à la fin de l'essai afin d'apporter une correction correspondant à tout passage de dioxyde de carbone dans ce piège. IV.3. RÉSULTATS ET RAPPORT IV.3.1. Traitement des résultats Lorsqu'une titration est effectuée, la quantité de CO2 piégée dans un flacon absorbeur est calculée à l'aide de la formule suivante: mg CO2 = (100 × CB 0,5 × V × CA) × 44 où: V = volume de HCl utilisé pour la titration des 100 ml contenus dans le flacon absorbeur (ml), CB = concentration de la solution d'hydroxyde de baryum (M), CA = concentration de la solution d'acide chlorhydrique (M), si CB est 0,0125 M et CA 0,05 M, la titration d'un volume de 100 ml d'hydroxyde de baryum est de 50 ml et le poids de CO2 est donné par la formule suivante: 0,052 × 44 × ml d'HCl titré = 1,1 × ml HCl Ainsi, dans ce cas, le facteur permettant de convertir le volume d'HCl titré en mg de CO2 est égal à 1,1. Calculer le poids de CO2 produit par l'inoculum seul et par l'inoculum plus la substance à étudier à l'aide des valeurs de titration obtenues dans les deux cas; la différence correspond au poids de CO2 produit à partir de la substance à étudier seule. Exemple: si la titration du flacon absorbeur correspondant à l'inoculum seul nécessite un volume de 48 ml et celui du flacon correspondant à l'inoculum additionné à la substance, un volume de 45 ml: CO2 de l'inoculum= 1,1 × (50-48) = 2,2 mg CO2 de l'inoculum plus substance à étudier = 1,1 × (50-45)= 5,5 mg et par conséquent le poids de CO2 produit à partir de la substance à étudier est égal à 3,3 mg. Le pourcentage de dégradation est calculé à l'aide de la formule suivante: % de dégradation = CO2Th × mg substance à étudier ajoutéemg CO2 produit × 100 ou % de dégradation = mg de COT ajouté dans l'essai × 3,67mg de CO2 × 100 où 3,67 est le facteur de conversion (44/12) du carbone en dioxyde de carbone. Calculer le pourcentage de dégradation après un temps déterminé en effectuant la somme des pourcentages de CO2Th calculés pour chaque jour où des mesures ont été effectuées pendant la période considérée. Lorsque l'absorbant utilisé est de l'hydroxyde de sodium, calculer la quantité de dioxyde de carbone produite, exprimée en CI (mg), en multipliant la concentration en CI dans l'absorbant par le volume de ce dernier. Calculer le pourcentage de dégradation à l'aide de la formule suivante: % CO2Th = mg CI de la fiole d'essai mg CI de la fiole témoinmg de COT ajouté sous forme de substance d'essai × 100 Calculer la disparition du COD (facultatif) comme décrit au paragraphe 1.7. Consigner ces résultats, ainsi que tout autre résultat, sur les fiches de données fournies. IV.3.2 Validité des résultats La teneur en CI de la suspension de substance à étudier en milieu minéral au début de l'essai doit être inférieure à 5 % du CT, et le dégagement total de CO2 dans l'essai à blanc contenant l'inoculum ne doit normalement pas excéder 40 mg/l de milieu à la fin de l'essai. Si les valeurs obtenues sont supérieures à 70 mg/l de CO2, les données et le protocole expérimental doivent être soumis à un examen critique. Voir également I.5.2. IV.3.3 Rapport Voir I.8. IV.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous. ESSAI DE DÉGAGEMENT DE DIOXYDE DE CARBONE 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: mg/l produit Concentration initiale dans le milieu: mg/l produit Carbone total ajouté dans la fiole: mg/l CO2Th: mg CO2 4. INOCULUM Origine: Traitement: Préconditionnement éventuel: Concentration des matières solides en suspension dans le mélange réactionnel: mg/l 5. PRODUCTION DE DIOXYDE DE CARBONE ET DÉGRADABILITÉ Méthode: Ba(OH)2NaOH/autre >EMPLACEMENT TABLE> 6. DÉTERMINATION DU CARBONE (facultative) Analyseur de carbone: . >EMPLACEMENT TABLE> % de COD éliminé = 1 Ct Cb(t) CoCb(o) × 100 7. DÉGRADATION ABIOTIQUE (facultative) % dégrad. abiot. = Format. de CO2 d. la fiole stérile ap. 28 jours (mg)CO2Th (mg) × 100 PARTIE V. ESSAI DE RESPIROMETRIE MANOMETRIQUE (Méthode C.4-D) V.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Un volume mesuré de milieu minéral ensemencé, contenant une concentration connue de la substance d'essai (100 mg/l de substance d'essai, de telle sorte que la DThO soit au moins comprise entre 50 et 100 mg/l au moins) comme seule source de carbone organique, est agité en fiole fermée, à température constante (± 1 C au maximum) pendant une durée maximale de 28 jours. La consommation d'oxygène est déterminée soit en mesurant la quantité d'oxygène (produit par électrolyse) nécessaire pour maintenir un volume gazeux constant dans la fiole respirométrique, soit en se basant sur les modifications de volume ou de pression (ou sur une combinaison des deux) dans l'appareil. Le dioxyde de carbone produit est absorbé par une solution d'hydroxyde de potassium ou par un autre absorbant approprié. La quantité d'oxygène consommée par la substance à étudier (après une correction correspondant à la quantité d'oxygène consommée par le témoin inoculum, analysée parallèlement) est exprimée en pourcentage de DThO ou de DCO. Facultativement, la biodégradation primaire peut également être calculé à partir d'analyses supplémentaires du COD effectuées au début et à la fin de l'incubation, et la biodégradation ultime par la mesure du COD. V.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE V.2.1. Appareillage (a) un respiromètre approprié, (b) un dispositif de régulation de température d'une précision de ± 1 C au moins, (c) un dispositif de filtration sur membrane (facultatif), (d) un analyseur de carbone (facultatif). V.2.2. Préparation du milieu minéral Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2. Mélanger 10 ml de solution (a) et 800 ml d'eau de dilution, ajouter 1 ml des solutions (b) à (d) et compléter le volume à un litre avec l'eau de dilution. V.2.3. Préparation et préconditionnement de l'inoculum L'inoculum peut provenir de plusieurs sources: boues activées - effluents - eaux de surface - sols - ou d'un mélange de celles-ci. Voir I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. et I.6.5. V.2.4. Préparation des fioles A partir des solutions mères, préparer différents lots de solutions de substance d'essai et de substance de référence dans du milieu minéral, normalement à une concentration de 100 mg/l de substance (ce qui donne une DThO comprise, au moins, entre 50 et 100 mg/l). Calculer la DThO à partir de la formation de sels d'ammonium, à moins qu'un processus de nitrification ne soit prévisible, auquel cas le calcul reposera sur la formation de nitrate (voir annexe II.2.) Mesurer le pH et, le cas échéant, l'ajuster à 7,4 ± 0,2. Les substances faiblement solubles doivent être ajoutées lors d'une étape ultérieure (voir ci-après). S'il convient de déterminer la toxicité de la substance à étudier, préparer une solution de milieu minéral supplémentaire contenant à la fois la substance de référence et le produit à étudier aux mêmes concentrations que dans les solutions ne contenant que l'un des produits. Dans le cas où il est nécessaire de mesurer la consommation physico-chimique d'oxygène, préparer une solution de produit à étudier, dont la concentration corresponde normalement à une DThO de 100 mg/l, stérilisée par l'addition d'une substance toxique appropriée (voir I.6,6.). Ajouter dans deux fioles, au moins, le volume requis de solution d'essai et dans deux autres, au moins, le volume adéquat de solution de référence. Préparer d'autres fioles ne contenant que du milieu minéral (pour les témoins inoculum) et, le cas échéant, la solution de mélange produit à étudier/substance de référence et la solution stérile. Si la substance à étudier est peu soluble, en ajouter un poids ou un volume déterminé, directement à ce stade, ou suivre le mode opératoire décrit à l'annexe III. Ajouter de l'hydroxyde de potassium, de la chaux sodée ou un autre absorbant dans les compartiments d'absorption du CO2. V.2.5. Nombre de fioles d'une série type Fioles 1 et 2: suspension d'essai Fioles 3 et 4: blanc inoculum Fiole 5: contrôle de la procédure de préférence, et si nécessaire: Fiole 6: témoin stérile Fiole 7: témoin de toxicité Voir également I.6.7. V.2.6. Déroulement de l'essai Laisser les récipients atteindre la température souhaitée. Ensemencer les récipients appropriés avec les boues activées préparées au préalable ou avec un inoculum provenant d'une autre source, de telle sorte que la concentration des matières solides en suspension ne dépasse pas 30 mg/l. Assembler le matériel, mettre l'agitateur en marche, vérifier l'étanchéité à l'air et commencer à mesurer la consommation d'oxygène. Le déroulement de l'essai ne nécessite normalement aucune attention particulière en dehors des lectures et des vérifications quotidiennes permettant de s'assurer que la température et l'agitation appropriées sont maintenues. Calculer la consommation d'oxygène à partir des lectures effectuées à intervalles réguliers et rapprochés en suivant la méthode fournie par le fabriquant du matériel utilisé. A la fin de l'incubation, qui est normalement de 28 jours, mesurer le pH dans les fioles, en particulier si la consommation d'oxygène est faible ou supérieure à la DThONH4 (pour les composés azotés). Prélever, si