Législation communautaire en vigueur Document 392D0532 Chapitres du répertoire où le document peut être trouvé: [ 03.50.30 - Secteur vétérinaire et zootechnique ] 392D0532 92/532/CEE: Décision de la Commission, du 19 novembre 1992, fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la décision et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons Journal officiel n° L 337 du 21/11/1992 p. 0018 - 0027 Edition spéciale finnoise ...: Chapitre 3 Tome 46 p. 19 Edition spéciale suédoise ...: Chapitre 3 Tome 46 p. 19 Modifications: Modifié par 396D0240 (JO L 079 29.03.1996 p.19) Voir 301D0183 (JO L 067 09.03.2001 p.65) Texte: DÉCISION DE LA COMMISSION du 19 novembre 1992 fixant les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de certaines maladies des poissons (92/532/CEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu la directive 91/67/CEE du Conseil, du 28 janvier 1991, relative aux conditions de police sanitaire régissant la mise sur le marché d'animaux et de produits d'aquaculture (1), et notamment son article 15, considérant que, selon l'article 15 de ladite directive, il convient de fixer les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic à utiliser pour la détection et la confirmation de la présence de maladies de poissons; considérant que le comité scientifique vétérinaire institué par la décision 81/651/CEE de la Commission (2) a été consulté; considérant que les mesures prévues à la présente décision sont conformes à l'avis du comité vétérinaire permanent, A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION: Article premier Les plans d'échantillonnage et les méthodes de diagnostic pour la détection et la confirmation de la présence de la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) et de la septicémie hémorragique virale (SHV) sont fixés en annexe. Article 2 Les États membres sont destinataires de la présente décision. Fait à Bruxelles, le 19 novembre 1992. Par la Commission Ray MAC SHARRY Membre de la Commission (1) JO no L 46 du 19. 2. 1991, p. 1. (2) JO no L 233 du 19. 8. 1981, p. 32. ANNEXE PREMIÈRE PARTIE PROCÉDURES D'ÉCHANTILLONNAGE ET DE DIAGNOSTIC POUR LA SURVEILLANCE DE LA SHV ET DE LA NHI I. Échantillonnage 1. Période de l'échantillonnage Les exploitations font l'objet d'une inspection clinique au moins deux fois par an au cours de la période octobre-juin ou à n'importe quel moment où la température de l'eau est inférieure à 14 °C. Les intervalles entre les inspections doivent être d'au moins quatre mois. Toutes les unités de production (étangs, cuves, aquariums, cages, etc.) sont soumises à une inspection destinée à établir la présence de poissons morts, faibles ou au comportement anormal. Une attention particulière doit être accordée au point d'évacuation des eaux (si cela est faisable) où les poissons faibles ont tendance à s'accumuler en raison du courant. 2. Sélection et collecte des échantillons Il est collecté aux fins d'examen, en liaison avec les inspections visées au tableau 1 A, des échantillons composés de 30 à 150 poissons et/ou liquides ovariens. Si des truites arc-en-ciel sont présentes, les poissons de cette espèce devraient entrer dans la composition de l'échantillon. Si tel n'est pas le cas, l'échantillon doit contenir des poissons de toutes les autres espèces présentes dans la mesure où ces espèces sont sensibles à la SHV et/ou à la NHI (définies à l'annexe A de la directive 91/67/CEE concernant les conditions de santé animale régissant la mise sur le marché des animaux et des produits de l'aquaculture). Les espèces doivent être représentées de manière égale dans l'échantillon. Au cours de la période de contrôle initiale de quatre ans qui précède l'agrément, l'échantillon est composé de 150 unités, de manière à garantir une détection ayant une fiabilité de 95 % des virus dont la prévalence est de 2 %. Au cours des années ultérieures (maintien de l'agrément), la taille de l'échantillon peut être ramenée à 30 unités pour garantir une détection ayant un taux de fiabilité de 95 % des virus dont la prévalence est de 10 % (tableau 1 B). Dans les exploitations qui peuvent prouver qu'elles sont depuis longtemps indemnes de SHV et de NHI (sur la base d'un programme régulier d'inspections sanitaires officielles), l'échantillon à taille réduite peut être utilisé également au cours de la période initiale de contrôle de quatre ans. Si on utilise, pour la production du poisson, plus d'une source d'eau, les poissons représentant toutes les sources d'eau peuvent être inclus dans l'échantillon contenant 150 ou 30 poissons. Si des poissons faibles, au comportement anormal ou qui viennent de mourir (pas encore décomposés) sont présents, ils doivent être inclus en premier lieu dans l'échantillon. Si ces poissons ne sont pas présents, l'échantillon doit être composé de poissons en bonne santé, à l'aspect normal, collectés de telle manière que toutes les parties de l'exploitation ainsi que toutes les classes d'âge par année soient représentées dans l'échantillon. 3. Préparation et envoi des échantillons de poissons Avant d'être envoyés ou transférés vers le laboratoire, les morceaux d'organes à examiner sont prélevés sur le poisson à l'aide de ciseaux ou d'autres instruments stériles et placés dans les tubes en plastique contenant le milieu de transport, c'est-à-dire du milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau et d'antibiotiques. La combinaison de 200 UI de pénicilline, 200 mg de streptomycine et 200 mg de kanamycine par ml peut être recommandée mais d'autres antibiotiques à l'efficacité éprouvée peuvent également être utilisés. Les tissus à examiner sont la rate, le rein antérieur, l'encéphale et, dans certains cas, le liquide ovarien (tableaux 1 A et 1 B). Des morceaux d'organes de 5 à 10 poissons (tableaux 1 A et 1 B) peuvent être réunis dans un tube, représentant un échantillon global. Les tissus de chaque échantillon doivent peser au moins 1 g, de manière que la dilution finale soit d'environ 1/10. Les tubes sont placés dans des récipients isolés (par exemple des boîtes en polystyrène à parois épaisses) avec une quantité suffisante de glace ou de « blocs congelés » pour garantir une température des échantillons comprise entre 0 et 5 °C pendant le transport vers le laboratoire. Éviter le gel des échantillons. L'examen virologique doit commencer dès que possible, au plus tard 48 heures après la collecte des échantillons. Si les poissons à examiner mesurent moins de 6 cm de longueur, ils peuvent être envoyés entiers vers le laboratoire dans des sachets en plastique réfrigérés comme indiqué ci-dessus. 4. Collecte de matériel diagnostic supplémentaire Conformément à l'accord conclu avec le laboratoire de diagnostic en cause, d'autres tissus de poissons peuvent être collectés également et préparés en vue d'examens supplémentaires. II. Préparation des échantillons en vue de l'examen virologique 1. Homogénéisation des organes Au laboratoire, les tissus contenus dans les tubes doivent être complètement homogénéisés (soit à l'aide d'un broyeur stomacher, d'un mixeur ou d'un ensemble pilon-mortier) et placés ensuite en suspension dans le milieu de transport original. Si un échantillon est constitué de poissons entiers, c'est-à-dire de poissons de moins de 6 cm, ceux-ci sont réduits en fines particules à l'aide de ciseaux stériles après élimination de la partie du corps se situant à l'arrière de l'ouverture ventrale, homogénéisés conformément à la méthode décrite ci-dessus et mis en suspension dans le milieu de transport selon la proportion de 1/10. 2. Centrifugation de l'homogénat L'homogénat est centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à 2 °C-5 °C à 2 000-4 000 × g pendant 15 minutes et le liquide surnageant est collecté aux fins d'examen. Si l'envoi de l'échantillon s'est fait dans un milieu de transport (c'est-à-dire sous antibiotiques), le liquide surnageant ne doit plus être traité aux antibiotiques. Si l'échantillon a été envoyé sous forme de poissons entiers, l'homogénat obtenu après centrifugation doit être traité aux antibiotiques dans le milieu de transport utilisé pour sa remise en suspension soit pendant quatre heures à la température ambiante soit pendant une nuit à 4 °C. Le traitement aux antibiotiques vise à maîtriser la contamination bactérienne des échantillons et rend superflue toute filtration à travers des filtres à membranes. Immédiatement après la centrifugation, mélanger un volume de liquide surnageant avec des parts égales d'un antisérum divalent contre le virus NPI (souches de référence Sp et Ab), dilué de façon appropriée, et incuber ainsi pendant au minimum une heure à 15 °C ou au maximum pendant 18 heures à 4 °C. Le titre de l'antisérum doit être d'au moins 1/2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %. Le traitement de tous les inocula à l'antisérum contre le virus NPI (virus qui, dans certaines régions d'Europe, est présent dans 