nécessaire, des échantillons dans les fioles du respiromètre, au début et à la fin de l'essai, pour analyser le COD ou effectuer un dosage spécifique (voir annexe II.4.). Lors du premier prélèvement, noter le volume de suspension d'essai restant dans la fiole. Si la substance à étudier contient de l'azote, déterminer l'augmentation de la concentration de nitrite et de nitrate au cours de ces 28 jours et calculer la correction relative à la consommation d'oxygène due à la nitrification (annexe V). V.3. RÉSULTATS ET RAPPORT V.3.1. Traitement des résultats Diviser la consommation d'oxygène (mg) de la substance à étudier après une période donnée (après correction due à l'oxygène consommé dans l'essai à blanc contenant l'inoculum pendant une période identique) par le poids de substance utilisé. Le résultat, exprimé en mg d'oxygène par mg de substance, correspond à la DBO, à savoir: DBO = mg d'O2 consom. par le produit à étudier mg O2 consom. par le blancmg de produit à étudier présent dans la fiole = mg d'O2 par mg de produit à étudier Calculer le pourcentage de biodégradation, soit à partir de la formule suivante: % de biodégrad. = % DThO = DThO (mg O2/mg substance)DBO (mg O2/mg substance) × 100, soit à l'aide de celle-ci: % DCO = DBO (mg O2/mg substance) DCO (mg O2/mg substance) × 100 Il faut noter que ces deux méthodes n'aboutissant pas nécessairement au même résultat, il est préférable d'utiliser la première. Pour les substances à étudier azotées, choisir la DThO appropriée (NH4 ou NO3) en fonction de ce que l'on sait ou suppose quant à la nitrification (annexe II.2.). Si la nitrification a lieu mais de manière incomplète, calculer la correction pour l'oxygène consommé par la nitrification à partir des modifications des concentrations de nitrite et de nitrate (Annexe V). Lorsque les mesures facultatives du carbone organique et/ou d'un produit spécifique sont effectuées, calculer le pourcentage de dégradation, comme décrit au paragraphe I.7. Consigner tous les résultats sur les fiches de données fournies. V.3.2. Validité des résultats La consommation d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'inoculum est normalement comprise entre 20 et 30 mg/l d'O2 et ne doit pas dépasser 60 mg/l en 28 jours. Des valeurs supérieures à 60 mg/l nécessitent un examen critique des données et des méthodes expérimentales. Si la valeur du pH se situe en dehors de l'intervalle compris entre 6 et 8,5 et si la consommation d'oxygène par le produit à étudier est inférieure à 60 %, l'essai doit être recommencé avec une concentration en produit à étudier plus faible. Voir également I.5.2. V.3.3. Rapport Voir I.8. V.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est présenté ci-après. ESSAI DE RESPIROMETRIE MANOMETRIQUE 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: ... mg/l Concentration initiale dans le milieu, Co: ... mg/l Volume dans la fiole d'essai (V): ... ml DThO / DCO: ... mg O2/mg de produit à étudier (NH4, NO3) 4. INOCULUM Origine: ... Traitement: ... Préconditionnement éventuel: ... Concentration des matières solides en suspension dans le mélange réactionnel: ... mg/l 5. CONSOMMATION D'OXYGÈNE: BIODÉGRADABILITÉ >EMPLACEMENT TABLE> 6. CORRECTION TENANT COMPTE DE LA NITRIFICATION (voir annexe V) >EMPLACEMENT TABLE> 7. ANALYSE DU CARBONE (facultative) Analyseur de carbone: ... >EMPLACEMENT TABLE>% de COD éliminé = 1 Ct Cblt Co Cblo × 100 8. ANALYSE SPÉCIFIQUE (facultative) Sb = concentration dans le témoin physico-chimique (stérile), le 28ème jour. Sa = concentration dans la fiole ensemencée, le 28ème jour. % de biodégradation = Sb SaSb × 100 9. DÉGRADATION ABIOTIQUE (facultative) a = consommation d'oxygène dans les fioles stériles au bout de 28 jours, (mg). Consommation d'oxigène par mg de produit à étudier = CoVa(Voir paragraphes 1 et 3) % de dégradation abiotique = CoV × DThOa × 100 PARTIE VI. ESSAI EN FIOLES FERMÉES (Méthode C.4-E) VI.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La solution de substance à étudier en milieu minéral, généralement d'une concentration de 2 à 5 mg/l, est ensemencée avec un nombre relativement faible de micro-organismes provenant d'une population hétérogène et conservée dans des fioles fermées et remplies complètement dans l'obscurité et à température constante. La dégradation est suivie par l'analyse de l'oxygène dissous pendant une période de 28 jours. La quantité d'oxygène consommé par la substance à étudier, corrigée en fonction de la consommation dans l'essai à blanc contenant l'inoculum réalisé dans la même série, est exprimée en pourcentage de DThO ou de DCO. VI.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE VI.2.1. Appareillage a) des flacons pour analyse de la DBO, munis de bouchons de verre, d'un volume de 250 à 300 ml, b) un bain-marie ou un incubateur permettant de maintenir les fioles à température constante (± 1 C au maximum) à l'abri de la lumière, c) de grands flacons de verre (2 à 5 l) pour la préparation des milieux et le remplissage des flacons à DBO, d) une électrode à oxygène couplée à un appareil de mesure, ou l'équipement et les réactifs nécessaires à la méthode de titration de Winkler. VI.2.2. Préparation du milieu minéral Pour la préparation des solutions mères, voir I.6.2. Mélanger 1 ml des solutions a) à d) et compléter le volume à un litre avec l'eau de dilution. VI.2.3. Préparation de l'inoculum Normalement, l'inoculum provient de l'effluent secondaire d'une station d'épuration ou d'une unité pilote qui reçoit principalement des eaux ménagères. L'eau de surface peut constituer une autre source d'inoculum. Utiliser normalement une goutte (0,05 ml) à 5 ml de filtrat par litre de milieu; il peut être nécessaire de procéder à des essais afin de déterminer le volume optimal pour un effluent donné (voir I.6.4.2. et I.6.5.) VI.2.4. Préparation des fioles Aérer fortement le milieu minéral pendant au moins 20 mn. Chaque série d'essais doit être effectuée avec du milieu minéral provenant d'un lot unique. Le milieu est généralement prêt à l'emploi après être resté pendant 20 heures à la température de l'essai. Déterminer la concentration d'oxygène dissous à des fins de contrôle; la valeur obtenue doit être proche de 9 mg/l à 20 C. Effectuer toutes les opérations de transfert et de remplissage avec le milieu saturé d'air en évitant la formation de bulles, par exemple à l'aide de siphons. Préparer des lots parallèles de flacons à DBO pour les déterminations avec la substance d'essai et la substance de référence dans des séries expérimentales simultanées. Réunir un nombre suffisant de flacons à DBO, comprenant des essais à blanc avec l'inoculum, pour pouvoir effectuer, au moins en double, les mesures de la consommation d'oxygène aux intervalles de temps souhaités, par exemple après 0, 7, 14, 21 et 28 jours. Un plus grand nombre de flacons peut être nécessaire pour être sûr de pouvoir identifier l'intervalle de temps de 10 jours. Transférer le milieu minéral parfaitement aéré dans les grands flacons de manière à remplir à peu près le tiers de leur volume. Ajouter ensuite dans de grands flacons distincts une quantité de solution mère du produit à étudier ou du produit de référence telle que la concentration finale ne dépasse pas, normalement, 10 mg/l. N'ajouter aucune substance dans le grand flacon destiné à l'essai à blanc. Pour s'assurer que l'activité de l'inoculum n'est pas limitée, la concentration d'oxygène dissous ne doit pas descendre en-dessous de 0,5 mg/l dans les flacons à DBO. La concentration de produit à étudier se trouve ainsi limitée à environ 2 mg/l. Toutefois, on peut utiliser une concentration comprise entre 5 et 10 mg/l pour les composés peu dégradables et les composés dont la DThO est faible. Dans certains cas, il est préférable d'effectuer des séries d'essais en parallèle avec deux concentrations différentes, par exemple 2 et 5 mg/l. La DThO est normalement calculée à partir de la formation de sels d'ammonium, mais si l'on suppose ou si l'on est sûr qu'une nitrification doit avoir lieu, il convient alors de calculer la DThONO3 en se basant sur la formation de nitrate (voir annexe II.2). Toutefois, si une nitrification se produit mais sans être complète, il faut effectuer une correction tenant compte des modifications de la concentration de nitrite et de nitrate déterminées par l'analyse (voir annexe V). Si la toxicité du produit à étudier doit être recherchée (dans le cas, par exemple, où une faible biodégradabilité aurait été observée au préalable), une autre série de flacons est nécessaire. Préparer un autre grand flacon contenant du milieu minéral aéré (jusqu'au tiers de son volume environ) auquel on ajoute la substance à étudier et le produit de référence à des concentrations finales normalement égales à celles des autres grands flacons. Ensemencer les solutions contenues dans les grands flacons avec un effluent secondaire (dont le volume est compris entre une goutte, soit environ 0,05 ml, et 5 ml) ou avec un inoculum d'une autre origine, comme de l'eau de rivière (voir I.6.4.2.). Enfin, compléter le volume des solutions avec du milieu minéral aéré à l'aide d'un tuyau touchant le fond du flacon pour permettre un mélange adéquat. VI.2.5. Nombre de fioles d'une série type Une série type comporte les flacons suivants: - au moins 10 flacons contenant la substance à étudier et l'inoculum (suspension d'essai), - au moins 10 flacons ne contenant que l'inoculum (essai à blanc avec l'inoculum), - au moins 10 flacons contenant le produit de référence et l'inoculum (contrôle de la procédure), et, si nécessaire, 6 flacons contenant la substance à étudier, le produit de référence et l'inoculum (contrôle de toxicité). Néanmoins, pour être certain de pouvoir identifier l'intervalle de temps de 10 jours, il faudrait environ deux fois plus de flacons. VI.2.6. Déroulement de l'essai Toutes les solutions préparées sont immédiatement transférées dans le lot correspondant de flacons à DBO à l'aide d'un tuyau plongeant aux trois quarts (pas jusqu'au fond) du grand flacon approprié de telle sorte que tous les flacons à DBO soient complètement remplis. Tapoter doucement pour éliminer toutes les bulles d'air. L'oxygène dissous est analysé immédiatement dans les flacons destinés à la mesure au temps 0, par la méthode de Winkler ou avec une électrode. Le contenu des flacons peut être conservé en vue d'une analyse ultérieure par la méthode de Winkler si on lui ajoute du sulfate de manganèse (II) et de l'hydroxyde de sodium (le premier réactif de la méthode de Winkler). Les flacons dont le contenu en oxygène est fixé sous forme d'hydroxyde de manganèse (III) brun, sont conservés soigneusement fermés à l'obscurité, et à une température comprise entre 10 et 20 C. Ne pas attendre plus de 24 heures avant de procéder aux étapes suivantes de la méthode de Winkler. Fermer les autres flacons préparés parallèlement en s'assurant qu'ils ne contiennent pas de bulles d'air et les incuber à 20 C à l'obscurité. Chaque série doit être accompagnée d'une série complète d'essais à blanc ensemencés pour la détermination du témoin inoculum. Prélever régulièrement (au moins chaque semaine) deux flacons au moins dans chaque série, afin d'analyser l'oxygène dissous pendant la durée de l'incubation qui est de 28 jours. Les prélèvements hebdomadaires d'échantillons permettent de déterminer le pourcentage de disparition dans un intervalle de 14 jours, alors que les prélèvements effectués tous les 3 ou 4 jours, qui nécessitent environ deux fois plus de flacons, permettent d'identifier l'intervalle de temps de 10 jours. Si la substance à étudier contient de l'azote, il convient d'effectuer une correction pour tenir compte de la consommation d'oxygène due à la nitrification. Pour cela, déterminer la concentration d'oxygène dissous par la méthode de l'électrode à O2 et, ensuite, analyser la teneur en nitrite et en nitrate sur un échantillon prélevé dans le flacon DBO. Calculer la quantité d'oxygène utilisée sur la base de l'augmentation de la concentration de nitrite et de nitrate (voir annexe V). VI.3. RÉSULTATS ET RAPPORT VI.3.1. Traitement des résultats En premier lieu, calculer la DBO après chaque période de temps en soustrayant la perte en oxygène (mg O2/l) dans l'essai à blanc contenant l'inoculum de celle que l'on observe avec la substance à étudier. Diviser cette perte en oxygène ainsi corrigée par la concentration (mg/l) de la substance à étudier. Le résultat obtenu correspond à la DBO spécifique exprimée en mg d'oxygène par mg de substance d'essai. Calculer le pourcentage de biodégradabilité en divisant la DBO spécifique par la DThO spécifique (calculée selon les indications données à l'annexe II.2) ou par la DCO (déterminée par analyse, voir annexe II.3). Ainsi: DBO = mg O2 consommé par la substance à étudier mg O2 consommé par le blancmg de substance à étudier dans la fiole = mg d'O2 par mg de produit à étudier % de dégradation = DBO (mg O2/mg de substance à étudier) DThO (mg O2/mg de substance à étudier) × 100 % de dégradation = DBO (mg O2/mg de substance à étudier) DCO (mg O2/mg de substance à étudier) × 100 Il faut noter que ces deux méthodes ne conduisant pas nécessairement au même résultat, il est préférable d'utiliser la première. Dans le cas où la substance d'essai contient de l'azote, il convient d'utiliser la DThO appropriée (NH4 ou NO3) en fonction des connaissances ou des prévisions concernant l'éventualité de la nitrification (Annexe II.2.). Si une nitrification a lieu sans toutefois être complète, corriger pour tenir compte de la consommation d'oxygène due à la nitrification à partir des modifications de la concentration de nitrite et de nitrate (Annexe V). VI.3.2. Validité des résultats La perte d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'inoculum ne doit pas dépasser 1,5 mg/l d'oxygène dissous après 28 jours. Des valeurs supérieures nécessitent une vérification des méthodes expérimentales. La concentration résiduelle d'oxygène dans les flacons d'essai ne doit à aucun moment descendre au-dessous de 0,5 mg/l. Une teneur en oxygène aussi basse n'est acceptable que si la méthode utilisée pour mesurer l'oxygène dissous est capable de mesurer de telles concentrations avec précision. Voir également I.5.2. VI.3.3. Rapport Voir I.8. VI.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous. ESSAI EN FIOLES FERMEES 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: ... mg/l Concentration initiale dans la fiole: ... mg/l DThO / DCO: ... mg O2/mg de produit à étudier 4. INOCULUM Origine: ... Traitement: ... Préconditionnement éventuel: ... Concentration dans le mélange réactionnel: ... mg/l 5. DÉTERMINATION DE L'OD Méthode de Winkler ou de l'électrode. >EMPLACEMENT TABLE> 6. CORRECTION TENANT COMPTE DE LA NITRIFICATION (Annexe V) >EMPLACEMENT TABLE> 7. PERTE D'OD: % DE DÉGRADATION >EMPLACEMENT TABLE> mto = valeur dans la fiole d'essai au temps 0 mtx = valeur dans la fiole d'essai au temps x mbo = valeur moyenne du blanc au temps 0 mbx = valeur moyenne du blanc au temps x Appliquer également la correction tenant compte de la nitrification mentionnée aux points (iii) et (vi) du paragraphe 6. 8. PERTE d'OD DANS L'ESSAI À BLANC Consommation d'oxygène dans l'essai à blanc: (mbo mb28) mg/l. Cette consommation est importante pour la validité de l'essai. Elle doit être inférieure à 1,5 mg/l. PARTIE VII. ESSAI M.I.T.I. (Méthode C.4-F) VII.1. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La consommation d'oxygène d'une solution ou d'une suspension agitée de substance à étudier dans un milieu minéral, ensemencée avec des micro-organismes cultivés à cet effet sans adaptation préalable, est établie à l'aide d'un respiromètre automatique en circuit fermé, à l'obscurité, pendant une période de 28 jours à 25 ± 1 C. Le dioxyde de carbone dégagé est absorbé par de la chaux sodée. La biodégradabilité est exprimée par le pourcentage de la consommation d'oxygène (corrigé en fonction de la consommation dans l'essai à blanc) par rapport à la consommation théorique (DThO). Le pourcentage de biodégradabilité primaire est également calculé d'après les analyses chimiques spécifiques supplémentaires effectuées au début et à la fin de l'incubation et, éventuellement, à l'aide de l'analyse du COD. VII.2. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE VII.2.1. Appareillage a) appareil de mesure automatique de la DBO par électrolyse ou respiromètre normalement équipé de 6 fioles d'une contenance de 300 ml chacune et de récipients contenant l'absorbant de CO2, b) pièce thermostatée et/ou bain-marie à 25 C (± 1 C au maximum), c) dispositif de filtration sur membrane (facultatif), d) analyseur de carbone (facultatif). VII.2.2. Préparation du milieu minéral Préparer les solutions mères suivantes, à l'aide de réactifs de qualité analytique et d'eau (I.6.1.): a) Dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO4 8,50 g Monohydrogénophosphate de potassium, K2HPO4 21,75 g Monohydrogénophosphate de sodium dodécahydraté, Na2HPO4.12 H2O 44,60 g Chlorure d'ammonium, NH4Cl 1,70 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre Le pH de la solution doit être égal à 7,2 b) Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4.7 H2O 22,50 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre c) Chlorure de calcium, anhydre CaCl2 27,50 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre d) Chlorure de fer (III) hexahydraté, FeCl3.6 H2O 0,25 g Dissoudre dans de l'eau et compléter le volume à 1 litre Prélever 3 ml de chacune des solutions a), b) c) et d) et compléter le volume à 1 litre. VII.2.3. Préparation de l'inoculum Recueillir des échantillons frais dans 10 emplacements au moins, principalement dans des zones où divers produits chimiques sont utilisés et rejetés dans l'environnement. Recueillir des échantillons d'un litre de boue, de sols superficiels, d'eau, etc, dans des sites tels que les stations d'épuration des eaux d'égout, les stations d'épuration industrielle, les rivières, les lacs et les mers et bien les mélanger. Après avoir enlevé les matières flottantes, laisser reposer le mélange, puis ajuster le pH du surnageant à 7 ± 1 au moyen d'hydroxyde de sodium ou d'acide phosphorique. Utiliser un volume de surnageant filtré suffisant pour remplir un récipient de traitement des boues activées et aérer le liquide pendant