50 % des échantillons de poissons) vise à empêcher le développement, dans des cultures cellulaires inoculées, de ECP résultant du virus NPI. Cela réduira la durée des examens virologiques ainsi que le nombre des cas dans lesquels l'apparition de ECP devrait être considérée comme une indication potentielle de SHV ou de NHI. Lorsque des échantillons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de NPI, le traitement des inocula à l'antisérum contre le virus NPI peut être omis. III. Examen virologique 1. Cultures cellulaires et milieux Des cellules BF-2 et, soit EPC, soit FHM sont cultivées à des températures de 20 à 25 °C dans un milieu Eagle's MEM (ou des versions modifiées), additionné de 10 % de sérum de foetus de bovin et d'antibiotiques à des concentrations standard. Lorsque les cellules sont cultivées dans des fioles fermées, tamponner le milieu à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture de cellules en unités ouvertes doit être tamponné à l'aide de Tris-HCl (23 mM) et de bicarbonate de soude (6 mM) à un pH aussi proche que possible de 7,6, valeur optimale pour la multiplication virale. Les cultures de cellules à utiliser pour l'inoculation avec du matériel tissulaire devraient être jeunes (de 4 à 48 heures) et en phase de croissance active (non confluentes) au moment de l'inoculation. 2. Inoculation des cultures cellulaires Inoculer une suspension d'organes traitée aux antibiotiques dans des cultures cellulaires en deux dilutions: la première et, en outre, une dilution de celle-ci à 1/100 (de manière à éviter des interférences par homologie). Deux lignes de cellules au moins doivent être inoculées (cf. III.1). Le rapport entre la taille de l'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire devrait être d'environ 1/10. Pour chaque dilution et chaque ligne de cellules, il y a lieu d'utiliser un minimum d'environ 2 cm2 de cellules, ce qui correspond à une cupule dans un plateau de culture cellulaire à 24 cupules. L'utilisation de plateaux de culture cellulaire est recommandée mais d'autres supports présentant une surface de croissance similaire ou supérieure peuvent également convenir. 3. Incubation des cultures cellulaires Incuber les cultures cellulaires inoculées à 15 °C pendant sept jours. Si la couleur du milieu de culture cellulaire vire du rouge au jaune, indiquant une acidification du milieu, ajuster le pH à l'aide d'une solution stérile de bicarbonate ou à l'aide de substances équivalentes pour garantir la sensibilité de la cellule à l'infection virale. Effectuer tous les six mois le titrage des stocks congelés de virus SHV et NHI afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection. 4. Microscopie Inspecter chaque jour les cultures cellulaires inoculées afin de déceler la formation de ECP à un grossissement d'environ 40 fois. Si on observe nettement l'apparition de ECP, engager immédiatement les procédures d'identification du virus conformément à la section IV. En même temps, prendre les mesures appropriées pour suspendre l'agrément de l'unité de production d'où provient l'échantillon positif au virus et de toute unité de production située en aval. Maintenir la suspension de l'agrément jusqu'à ce que les tests de laboratoire aient confirmé que le virus en cause n'est pas le virus de SHV ou de NHI. Le délai autorisé pour l'identification du virus est de quatre semaines au maximum, y compris le temps nécessaire pour procéder à l'analyse dans les laboratoires de référence. 5. Sous-culture S'il ne s'est pas développé de ECP après une incubation de sept jours, procéder à une sous-culture portant sur des cultures cellulaires fraîches en utilisant une superficie cellulaire similaire à celle de la culture primaire. Des parties aliquotes du milieu provenant de toutes les cultures/cupules constituant la culture primaire sont groupées selon la souche cellulaire à la suite d'un cycle de congélation et de décongélation des cultures et 0,5 ml du milieu est mélangé à des parts égales d'antisérum contre la NPI comme décrit à la section II.2 et le mélange est incubé à 15 °C pendant 60 minutes. Le mélange est ensuite inoculé dans des cultures cellulaires homologues à des dilutions de 1/1 et de 1/100 conformément à la section III.2. L'inoculation peut être précédée d'une préincubation de toutes les dilutions avec de l'antisérum divalent contre le virus NPI à une dilution appropriée. Incuber ensuite les cultures inoculées pendant sept jours à 15 °C compte tenu des dispositions de la section III.4. IV. Identification du virus 1. Neutralisation Si, dans une culture cellulaire, la formation de ECP a été constatée, le milieu est collecté, les cellules sont éliminées par centrifugation à faible vitesse ou par filtration sur filtre à membrane (0,45 mm) puis le milieu est dilué à 1/100 et 1/10 000 dans un milieu de culture cellulaire. Mélanger des parties aliquotes des dilutions et les incuber séparément pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs suivants: - anticorps spécifique contre le virus de la SHV (virus d'Egtved) 1/50 * - anticorps spécifique contre les infections du virus de la nécrose hématopoïétique (NHI) 1/50 * - antisérum divalent contre le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI) (souches de référence Sp et Ab 1/50 * - milieu de culture 1/1 * ou comme précisé par le laboratoire de référence en ce qui concerne l'éventuelle cytotoxicité des antisérums. Les réactifs utilisés doivent être de qualité de référence en ce qui concerne le titre et la spécificité. Inoculer au moins deux cultures cellulaires avec 50 ml chacune de mélange de virus et de sérum et incuber à 15 °C. Contrôler le développement de ECP conformément à la section III.4. Si le test n'a pas permis d'identifier avec certitude le virus en l'espace d'une semaine, procéder à une des opérations suivantes: a) transférer le virus vers un laboratoire de référence national spécialisé dans les virus des poissons à des fins d'identification immédiate; b) appliquer les techniques IFAT (section IV.2), ELISA (section IV.3) ou d'autres techniques d'identification des virus à l'aide de réactifs de qualité de référence. 2. Immunofluorescence (IFAT) Pour chaque isolat de virus à identifier, ensemencer au moins huit couvre-objets ou l'équivalent à l'aide de cellules ECP à une densité engendrant une confluence d'environ 60 à 90 % après 24 heures de culture. Choisir les cellules ECP à cette fin à cause de leur forte adhérence aux surfaces de verre. Lorsque les cellules sont déposées sur la surface du verre (environ 1 heure après l'ensemencement) ou lorsque les cultures ont été incubées pendant 24 heures au maximum, inoculer le virus à identifier. Inoculer quatre cultures suivant le rapport de volume à volume de 1/10 et quatre cultures suivant le rapport de 1/100. Entre 20 et 30 heures après l'inoculation, rincer les cultures deux fois à l'aide du produit Eagle's MEM sans sérum, fixer à l'acétone et teinter par IFAT à deux couches. La première couche de réactif consiste en un antisérum agréé (comme dans la section IV.1). La seconde couche de réactif est un antisérum conjugué avec FITC contre l'immunoglobuline utilisée dans la première couche. Pour chacun des antisérums testés, teinter au moins une culture inoculée à dose élevée et une cultre inoculée à faible dose. Inclure dans le test des témoins négatifs et positifs appropriés. Monter les cultures teintées en utilisant une solution glycérol-eau salée. Examiner aux ultraviolets incidents. Utiliser des oculaires 10 × ou 12 × et des lentilles d'objectif × 25 ou × 40 dotées d'ouvertures numériques > 0,7 et > 1,3 respectivement. Les dilutions de l'antisérum primaire et de l'immunoglobuline conjugée au FITC dépendront du système de microscopie, choisi ou disponible. Certaines souches du virus Egtved réagissent fortement avec l'antisérum contre la souche de référence F1 à l'IFAT bien que ne réagissant pas dans des tests de neutralisation. 3. Test ELISA Recouvrir les cupules des plaques microtitres (par exemple, immunoplaques Nunc, Maxisorp, Nunc, Danemark) pendant une nuit avec les dilutions recommandées de fractions d'immunoglobuline purifiée à la protéine A des antisérums mentionnés à la section IV.1. Après rinçage des cupules à l'aide d'un tampon PBS-Tween-20, introduire le virus à identifier dans les cupules en deux ou quatre dilutions et laisser opérer la réaction avec l'anticorps de couverture pendant 60 minutes à 37 °C. Après rinçage à l'aide du tampon PBS-Tween-20, ajouter les anticorps traités au biotinyle, d'une spécificité correspondant à celle des anticorps de couverture et laisser agir pendant 60 minutes à une température de 20 °C. Après un nouveau rinçage comme ci-dessus, ajouter de la streptavidine conjugée avec HRP et laisser réagir pendant 1 heure à 20 °C. Après un dernier rinçage, l'enzyme liée est visualisée à l'aide de substrats ELISA appropriés (OPD, TMB ou autres). La variante