environ 23 heures 30. Trente minutes après avoir interrompu l'aération, retirer environ un tiers du volume total du liquide surnageant et ajouter à la partie décantée un volume égal d'une solution (pH 7) contenant 0,1 % de chacun des produits suivants: glucose, peptone, monophosphate de potassium, puis aérer à nouveau le mélange. Répéter cette opération chaque jour. La réserve de boue doit être préparée selon les bonnes pratiques: l'effluent doit être clair, la température doit être maintenue à 25 ± 2 C, son pH égal à 7 ± 1, la boue doit bien décanter, l'aération doit être suffisante pour que le mélange soit en permanence en aérobiose, des protozoaires doivent être présents et l'activité de la boue doit être testée à l'aide d'une substance de référence au moins tous les trois mois. Ne pas utiliser la boue comme inoculum avant au moins un mois après sa préparation ni après plus de quatre mois. Il convient donc d'effectuer périodiquement des prélèvements d'échantillons, tous les trois mois, en 10 emplacements différents au moins. Afin de conserver la même activité aux boues fraîches et anciennes, le surnageant filtré d'une boue activée utilisée pour l'essai doit être mélangé en volume égal au surnageant filtré d'une boue fraîchement recueillie provenant de dix sources différentes. Le mélange ainsi obtenu est mis en culture comme décrit ci-avant. Prélever la boue pour l'utiliser comme inoculum 18 à 24 heures après cette opération. VII.2.4. Préparation des fioles Préparer les six fioles suivantes: N 1: eau de dilution contenant 100 mg/l de substance à étudier, Nos 2, 3 et 4: milieu minéral contenant 100 mg/l de substance à étudier, N 5: milieu minéral contenant 100 mg/l de produit de référence (par exemple de l'aniline), N 6: milieu minéral seul. Si la substance à étudier est peu soluble, il convient d'en ajouter directement un poids ou un volume défini, ou de procéder selon les instructions figurant à l'annexe III, en n'utilisant toutefois ni solvant ni émulsifiant. Placer l'absorbant de CO2 pour chaque fiole, dans la coupelle spécialement prévue à cet effet. Ajuster à 7,0 le pH de la solution contenue dans les fioles nos 2, 3 et 4. VII.2.5. Déroulement de l'essai Ensemencer les fioles nos 2, 3 et 4 (suspensions d'essai), n 5 (témoin d'activité) et n 6 (blanc contenant l'inoculum) avec un petit volume d'inoculum de manière à ce que la concentration des matières solides en suspension soit égale à 30 mg/l. Ne pas ajouter d'inoculum dans la fiole n 1 qui sert de témoin abiotique. Assembler le matériel, vérifier l'étanchéité à l'air, brancher les agitateurs et commencer à mesurer la consommation d'oxygène dans l'obscurité. Vérifier chaque jour la température et le fonctionnement des agitateurs et de l'enregistreur de l'appareil de mesure coulométrique de la consommation d'oxygène et noter toute modification de couleur du milieu contenu dans les fioles. Lire la consommation d'oxygène dans les six fioles directement avec une méthode appropriée, par exemple sur l'enregistreur à six points, qui fournit une courbe de la DBO. A la fin de l'incubation, dont la durée normale est de 28 jours, mesurer le pH du contenu des fioles et déterminer la concentration résiduelle de la substance à étudier et de toute substance intermédiaire et dans le cas d'une substance hydrosoluble, la concentration de COD (Annexe II.4). Des précautions particulières doivent être prises pour étudier les produits volatiles. Si un processus de nitrification est prévisible, déterminer, si possible, la concentration en nitrates et nitrites. VII.3. PRÉSENTATION DES DONNÉES VII.3.1. Traitement des résultats La quantité d'oxygène consommée (mg) par la substance d'essai après un temps donné, corrigée de façon à tenir compte de la quantité d'O2 consommée dans l'essai à blanc contenant l'inoculum après la même période de temps, est divisée par le poids de substance à étudier utilisé pour l'essai. Le résultat ainsi obtenu correspond à la DBO exprimée en mg d'oxygène/mg de substance d'essai, c'est-à-dire: DBO = mg O2 consom. par la substance d'essai mg O2 consom. par le blancmg de substance d'essai dans la fiole = mg d'O2/mg de substance d'essai. Le pourcentage de biodégradation est alors obtenu à l'aide de la formule suivante: % de biodégradation = % DThO = DBO (mg O2/mg produit) DThO (mg O2/mg produit) × 100 Pour les mélanges, calculer la DThO à partir de l'analyse élémentaire, comme pour un composé simple. Choisir la DThO appropriée (DThONH4 ou DThONO3) selon que la nitrification est absente ou complète (Annexe II.2). Cependant, si la nitrification se produit mais sans toutefois être complète, il convient d'effectuer une correction correspondant à la quantité d'oxygène consommée par la nitrification à partir des modifications de la concentration en nitrites et en nitrates (Annexe V). Calculer le pourcentage de biodégradation primaire à partir de la perte de produit chimique spécifique (d'origine) (voir I.7,2). Dt = Sb SaSb × 100 % Si la mesure de la disparition physico-chimique révèle une perte de produit d'essai dans la fiole n 1, il convient de le consigner et de calculer le pourcentage de biodégradation en utilisant la concentration de substance d'essai (Sb) dans la fiole au bout de 28 jours. Si la concentration de COD est déterminée (facultatif), calculer le pourcentage de biodégradation ultime à l'aide de la formule suivante: Dt = 1 Ct Cbt Co Cbo × 100 % décrite au paragraphe I.7.1. Si la mesure de la disparition physico-chimique révèle une perte de COD dans la fiole n 1, il convient de calculer le pourcentage de dégradation en utilisant la concentration de COD dans cette fiole. Consigner tous les résultats sur les fiches de données fournies. VII.3.2. Validité des résultats La consommation d'oxygène dans l'essai à blanc contenant l'inoculum est normalement comprise entre 20 et 30 mg O2/l et ne doit pas excéder 60 mg/l en 28 jours. Des valeurs supérieures à 60 mg/l nécessitent un examen critique des données et des méthodes expérimentales. Si la valeur du pH se trouve en dehors de l'intervalle compris entre 6 et 8,5 et si la consommation d'oxygène par la substance d'essai est inférieure à 60 %, l'essai doit être répété avec une concentration plus faible de substance à étudier. Voir également I.5.2. Si le pourcentage de dégradation de l'aniline calculé à partir de la consommation d'oxygène ne dépasse pas 40 % après 7 jours et 65 % après 14 jours, l'essai est considéré comme non valable. VII.3.3. Rapport Voir I.8. VII.4. FICHE DE DONNÉES Un exemple de fiche de données est présenté ci-dessous. ESSAI MITI (I) 1. LABORATOIRE 2. DATE DU DÉBUT DE L'ESSAI 3. SUBSTANCE À ÉTUDIER Nom: Concentration de la solution mère: ... mg/l de produit Conc. initiale dans le milieu, Co: ... mg/l de produit Volume du mélange réactionnel, V: ... ml DThO: ... mg O2/l 4. INOCULUM Emplacements d'échantillonnage des boues: 1) ... 2) ... 3) ... 4) ... 5) ... 6) ... 7) ... 8) ... 9) ... 10) ... Concentration des matières en suspension dans la boue activée après acclimatation à l'aide d'une eau d'égout synthétique = mg/l Volume de boue activée par litre de milieu final = ml Concentration de boue dans le milieu final = mg/l 5. CONSOMMATION D'OXYGENE: BIODEGRADABILITE Type de respiromètre utilisé: >EMPLACEMENT TABLE> 6. ANALYSE DE CARBONE (facultative) Analyseur de carbone: ... >EMPLACEMENT TABLE>% COD éliminé: a (b c)a × 100 7. DONNÉES DE L'ANALYSE SPÉCIFIQUE CHIMIQUE >EMPLACEMENT TABLE>% de dégradation = Sb SaSb × 100 Calculer le % de dégradation pour les fioles a1, a2 et a3 respectivement. 8. OBSERVATIONS La courbe de la DBO en fonction du temps doit, le cas échéant, être jointe. ANNEXE I ABRÉVIATIONS ET DÉFINITIONS OD: oxygène dissous (mg/l), c'est-à-dire la concentration d'oxygène dissous dans un échantillon aqueux. DBO: demande biochimique en oxygène (g), soit la quantité d'oxygène consommée par des micro-organismes au moment où ils métabolisent un produit soumis à l'essai; la DBO est également exprimée en g d'oxygène consommé par g de produit à étudier (voir la méthode C.5). DCO: demande chimique d'oxygène (g), c'est-à-dire la quantité d'oxygène consommée au cours de l'oxydation d'un produit à étudier en présence de bichromate acide chaud; la DCO fournit une mesure de la quantité de matière oxydable présente; la DCO est également exprimée en g d'oxygène consommé par g de substance à étudier (voir méthode C.6). COD: carbone organique dissous. Il s'agit du carbone organique présent dans une solution ou qui traverse un filtre d'une porosité de 0,45 micromètre ou encore qui reste dans le surnageant après une centrifugation de 15 min à 40 000 m.s 2 (± 4 000 g). DThO: demande théorique en oxygène (mg), c'est-à-dire la quantité totale d'oxygène nécessaire pour parvenir à l'oxydation complète d'un produit chimique. Elle est calculée à partir de la formule moléculaire (voir annexe II.2). La DThO est également exprimée en mg d'oxygène nécessaire par mg de produit à étudier. CO2Th: dioxyde de carbone théorique (mg). Il s'agit de la quantité calculée de dioxyde de carbone pouvant être produite à partir du contenu en carbone mesuré ou connu dans le produit à étudier, lors de sa