ELISA ci-dessus, basée sur la biotine et l'avidine, est donnée à titre d'exemple. D'autres variantes ELISA d'une efficacité éprouvée peuvent être utilisées à la place. Tableau 1 A Obtention de l'agrément Nombre annuel d'inspections cliniques Nombre de poissons dont les organes sont examinés Nombre de poissons dont le liquide ovarien est examiné Zones continentales a) Exploitations comptant des géniteurs 2 120 (1re série) 150 (2e série) 30 (1re série) 0 b) Exploitations ne comptant que des géniteurs 2 0 150 (1re ou 2e série) c) Exploitations ne comptant pas de géniteurs 2 150 (1re et 2e séries) 0 Zones côtières a) Exploitations ne comptant pas de géniteurs 2 30 (1re et 2e séries) 0 b) Exploitations comptant des géniteurs 2 120 (1re série) 150 (2e série) 30 (1re série) 0 Nombre maximal de poissons par bassin: 5 Tableau 1 B Maintien du statut Nombre d'inspections cliniques par an Nombre de poissons soumis à un examen des organes Nombre de poissons soumis à un examen du liquide ovarien Zones continentales a) Exploitations comptant des géniteurs 2 15 (1re ou 2e série) 15 (1re ou 2e série) b) Exploitations ne comptant que des géniteurs 2 0 30 (1re ou 2e série) c) Exploitations ne comptant pas de géniteurs 2 30 (1re ou 2e série) 0 Zones côtières a) Exploitations ne comptant pas de géniteurs 1 30 (1) (1re ou 2e série) 0 b) Exploitations comptant des géniteurs 2 0 30 (1re ou 2e série) Nombre maximal de poissons par groupe: 10 (1) Les échantillons doivent être collectés au cours des mois 2 à 6 après le transfert des poissons de l'eau douce vers l'eau salée. DEUXIÈME PARTIE PROCÉDURES DE DIAGNOSTIC PERMETTANT DE CONFIRMER LA NHI ET LA SHV EN CAS DE SUSPICION Le diagnostic de la NHI et de la SHV peut être réalisé par l'une des techniques suivantes: - A. Isolation conventionnelle du virus suivie d'une identification sérologique du virus, - B. Isolation du virus avec identification sérologique simultanée du virus, - C. Techniques de diagnostic rapide (IFAT, ELISA). Le premier diagnostic de la NHI et de la SHV dans les exploitations situées dans les zones agréées ne doit pas être basé sur la méthode C seule. Soit la méthode A, soit la méthode B doit également être appliquée. Le tissu destiné à l'examen virologique peut dans certains cas être accompagné de matériel supplémentaire en vue d'un examen bactériologique, parasitologique, histologique ou autre afin de permettre un diagnostic différentiel. Ce matériel devrait être collecté conformément aux procédures définies par l'OIE. A. Isolation conventionnelle du virus suivie d'une identification sérologique du virus A.I.1. Sélection des échantillons Il y a lieu de sélectionner aux fins d'examen au moins 10 poissons présentant des signes typiques de NHI ou de SHV. A.I.2. Préparation et envoi des échantillons de poissons Avant d'être envoyés ou transférés vers le laboratoire, les morceaux d'organes à examiner sont prélevés sur le poisson à l'aide de ciseaux ou d'autres instruments stériles et placés dans les tubes en plastique contenant le milieu de transport, c'est-à-dire du milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau et d'antibiotiques. La combinaison de 200 UI de pénicilline, 200 mg de streptomycine et 200 mg de kanamycine par ml peut être recommandée, mais d'autres antibiotiques à l'efficacité éprouvée peuvent également être utilisés. Les tissus à examiner sont la rate, le rein antérieur et l'encéphale. Des morceaux d'organes de 5 à 10 poissons peuvent être réunis dans un tube, représentant un échantillon global. Les tissus de chaque échantillon devraient peser au moins 1 g, de manière que la dilution finale soit d'environ 1/10. Les tubes sont placés dans des récipients isolés (par exemple, des boîtes en polystyrène à parois épaisses) avec une quantité suffisante de glace ou de « blocs congelés » pour garantir une température des échantillons comprise entre 0 et 5 °C pendant le transport vers le laboratoire. Éviter le gel des échantillons. L'examen virologique doit commencer dès que possible, au plus tard 48 heures après la collecte des échantillons. Si les poissons à examiner mesurent moins de 6 cm de longueur, ils peuvent être envoyés entiers vers le laboratoire dans des sachets en plastique réfrigérés comme indiqué ci-dessus. A.I.3. Collecte de matériel diagnostic supplémentaire Conformément à l'accord conclu avec le laboratoire de diagnostic en cause, d'autres tissus de poissons peuvent être collectés également et préparés en vue d'examens supplémentaires. A.II.1. Homogénéisation des organes Au laboratoire, les tissus contenus dans les tubes doivent être complètement homogénéisés (broyeur stomacher, mixeur ou ensemble pilon-mortier) et placés ensuite en suspension dans le milieu de transport original. Si un échantillon est constitué de poissons entiers, c'est-à-dire de poissons de moins de 6 cm, ceux-ci sont réduits en fines particules à l'aide de ciseaux stériles après élimination de la partie du corps se situant à l'arrière de l'ouverture ventrale, homogénisés conformément à la méthode décrite ci-dessus et mis en suspension dans le milieu de transport selon la proportion de 1/10. A.II.2. Centrifugation de l'homogénat L'homogénat est centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à 2-5 °C à 2 000-4 000 × g pendant 15 minutes et le liquide surnageant est collecté à des fins d'examen. Si l'envoi de l'échantillon s'est fait dans un milieu de transport (c'est-à-dire sous antibiotiques), le liquide surnageant ne doit plus être traité aux antibiotiques. Si l'échantillon a été envoyé sous forme de poissons entiers, l'homogénat obtenu après centrifugation doit être traité aux antibiotiques dans le milieu de transport utilisé pour sa remise en suspension, soit pendant 4 heures à la température ambiante, soit pendant une nuit à 4 °C. Le traitement aux antibiotiques vise à maîtriser la contamination bactérienne des échantillons et rend superflue toute filtration à travers des filtres à membranes. Immédiatement après la centrifugation, mélanger un volume de liquide surnageant avec des parts égales d'un antisérum divalent contre le virus NPI (souches de référence Sp et Ab) dilué de façon appropriée et incuber ainsi pendant au minimum 1 heure à 15 °C ou au maximum pendant 18 heures à 4 °C. Le titre de l'antisérum doit être d'au moins 1/2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %. Le traitement de tous les inocula à l'antisérum contre le virus NPI (virus qui, dans certaines régions d'Europe, est présent dans 50 % des échantillons de poissons) vise à empêcher le développement, dans des cultures cellulaires inoculées, de ECP résultant du virus NPI. Cela réduira la durée des examens virologiques ainsi que le nombre des cas dans lesquels l'apparition de ECP devrait être considérée comme une indication potentielle de SHV ou de NHI. Lorsque des échantillons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de NPI, le traitement des inocula à l'antisérum contre le virus NPI peut être omis. A.III.1. Cultures cellulaires et milieux Des cellules BF-2 et, soit EPC, soit FHM sont cultivées à des températures de 20 à 25 °C dans un milieu Eagle's MEM (ou des versions modifiées), additionnées de 10 % de sérum de foetus de bovins et d'antibiotiques à des concentrations standard. Lorsque les cellules sont cultivées dans des fioles fermées, tamponner le milieu à l'aide de bicarbonate. Le milieu utilisé pour la culture de cellules en unités ouvertes doit être tamponné à l'aide de Tris-HCl (23 mM) et de bicarbonate de soude (6 mM) à un pH aussi proche que possible de 7,6, valeur optimale pour la multiplication virale. Les cultures de cellules à utiliser pour l'inoculation avec du matériel tissulaire devraient être jeunes (de 4 à 48 heures) et en phase de croissance active (non confluentes) au moment de l'inoculation. A.III.2. Inoculation des cultures cellulaires Inoculer une suspension d'organes traitée aux antibiotiques dans des cultures cellulaires en deux dilutions: la première et, en outre, une dilution de celle-ci à 1/100 (de manière à prévenir toute interférence par homologie). Deux lignes de cellules au moins doivent être inoculées (cf. A.III.1). Le rapport entre la taille de l'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire devrait être d'environ 1/10. Pour chaque dilution et chaque ligne de cellules, il y a lieu d'utiliser un minimum d'environ 2 cm2 de cellules, ce qui correspond à une cupule dans un plateau de culture cellulaire à 24 cupules. L'utilisation de plateaux de culture cellulaire est recommandée, mais d'autres supports présentant une surface de croissance similaire ou supérieure peuvent également convenir. A.III.3. Incubation des cultures cellulaires Incuber les cultures cellulaires inoculées à 15 °C pendant sept jours. Si la couleur du milieu de culture cellulaire vire du rouge au jaune, indiquant une acidification du milieu, ajuster le pH à l'aide d'une solution stérile de