minéralisation totale. Le CO2Th est également exprimé en mg de dioxyde de carbone qui se dégage par mg de produit à étudier. COT: carbone organique total. Le COT d'un échantillon est égal à la somme du carbone organique en solution et en suspension. CI: carbone inorganique. CT: carbone total. Le CT est égal à la somme du carbone organique et du carbone inorganique présents dans l'échantillon. Biodégradation primaire: Altération de la structure chimique d'une substance obtenue par une action biologique et entraînant la perte de propriétés spécifiques de cette substance. Biodégradation ultime (en aérobiose): Taux de dégradation atteint lorsque la totalité de la substance à étudier a été utilisée par des micro-organismes pour produire du dioxyde de carbone, de l'eau, des sels minéraux et de nouveaux constituants cellulaires microbiens (biomasse). Facilement biodégradable: Il s'agit d'un classement arbitraire des produits chimiques qui ont répondu positivement à des essais portant sur la biodégradabilité ultime; du fait de la rigueur de ces essais, on suppose que ces composés se dégradent rapidement et complètement en milieu aquatique dans des conditions d'aérobiose. Intrinsèquement biodégradable: Il s'agit d'une classification des produits chimiques dont la biodégradation (primaire ou ultime) a été prouvée sans ambigu¨ uté au cours d'un essai de biodégradabilité reconnu internationalement. Traitabilité: Aptitude des composés à disparaître au cours du traitement biologique des eaux résiduaires sans effet indésirable sur le déroulement normal du traitement. D'une manière générale, les composés facilement biodégradables sont traitables, ce qui n'est pas le cas de tous les composés intrinsèquement biodégradables. Des processus abiotiques peuvent également se produire. Phase de latence correspond à la période qui, au cours d'un essai de disparition, sépare le moment de l'ensemencement de celui où le pourcentage de dégradation a augmenté d'au moins 10 %. La durée de la phase de latence est souvent extrêmement variable et peu reproductible. Phase de dégradation correspond à la période qui commence à la fin de la phase de latence et se termine au moment où 90 % du taux maximal de dégradation a été atteint. Intervalle de 10 jours Il s'agit des 10 jours immédiatement consécutifs au moment où le taux de dégradation atteint 10 %. ANNEXE II CALCUL ET DÉTERMINATION DE PARAMÈTRES APPROPRIÉS Certains paramètres seront requis en fonction de la méthode choisie. Le chapitre suivant décrit le calcul de ces valeurs. L'utilisation de ces paramètres est décrite dans les chapitres consacrés à chaque méthode. 1. Teneur en carbone La teneur en carbone est calculée à partir de la composition élémentaire connue de la substance à étudier, ou déterminée par l'analyse élémentaire de cette substance. 2. Demande théorique en oxygène (DThO) La demande théorique en oxygène (DThO) peut être calculée si la composition élémentaire est connue ou déterminée par analyse élémentaire. Par exemple la DThO du composé suivant: CcHhClclNnNanaOoPpSs sera, en l'absence de nitrification, égale à: DThONH4 = 16 [2 c + 1/2 (h cl 3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o]PM mg/mg et si une nitrification a lieu, elle sera égale à: DThONO3 = 16 [2 c + 1/2 (h cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na o]PM mg/mg 3. Demande chimique en oxygène (DCO) La demande chimique en oxygène (DCO) est déterminée à l'aide de la méthode C.6. 4. Carbone organique dissous (COD) Le carbone organique dissous (COD) est, par définition, le carbone organique présent dans la solution aqueuse d'un produit chimique ou d'un mélange, qui traverse un filtre d'une porosité de 0,45 micromètre. Prélever des échantillons dans les récipients d'essai et les filtrer immédiatement à l'aide d'un dispositif de filtration en utilisant une membrane filtrante appropriée. Les 20 premiers ml de filtrat (la quantité peut être réduite si on utilise des filtres de petite taille) sont éliminés. Un volume de filtrat compris entre 10 et 20 ml, ou moins s'il doit être injecté (le volume dépend de la quantité requise pour l'analyseur de carbone), est retenu afin d'en analyser la teneur en carbone. La concentration en COD est déterminée à l'aide d'un analyseur de carbone organique capable de mesurer avec précision une concentration de carbone égale ou inférieure à 10 % de la concentration initiale de COD utilisée pour l'essai. Les échantillons filtrés qui ne sont pas analysés le jour même peuvent être conservés pendant 48 heures dans un réfrigérateur entre 2 et 4 C ou en-dessous de 18 C pour des périodes plus longues. Remarque: Les membranes filtrantes étant souvent imprégnées d'agents tensio-actifs pour l'hydrophilisation, sont susceptibles de contenir plusieurs milligrammes de carbone organique soluble qui interfèrent avec les déterminations de la biodégradabilité. Pour débarrasser les filtres des agents tensio-actifs ainsi que d'autres composés organiques solubles, il convient de les faire bouillir trois fois pendant une heure dans de l'eau déionisée. Ils peuvent ensuite être conservés dans de l'eau pendant une semaine. Si l'on utilise des cartouches filtrantes à usage unique, chaque lot doit être vérifié afin de s'assurer qu'il ne libère pas de carbone organique soluble. La substance à étudier peut être retenue par adsorption sur certains types de membranes filtrantes. C'est pourquoi il est conseillé de s'assurer que le produit à étudier n'est pas retenu par le filtre. Une centrifugation à 40 000 m.sec 2 (4 000 g) pendant 15 min peut remplacer la filtration pour distinguer le COT du COD. Cette méthode n'est pas fiable si la concentration initiale en COD est inférieure à 10 mg/l, soit parce que toutes les bactéries ne sont pas éliminées, soit parce que du carbone faisant partie intégrante du plasma bactérien est redissous. BIBLIOGRAPHIE - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65. - Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139. - DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 - Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs - und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V. - Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169. ANNEXE III ÉVALUATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ DES SUBSTANCES FAIBLEMENT SOLUBLES Lors des essais de biodégradabilité concernant des substances faiblement solubles, il faut prêter une attention particulière aux éléments énoncés ci-après. Alors que les liquides homogènes posent rarement des problèmes d'échantillonnage, il est recommandé d'homogénéiser les matières solides par des moyens appropriés afin d'éviter les erreurs dues au manque d'homogénéité. Il convient de prendre des précautions particulières pour prélever, dans des mélanges de produits chimiques ou dans des substances riches en impuretés, des échantillons de quelques milligrammes qui soient représentatifs. Différents types d'agitation peuvent être utilisés au cours de l'essai, mais il faut veiller à ce que l'agitation soit juste suffisante pour maintenir la dispersion du produit tout en évitant une surchauffe, la formation excessive de mousse ou des forces de cisaillement excessives. Il est possible d'utiliser un émulsifiant qui produise une dispersion stable du produit. Il ne devra ni être toxique pour les bactéries, ni être biodégradé, ni former de la mousse dans les conditions d'essai. Les mêmes critères s'appliquent aux solvants et aux émulsifiants. Il n'est pas conseillé d'utiliser des supports solides pour les produits solides; leur utilisation peut, par contre, être appropriée dans le cas des substances huileuses. Lorsqu'une substance auxiliaire, telle qu'un émulsifiant, un solvant ou un support, est utilisée, il convient d'effectuer un essai à blanc avec cette substance. Les trois essais de respirométrie, CO2, DBO ou MITI, conviennent pour étudier la biodégradabilité des composés faiblement solubles. BIBLIOGRAPHIE - de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833. - Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169. ANNEXE IV ÉVALUATION DE LA BIODÉGRADABILITÉ DES PRODUITS CHIMIQUES SUSPECTÉS DE TOXICITÉ VIS-À-VIS DE L'INOCULUM Lorsqu'un produit est soumis à des essais de biodégradabilité facile et semble ne pas être biodégradable, il est recommandé de suivre la procédure suivante si l'on souhaite effectuer une distinction entre inhibition et inertie (Reynolds et al., 1987). Il convient de procéder aux essais de toxicité et de biodégradation avec des inoculums semblables ou identiques. Pour évaluer la toxicité des produits soumis aux essais de biodégradabilité facile, il semble approprié d'appliquer soit l'une des méthodes suivantes soit une combinaison de ces méthodes: inhibition du taux de respiration de la boue (essai d'inhibition de la respiration des boues activées - directive 88/302/CEE), DBO, et/ou inhibition de la croissance. S'il convient d'éviter l'inhibition due à la toxicité, il est suggéré d'utiliser pour les essais de biodégradabilité facile des concentrations de la substance d'essai inférieures au 1/10 de la valeur de la CE50 obtenue lors des essais de toxicité (ou inférieures