bicarbonate ou à l'aide de substances équivalentes, pour garantir la sensibilité de la cellule à l'infection virale. Effectuer tous les six mois le titrage des stocks congelés de virus SHV et NHI afin de vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection. A.III.4. Microscopie Inspecter chaque jour les cultures cellulaires inoculées afin de déceler la formation de ECP à un grossissement d'environ 40 fois. Si on observe nettement l'apparition de ECP, engager immédiatement les procédures d'identification du virus conformément à la section A.IV. En même temps, prendre les mesures appropriées pour suspendre l'agrément de l'unité de production d'où provient l'échantillon positif des virus et de toute unité de production située en aval. Maintenir la suspension de l'agrément jusqu'à ce que les tests de laboratoire aient confirmé que le virus en cause n'est pas le virus de SHV ou de NHI. Le délai autorisé pour l'identification du virus est de quatre semaines au maximum, y compris le temps nécessaire pour procéder à l'analyse dans les laboratoires de référence. A.III.5. Sous-culture S'il ne s'est pas développé de ECP après une incubation de sept jours, procéder à une sous-culture portant sur des cultures cellulaires fraîches en utilisant une superficie cellulaire similaire à celle de la culture primaire. Des parties aliquotes du milieu provenant de toutes les cultures/cupules constituant la culture primaire sont groupées selon la souche cellulaire à la suite d'un cycle de congélation et de décongélation des cultures et 0,5 ml du milieu est mélangé à des parts égales d'antisérum contre la NPI, comme décrit à la section A.II.2 et le mélange est incubé à 15 °C pendant 60 minutes. Le mélange est ensuite inoculé dans des cultures cellulaires à des dilutions de 1/1 et de 1/100 conformément à la section A.III.2. L'inoculation peut être précédée d'une pré-incubation de toutes les dilutions avec de l'antisérum divalent contre le virus NPI à une dilution appropriée. Incuber ensuite les cultures inoculées pendant sept jours à 15 °C compte tenu des dispositions de la section A.III.4. A.IV.1. Neutralisation Si, dans une culture cellulaire, la formation de ECP a été constatée, le milieu est collecté, les cellules sont éliminées par centrifugation à faible vitesse ou par filtration sur filtre à membrane (0,45 mm) puis le milieu est dilué à 1/100 et 1/10 000 dans un milieu de culture cellulaire. Mélanger des parties aliquotes des dilutions et les incuber séparément pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs suivants: - anticorps spécifique contre le virus de la SHV (virus d'Egtved) 1/50 * - anticorps spécifique contre les infections du virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) 1/50 * - antisérum divalent contre le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI) (souches de référence Sp et Ab) 1/50 * - milieu de culture 1/1 * ou comme précisé par le laboratoire de référence en ce qui concerne l'éventuelle cytotoxicité des antisérums. Les réactifs utilisés doivent être de qualité de référence en ce qui concerne le titre et la spécificité. Inoculer au moins deux cultures cellulaires avec 50 ml chacune de mélange de virus et de sérum et incuber à 15 °C. Contrôler le développement de ECP conformément à la section A.III.4. Si le test n'a pas permis d'identifier avec certitude le virus en l'espace d'une semaine, procéder à une des opérations suivantes: a) transférer le virus vers un laboratoire de référence nationale spécialisé dans les virus des poissons à des fins d'identification immédiate; b) appliquer les techniques IFAT (section A.IV.2), ELISA (section A.IV.3) ou d'autres techniques d'identification des virus à l'aide de réactifs de qualité de référence. A.IV.2. Immunofluorescence (IFAT) Pour chaque isolat de virus à identifier, ensemencer au moins huit couvre-objets ou l'équivalent à l'aide de cellules ECP à une densité engendrant une confluence d'environ 60 à 90 % après 24 heures de culture. Choisir les cellules ECP à cette fin à cause de leur forte adhérence aux surfaces de verre. Lorsque les cellules sont déposées sur la surface du verre (environ 1 heure après l'ensemencement) ou lorsque les cultures ont été incubées pendant 24 heures au maximum, inoculer le virus à identifier. Inoculer quatre cultures suivant le rapport de volume à volume de 1/10 et quatre cultures suivant le rapport de 1/100. Entre 20 et 30 heures après l'inoculation, rincer les cultures