à la valeur de la CE20). Il est peu vraisemblable que les composés dont la CE50 a une valeur supérieure à 300 mg/l produisent un effet toxique lors des tests de biodégradabilité facile. Il est vraisemblable que des valeurs de CE50 inférieures à 20 mg/l poseront de sérieux problèmes lors des essais ultérieurs. Il convient dans ce cas d'employer de faibles concentrations d'essai nécessitant l'utilisation de l'essai en fioles fermées, qui est rigoureux et sensible, ou de produit marqué au 14C. Une autre manière de procéder consiste à utiliser un inoculum acclimaté permettant d'utiliser des concentrations plus élevées de substance d'essai. Toutefois, dans ce cas, on perd le critère spécifique de l'essai de biodégradation facile. BIBLIOGRAPHIE Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259. ANNEXE V CORRECTION TENANT COMPTE DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE DUE À L'INTERFÉRENCE DE LA NITRIFICATION Les erreurs commises en ne tenant pas compte de la nitrification lors de la détermination de la biodégradabilité par mesure de la consommation d'oxygène sont mineures (inférieures à 5 %) lorsque les substances à étudier ne contiennent pas d'azote, même si l'oxydation de l'azote ammoniacal dans le milieu se produit occasionnellement dans les récipients d'essai ainsi que dans les essais à blanc. Par contre, des erreurs importantes peuvent se produire avec les substances qui contiennent de l'azote. Si la nitrification se produit, mais n'est pas complète, la consommation d'oxygène observée dans le mélange réactionnel peut être corrigée d'une valeur correspondant à la quantité d'oxygène utilisée pour oxyder l'ammonium en nitrite et en nitrate, si les modifications de la concentration de nitrite et de nitrate au cours de l'incubation sont déterminées par les équations suivantes: 2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1) 2 HNO2 + O2 = 2 HNO3 (2) Au total: 2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3) D'après l'équation (1), la quantité d'oxygène consommée par l'oxydation de 28 g d'azote contenus dans du chlorure d'ammonium (NH4Cl) pour former des nitrites est égale à 96 g, ce qui correspond à un facteur 3,43 (96/28). De même, d'après l'équation (3), la quantité d'oxygène consommée par l'oxydation de 28 g d'azote pour former des nitrates est de 128 g, ce qui correspond à un facteur 4,57 (128/28). Les réactions étant séquentielles et effectuées par différentes espèces bactériennes distinctes, la concentration en nitrite peut augmenter ou diminuer; dans ce dernier cas, la concentration de nitrate est équivalente. La quantité d'oxygène consommée par la formation de nitrate est donc égale à 4,57 multiplié par l'augmentation de la concentration de nitrate, alors que la quantité d'oxygène associée à la formation de nitrite est égale à 3,43 multiplié par l'augmentation de la concentration en nitrite ou dans le cas d'une réduction de sa teneur, la perte en oxygène est égale à 3,43 multiplié par la diminution de concentration. Ainsi: O2 consommé par la formation de nitrate = 4,57 × augmentation de la concentration de N-nitrate (4), O2 consommé par la formation de nitrite = 3,43 × augmentation de la concentration de N-nitrite (5) et donc O2 perdu lors de la disparition de nitrite = 3,43 × réduction de la concentration de N-nitrite (6) De telle sorte que: la consommation d'O2 due à la nitrification = ± 3,43 × modif. de la conc. de N-nitrite + 4,57 × augm. de la conc. de N-nitrate (7) et donc: la consommation d'O2 due à l'oxydation du C = consommation totale observée consommation due à la nitrification (8). Une autre possibilité consiste à estimer que, si seul l'azote oxydé total est déterminé, la consommation d'oxygène due à la nitrification sera, en première approximation, égale à 4,57 × l'augmentation de la teneur en azote oxydé. La valeur corrigée de la consommation d'oxygène due à l'oxydation du C est ensuite comparée à la DThONH3 calculée selon les instructions figurant à l'annexe II. C.5. DÉGRADATION - DEMANDE BIOCHIMIQUE EN OXYGÈNE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION La méthode a pour objet la mesure de la demande biochimique en oxygène (DBO) de substances organiques, liquides ou solides. Les données fournies par cet essai concernent les composés hydrosolubles; toutefois, les composés volatils et les composés à faible hydrosolubilité peuvent également être étudiés, du moins en principe. La méthode est applicable uniquement aux substances organiques, non inhibitrices vis-à-vis des bactéries à la concentration utilisée au cours de l'essai. Si la substance d'essai n'est pas soluble à la concentration d'essai, des procédures particulières telles que le recours à la dispersion ultrasonique pourraient être utilisées, afin d'obtenir une bonne dispersion de la substance. Des données sur la toxicité de la substance chimique peuvent être utiles pour l'interprétation de résultats faibles et pour le choix de concentrations d'essai appropriées. 1.2. DÉFINITION ET UNITÉS La DBO est définie comme la masse d'oxygène dissoute nécessaire pour assurer, dans des conditions définies, l'oxydation biochimique d'un volume défini d'une solution de la substance soumise aux essais. Les résultats sont exprimés en grammes de DBO par gramme de substance soumise à l'essai. 1.3. SUBSTANCE DE RÉFÉRENCE Il est souhaitable de vérifier l'activité de l'inoculum à l'aide d'une substance de référence appropriée. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Ensemencer avec des micro-organismes et incuber à une température ambiante constante, définie, dans l'obscurité, une quantité prédéterminée de substance, dissoute ou dispersée en milieu aéré approprié. La DBO est déterminée par la différence entre la teneur en oxygène dissous au début et à la fin de l'essai. La durée de l'essai est d'au moins cinq jours et ne dépassera pas 28 jours. Un blanc doit être déterminé dans un essai parallèle ne contenant pas de substance d'essai. 1.5. CRITERES DE QUALITÉ La détermination de la DBO ne peut être considérée comme représentant valablement la biodégradabilité d'une substance et ne constitue qu'un essai de sélection. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI Préparer une solution ou une dispersion préliminaire de la substance, afin d'obtenir une concentration de DBO compatible avec la méthode utilisée. La DBO est alors déterminée par application de toute méthode appropriée, normalisée, nationale ou internationale. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES La DBO contenue dans la solution préliminaire est calculée suivant la méthode normalisée choisie et convertie en grammes de DBO par gramme de substance d'essai. 3. RÉSULTATS La méthode utilisée doit être indiquée. La demande biochimique en oxygène doit être la moyenne d'au moins trois mesures valables. Toutes les données et observations pertinentes aidant à l'interprétation des résultats doivent être consignées, notamment en ce qui concerne les impuretés, l'état physique, les effets toxiques et la composition intrinsèque de la substance susceptibles d'affecter les résultats. L'utilisation de tout additif inhibiteur de la nitrification biologique doit être consignée. 4. RÉFÉRENCES Exemples de méthodes normalisées: NF T 90-103: Détermination de la demande biochimique en oxygène. NBN 407: Biochemical oxygen demand. NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV). The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London. ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days. C.6. DÉGRADATION - DEMANDE CHIMIQUE EN OXYGÈNE 1. MÉTHODE 1.1. INTRODUCTION La méthode a pour objet la mesure de la demande chimique en oxygène (DCO) de substances organiques, liquides ou solides, par application de tout mode opératoire normalisé, dans des conditions de laboratoire déterminées. Le fait de disposer de données sur la formule de la substance facilitera la réalisation de cet essai ainsi que l'interprétation des résultats obtenus (par exemple, sels halogénés, sels ferreux de composés organiques, composés organochlorés). 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS La demande chimique en oxygène est la mesure de l'oxydabilité d'une substance, définie comme la quantité d'oxygène d'un réactif oxydant, consommée par la substance dans des conditions de laboratoire déterminées. Le résultat est exprimé en grammes de DCO par gramme de substance d'essai. 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE L'emploi de substances de référence n'est pas requis dans tous les cas où l'on analyse une nouvelle substance. Ces substances de référence doivent permettre d'étalonner périodiquement la méthode et de permettre la comparaison des résultats en cas d'application de méthodes différentes. 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE D'ESSAI Une quantité déterminée de substance dissoute ou dispersée dans de l'eau est oxydée à l'aide de bichromate de potassium en présence d'acide sulfurique concentré (le catalyseur étant du sulfate d'argent) à reflux pendant deux heures. Le bichromate résiduel est dosé par titration à l'aide de sulfate ferreux ammoniacal titré. Au cas où les substances contiennent du chlore, ajouter du sulfate mercurique (*) pour réduire l'interférence des chlorures. 