deux fois à l'aide du produit Eagle's MEM sans sérum, fixer à l'acétone et teinter par IFAT à deux couches. La première couche de réactif consiste en un antisérum agréé (comme dans la section IV.1). La seconde couche de réactif est un antisérum conjugué avec FITC contre l'immunoglobuline utilisée dans la première couche. Pour chacun des antisérums testés, teinter au moins une culture inoculée à dose élevée et une culture inoculée à faible dose. Inclure dans le test des témoins négatifs et positifs appropriés. Monter les cultures teintées en utilisant une solution glycérol-eau salée. Examiner aux rayons ultraviolets incidents. Utiliser des oculaires 10 × ou 12 × et des lentilles d'objectif × 25 ou × 40 ayant des ouvertures numériques supérieures à 0,7 et à 1,3 respectivement. Les dilutions de l'antisérum primaire et de l'immunoglobuline conjuguée au FITC dépendront du système de microscopie choisi ou disponible. Certaines souches du virus Egtved réagissent fortement avec l'antisérum contre la souche de référence F1 à l'IFAT, bien que ne réagissant pas dans des tests de neutralisation. A.IV.3. Test ELISA Recouvrir les cupules des plaques microtitres (par exemple immunoplaques Nunc, Maxisorp, Nunc, Danemark) pendant une nuit avec les dilutions recommandées de fractions d'immunoglobuline purifiée à la protéine A des antisérums mentionnés à la section A.IV.1. Après rinçage des cupules à l'aide d'un tampon PBS-Tween-20, introduire le virus à identifier dans les cupules en deux ou quatre dilutions et laisser opérer la réaction avec l'anticorps de couverture pendant 60 minutes à 37 °C. Après rinçage à l'aide du tampon PBS-Tween-20, ajouter les anticorps traités au biotinyle, d'une spécificité correspondant à celle des anticorps de couverture et laisser agir pendant 60 minutes à 20 °C. Après un nouveau rinçage comme ci-dessus, ajouter de la streptavidine conjuguée avec HRP et laisser réagir pendant 1 heure à 20 °C. Après un dernier rinçage, l'enzyme liée est visualisée à l'aide de substrats ELISA appropriés (OPD, TMB ou autres). La variante ELISA ci-dessus, basée sur l'emploi de biotine et d'avidine, est donnée à titre d'exemple. D'autres variantes ELISA, d'une efficacité éprouvée, peuvent être utilisées à la place. B. Isolation du virus avec identification sérologique simultanée du virus B.I.1. Sélection des échantillons Voir A.I.1. B.I.2. Préparation et expédition des échantillons de poisson Voir A.I.2. B.II.1. Homogénéisation des organes Voir A.II.1. B.II.2. Centrifugation de l'homogénat Voir A.II.2. B.II.3. Traitement du liquide surnageant à l'aide des antisérums de diagnostic La suspension comportant l'organe traité contre la NPI et l'antibiotique est dilué à 1/10 et à 1/10 000 dans un milieu de culture cellulaire et des parties aliquotes sont mélangées et incubées pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs énumérés à la section A.IV.1. B.III.1. Cultures cellulaires et milieux Voir A.III.1. B.III.2. Inoculation des cultures cellulaires À partir de chaque mélange virus-sérum (préparé conformément à B.II.3.), inoculer au moins deux cultures cellulaires par ligne de cellules avec 50 ml chacune. B.III.3. Incubation des cultures cellulaires Voir A.III.3. B.III.4. Microscopie Inspecter quotidiennement les cultures de cellules inoculées afin de déceler la formation de ECP à un grossissement d'environ 40 fois. Si la formation de ECP est empêchée par un des antisérums utilisés, le virus peut être considéré comme ayant été identifié en conséquence. Si la formation de ECP n'est pas empêchée par ces antisérums, il y a lieu de mettre en oeuvre les procédures d'identification du virus conformément à A.IV. B.III.5. Sous-culture Si on ne constate pas de formation de ECP après sept jours, une sous-culture doit être mise en oeuvre à partir des cultures inoculées avec le liquide surnageant plus le milieu (B.II.3). C. Techniques de diagnostic rapide (IFAT, ELISA) Le liquide surnageant préparé comme indiqué sous A.II.2 est soumis à IFAT ou à ELISA conformément à A.IV.2 ou A.IV.3 respectivement. Ces techniques rapides doivent être complétées avec un examen virologique conformément à A ou B moins de 48 heures après l'échantillonage si: a) un résultat négatif a été obtenu ou b) un résultat positif a été obtenu avec des échantillons représentant le premier cas de NHI ou SHV dans une zone agréée. Fin du document Document livré le: 11/03/1999

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