1.5. CRITÈRE DE QUALITÉ En raison des conditions arbitraires de détermination de la DCO, cette dernière est un «indicateur d'oxydabilité» à utiliser en tant que tel comme méthode pratique de mesure de matière organique. Les chlorures peuvent interférer au cours de cet essai; des substances inorganiques réductrices ou oxydantes peuvent également interférer avec la détermination de la DCO. Certains composés cycliques et un grand nombre de produits volatils (par exemple les acides gras inférieurs) ne sont pas totalement oxydés lors de l'essai. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE D'ESSAI Préparer une solution ou une dispersion préliminaire de la substance pour obtenir une DCO de 250 à 600 milligrammes par litre. Remarque: Dans le cas des substances peu solubles et non dispersables, peser une quantité de substance finement pulvérisée ou à l'état liquide, correspondant à environ 5 milligrammes de DCO, et l'introduire dans l'appareil d'expérimentation avec addition d'eau. Il est souvent avantageux, en particulier lorsqu'on a affaire à des substances peu solubles, de déterminer la demande chimique en oxygène (DCO) à l'aide d'une variante de la méthode, c'est-à-dire dans un système clos muni d'un régulateur de pression (H. Kelkenberg, 1975). Cette modification permet souvent de parvenir à quantifier des substances qui le sont difficilement en utilisant la méthode classique - par exemple l'acide acétique. Toutefois cette méthode échoue elle aussi dans le cas de la pyridine. Le fait d'augmenter jusqu'à une valeur 0,25 N (0,0416 M) la concentration de bichromate de potassium prescrite dans la référence (1) facilite la pesée directe d'une quantité de substance comprise entre 5 et 10 mg, ce qui est essentiel pour déterminer la DCO de substances faiblement hydrosolubles (réf. 2). Dans les autres cas, déterminer la DCO en suivant toute méthode normalisée nationale ou internationale. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES Calculer la DCO contenue dans le flacon expérimental, suivant la méthode normalisée choisie, et convertir en grammes de DCO par gramme de substance d'essai. (*) (Afin d'éviter la dissémination de mercure dans l'environnement, les solutions contenant des sels de mercure doivent être traitées après utilisation.) 3. RÉSULTATS La méthode de référence utilisée doit être indiquée. La demande chimique en oxygène sera la moyenne d'au moins trois mesures. Il sera fait état de toutes données et observations présentant de l'intérêt pour l'interprétation des résultats, notamment en ce qui concerne les impuretés, l'état physique et les propriétés spécifiques de la substance (si elles sont connues) susceptibles d'affecter les résultats. Mentionner si l'on a fait usage de sulfate mercurique pour réduire l'interférence des chlorures. 4. RÉFÉRENCES 1) Kelkenberg, H. .Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146. 2) Gerike, P. . The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169. Exemples de méthodes normalisées: NBN T 91-201 Determination of the chemical oxyden demand. ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters. NF T 90-101 Détermination de la demande chimique en oxygène. DS 217 = water Determination of the chemical oxyden demand. analysis DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxyden demand (COD) within the range above 15 mg per litre. NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik. ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods. C.7. DÉGRADATION ABIOTIQUE - HYDROLYSE EN FONCTION DU pH 1. MÉTHODE La méthode décrite est basée sur les lignes directrices de l'OCDE (1). 1.1. INTRODUCTION L'hydrolyse est une réaction importante contrôlant la dégradation abiotique. Cette réaction est particulièrement adaptée aux substances peu biodégradables et elle peut faire varier la persistance d'une substance dans l'environnement. La plupart des réactions d'hydrolyse sont de pseudo-premier ordre et c'est pourquoi les temps de demi-vie sont indépendants de la concentration. Cela permet habituellement d'extrapoler les résultats obtenus à des concentrations de laboratoire aux conditions de l'environnement. De plus, plusieurs exemples ont été cités (2), montrant un accord satisfaisant entre les résultats trouvés dans l'eau pure et l'eau naturelle, pour plusieurs types de produits chimiques. Il est utile, pour réaliser cet essai, de disposer de données préliminaires sur la tension de vapeur de la substance. Cette méthode n'est aplicable qu'aux substances hydrosolubles. Les impuretés peuvent influencer les résultats. Le comportement hydrolytique des substances chimiques devrait être étudié à des valeurs de pH habituellement rencontrées dans l'environnement (pH 4 à 9). 1.2. DÉFINITIONS ET UNITÉS L'hydrolyse se rapporte à la réaction d'un produit chimique RX avec l'eau. Cette réaction peut être représentée par un échange caractéristique du radical X avec OH: RX + HOH . ROH + HX [1] La vitesse à laquelle la concentration de RX décroît est donné par la relation: vitesse = k [H2O] [RX] [2] Du fait que l'eau est en grand excès par rapport à la substance chimique, ce type de réaction est habituellement décrit comme étant une réaction de pseudo-premier ordre au cours de laquelle la constante de vitesse observée est donnée par la relation: kobs = k [H20] [3] Cette constante peut être déterminée pour une valeur de pH et une température T, en utilisant l'expression: kobs = 2.303t × log CoCt[4] où: t = temps, C0 = concentration de la substance au temps 0, Ct = concentration de la substance au temps t, 2,303 = facteur de conversion des logarithmes népériens en logarithmes décimaux. Les concentrations sont exprimées en g/l ou en mole/l. L'unité de la constante kobs est le (temps) 1 Le temps de demi-vie, t1-2 , est défini comme le temps nécessaire pour réduire de 50 % la concentration de la substance chimique à tester, c'est-à-dire: Ct = 1-2 . C0 [5] A partir des expressions [4] et [5], on peut démontrer que; t1-2 = 0,693/kobs [6] 1.3. SUBSTANCES DE RÉFÉRENCE Il n'est pas nécessaire d'utiliser des substances de référence dans tous les cas lorsque l'on étudie une nouvelle substance. Elles devraient servir essentiellement à contrôler de temps à autre l'efficacité de la méthode et à permettre la comparaison des résultats lorsqu'une autre méthode est utilisée. Les substances suivantes ont été utilisées comme substance de référence (1): Acide acétylsalicylique (aspirine) 0,0-diéthyl 0-2 isopropyl-4-méthyl-6 pyrimidyl thiophosphate (Dimpylate, Diazinon). 1.4. PRINCIPE DE LA MÉTHODE La substance est dissoute dans l'eau à une faible concentration; le pH et la température sont contrôlés. La diminution de la concentration de la substance au cours du temps est suivie à l'aide de toute procédure analytique appropriée. Les logarithmes des concentrations de la substance au cours du temps sont reportés sur un graphique et, si cela donne une droite, la constante de vitesse de premier ordre peut être obtenue à partir de la pente de la droite (voir point 2). Lorsqu'il n'est pas possible de déterminer directement une constante de vitesse pour une température particulière, il est normalement possible d'estimer la valeur de cette constante à l'aide de la relation d'Arrhenius, qui donne la dépendance de la constante de vitesse par rapport à la température. La droite du logarithme de la constante de vitesse telle que déterminée à température appropriée en fonction de l'inverse de la température absolue (k), permet d'extrapoler la valeur de la constante de vitesse qu'il n'était pas possible d'obtenir directement. 1.5. CRITÈRES DE QUALITÉ La référence (2) rapporte que des mesures de constante de vitesse d'hydrolyse pour 13 classes de structures organiques peuvent être d'une grande précision. La répétabilité dépend, en particulier, du contrôle du pH et de la température et peut être influencée par la présence de micro-organismes et, dans certains cas, par la concentration en oxygène dissous. 1.6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE 1.6.1. Réactifs 1.6.1.1. Solutions tampons Le test est effectué à trois valeurs de pH: 4,0, 7,0 et 9,0. A cette fin, des solutions tampon doivent être préparées en utilisant des réactifs chimiques de pureté analytique et de l'eau distillée ou déionisée stérile. Quelques exemples de solutions tampon sont présentés dans l'annexe. La solution tampon utilisée peut influencer la vitesse d'hydrolyse; si cela s'avère être le cas, une autre solution tampon doit être utilisée. L'utilisation de tampons borate ou acétate est recommandée dans la référence (2) au lieu des phosphates. Si la valeur du pH des solutions tampon est inconnue à la température de l'essai, elle doit être déterminée à l'aide d'un pH-mètre calibré à la température choisie avec une précision de ± 0,1 unité de pH. 1.6.1.2. Solutions d'essai La substance d'essai doit être dissoute dans le tampon choisi et la concentration ne doit pas dépasser 0,01 M ou la moitié de la concentration de saturation (la plus faible des deux). L'utilisation des solvants organiques miscibles dans l'eau est seulement recommandée pour des substances ayant une faible solubilité dans l'eau. La quantité du solvant doit être inférieure à 1 % et ne doit pas interférer avec le processus hydrolytique. 1.6.2. Appareillage Des fioles fermées en verre doivent être employées, mais l'utilisation de graisse sur les rodages est à éviter. Si la substance ou le tampon utilisé est volatil, ou si l'essai est mené à haute température, on préférera des tubes scellés ou fermés et remplis le plus complètement possible. 1.6.3. Méthode analytique La méthode utilisée doit être spécifique pour permettre de déterminer la substance à étudier aux concentrations utilisées au cours de l'essai et peut combiner quelques méthodes analytiques appropriées. La méthode analytique dépendra de la nature de la substance et doit être suffisamment précise et sensible pour détecter une diminution de 10 % de la concentration initiale. 1.6.4. Conditions de l'essai Les essais seront menés en utilisant une enceinte thermostatique contrôlée ou un bain à température constante fixée à ± 0,5 C de la température choisie. La température sera maintenue et mesurée avec une précision de ± 0,1 C. Les interférences photolytiques devront être évitées par des moyens appropriés. Pour les substances facilement oxydables, il sera nécessaire d'éliminer l'oxygène dissous (par exemple par barbotage d'azote ou d'argon pendant 5 minutes avant de préparer les solutions). 1.6.5. Procédure d'essai Essai préliminaire Pour toutes les substances, un essai préliminaire doit être conduit à 50 C ± 0,5 C à 3 valeurs de pH: 4,0, 7,0 et 9,0. On effectuera un nombre de mesures suffisantes, de façon à pouvoir estimer si, pour chaque valeur de pH et à 50 C, le temps de demi-vie (t1-2) est inférieur à 2,4 heures ou si moins de 10 % d'hydrolyse est observé après 5 jours (on peut estimer que ces valeurs correspondent respectivement à des temps de demi-vie inférieurs à 1 jour ou supérieurs à 1 an dans des conditions plus représentatives de celles de l'environnement (25 C).) Si l'essai préliminaire montre que 50 % de la substance d'essai ou plus ont été hydrolysés en 2,4 heures à 50 C, ou que moins de 10 % ont été hydrolysés après 5 jours pour chaque valeur de pH (4, 7 et 9), il est inutile de poursuivre les essais. Dans d'autres cas, et pour des valeurs de pH pour lesquelles ces conditions n'ont pas été remplies, l'essai n 1 est effectué. 1.6.5.2. Essai 1 L'essai 1 est mené à une température unique, de préférence à 50 C ± 0,5 C, si possible dans des conditions stériles, aux valeurs de pH pour lesquelles les essais préliminaires ont montré le besoin d'essais supplémentaires. Un nombre suffisant d'échantillons (pas moins de 4) devra être choisi afin de couvrir un intervalle de 20 à 70 % d'hydrolyse pour déterminer le comportement de pseudo-premier ordre aux valeurs de pH spécifiques. Pour chaque valeur de pH pour laquelle l'essai 1 a été effectué, l'ordre de la réaction est déterminé. Estimation de la constante de vitesse à 25 C: La décision du choix de procédé expérimental dépend du fait qu'il est possible de conclure de l'essai 1 que la réaction est ou n'est pas de pseudo-premier ordre. S'il n'est pas possible de conclure avec certitude au cours de l'essai 1 que la réaction est de pseudo-premier ordre, les expériences doivent être poursuivies, telles qu'elles sont décrites dans l'essai 2. Si la détermination du pseudo-premier ordre de l'essai 1 est fiable, les expériences doivent être poursuivies selon la description de l'essai 3 [ou bien, il est possible, dans certaines circonstances, de calculer la constante de vitesse à 25 C à partir des constantes déterminées à 50 C, calculées en utilisant les résultats de l'essai 1 (voir point 3.2)]. 1.6.5.3. Essai 2 Cet essai est effectué pour chaque pH pour lequel il a été établi dans l'essai 1 qu'il était nécessaire de poursuivre les expériences: - soit à une température choisie, inférieure à 40 C, - soit à deux températures, supérieures à 50 C, ayant entre elles un écart d'au moins 10 C. Pour chaque valeur de pH et de température pour lesquelles l'essai 2 est effectué, au moins six points espacés de manière appropriée sont mesurés de telle sorte que les pourcentages d'hydrolyse se trouvent dans l'intervalle compris entre 20 et 70 %. Pour une valeur de pH et une température, une double détermination est effectuée. Lorsque l'essai 2 est pratiqué à deux températures supérieures à 50 C, la double détermination est effectuée de préférence à la plus basse des deux températures. Pour chaque valeur de pH et de température pour lesquelles l'essai 2 est effectué, une estimation graphique du temps de demi-vie (t1-2) sera donnée, lorsque cela est possible. 1.6.5.4. Essai 3 Cet essai est effectué pour chaque valeur de pH pour laquelle les résultats de l'essai 1 en ont montré la nécessité: - soit à une température inférieure à 40 C, - soit à deux températures, supérieures à 50 C et espacées d'au moins 10 C. Pour chaque valeur de pH et de température pour lesquelles l'essai 3 est effectué, trois points de détermination sont choisis, le premier au temps 0 et les deuxième et troisième lorsque les pourcentages d'hydrolyse sont supérieurs à 30 %; la valeur de la constante kobs ainsi que la valeur de t1-2 doivent être calculés. 2. ÉVALUATION DES DONNÉES Dans le cas d'un comportement de pseudo-premier ordre, les valeurs de kobs pour chaque valeur de pH et chaque température des essais peuvent être obtenues à partir du graphique des logarithmes des concentrations en fonction du temps, en utilisant l'expression: kobs = pente × 2,303 [7] De plus, t1-2 peut être calculé selon l'équation [6]. Estimer k25 C en appliquant l'équation d'Arrhénius, s'il y a lieu. Dans le cas où le comportement n'est pas de pseudo-premier ordre, voir point 3.1. 3. RÉSULTATS 3.1. PROCÈS-VERBAL D'ESSAI Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants: - les spécifications de la substance, - tout résultat obtenu avec des substances de référence, - le principe et la description détaillée de la méthode analytique utilisée; - pour chaque essai: la température, la valeur du pH, la composition du tampon et un tableau rassemblant tous les points expérimentaux concentration-temps, - dans le cas des réactions de pseudo-premier ordre, les valeurs de Kobs, de t1-2 ainsi que leur méthode de calcul, - dans le cas d'une réaction qui n'est pas de pseudo-premier ordre, établir le graphique des logarithmes des concentrations en fonction du temps, - toute information et observation nécessaires à l'interprétation des résultats. 3.2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Il est parfois possible de calculer des valeurs acceptables de la constante de vitesse (à 25 C) de substances d'essai, à condition que les valeurs d'énergie d'activation pour des homologues de la substance chimique existent déjà et pour autant qu'il puisse être raisonnablement estimé que l'énergie d'activation de la substance d'essai soit du même ordre de grandeur. 4. RÉFÉRENCES (1) OCDE, Paris, 1981, Ligne directrice n 111, Décision du Conseil C(81) 30 final. (2) W. Mabey and T. Mill, «Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions,» J. Phys, Chem. Ref., 1978, Data 7 vol. (2), 383-415. Annexe Mélanges tampons A. CLARK ET LUBS Les valeurs de pH indiquées dans ce tableau ont été calculées à partir de mesures potentielles utilisant les équations standard de Sörensen. Les valeurs réelles de pH sont de 0,04 unité plus élevées que les valeurs du tableau. Composition pH 0,1 M de phtalate de potassium hydrogène + 0,1 N HCl à 20 C 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml de phtalate, compléter à 100 ml 3,8 0,1 M de phtalate de potassium hydrogène + 0,1 N NaOH à 20 C 0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de phtalate, compléter à 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de phtalate, compléter à 100 ml 4,2 0,1 M de phosphate monopotassique + 0,1 N NaOH à 20 C 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de phosphate, compléter à 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de phosphate, compléter à 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de phosphate, compléter à 100 ml 7,2 0,1 M H3BO3 dans 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH à 20 C 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml d'acide borique, compléter à 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml d'acide borique, compléter à 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml d'acide borique, compléter à 100 ml 9,2 B. KOLTHOFF ET VLEESCHOUER Composition pH 0,1 M de citrate monopotassique et 0,1 N NaOH à 18 C (ajouter un petit cristal de thymol pour éviter la croissance des moisissures) 2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de citrate, compléter à 100 ml 3,8 9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de citrate, compléter à 100 ml 4,0 16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml de citrate, compléter à 100 ml 4,2 C. SÖRENSEN 0,05 M borax + 0,1 N HCl >EMPLACEMENT TABLE> 0,05 M borax + 0,1 N NaOH >EMPLACEMENT TABLE> Fin du document Document livré le: 11/03/1999

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